Summary
Cette méthode démontre l’utilisation de la technique d’hybridation nordique pour détecter les miARN à partir de l’extrait total d’ARN.
Abstract
Les microARN (miARN) sont une classe de petites ARN non codantes, ~21 nt petites impliquées dans la régulation de l’expression génique chez les plantes et les animaux. La plupart des miARN agissent comme des commutateurs négatifs de l’expression génique ciblant les gènes clés. Dans les plantes, les transcriptions des miARN primaires (pri-miARN) sont générées par l’ARN polymérase II, et elles forment des longueurs variables de structures stables en boucle de tige appelées pré-miARN. Une endonuclease, dicer-like1, traite les pré-miARN en duplex miRNA-miRNA*. L’un des brins du duplex miRNA-miRNA* est sélectionné et chargé sur la protéine Argonaute 1 ou ses homologues pour monner le clivage des ARNm cibles. Bien que les miARN soient des molécules de signalisation clés, leur détection est souvent effectuée par des méthodes pcr moins qu’optimales au lieu d’une analyse sensible des taches nordiques. Nous décrivons une méthode nordique simple, fiable et extrêmement sensible qui est idéale pour la quantification des niveaux de miARN avec une sensibilité très élevée, littéralement à partir de n’importe quel tissu végétal. En outre, cette méthode peut être utilisée pour confirmer la taille, la stabilité et l’abondance des miARN et de leurs précurseurs.
Introduction
La découverte récente de petits ARN réglementaires, les microARN, a mené des recherches pour les comprendre et leur rôle dans les plantes et les animaux1. Les précurseurs longs des miARN sont transformés en miARN matures de 21 à 24 nt par HYL1 et des protéines spécifiques en forme de dicer2,3. Un 22 nt miRNA peut initier le silençage en cascade en générant des siRNA secondaires4. Des études ont montré le rôle des miARN et des siARN secondaires dans le développement, le destin cellulaire et les réponses au stress5,6.
L’hybridation nordique est une méthode expérimentale couramment utilisée pour détecter des molécules d’ARN spécifiques. Cette méthode personnalise son utilisation dans la détection d’environ 19 -24 nt longs petits ARN à partir d’un pool d’ARN totaux7. Dans cette démonstration, nous illustrons l’utilisation de cette technique pour la détection et la quantification des miARN. Cette méthode utilise l’étiquetage des sondes à l’aide de radioisotopes; ainsi, les niveaux de miARN dans l’échantillon peuvent être détectés avec une sensibilité accrue. Contrairement aux méthodes basées sur pcr, cette méthode assure la quantification de l’expression ainsi que la détermination de la taille des miARN. Dans ce protocole, nous montrons des étapes cruciales qui améliorent la détection de miRNA. Nous avons modifié les étapes de la blotting et de l’hybridation pour obtenir la détection de signaux à haute résolution des miARN. Cette technique peut également être utilisée pour la détection d’autres petits ARN endogènes tels que les siARN, les ARN tasi-secondaires et les arns snoARN.
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Protocol
1. Préparation d’un gel polyacrylamide de 15 %
- Peser et ajouter 4,8 g d’urée, ajouter 3,75 ml d’acrylamide à 40 % : solution de bisacrylamide (19:1) et 1 mL de 10 x TBE pH 8,2 dans un tube stérile de 50 mL.
- Dissoudre l’urée à l’aide d’un bain d’eau réglé à 60 °C dans une solution claire.
- Maquillage du volume à 10 mL à l’aide d’eau stérile fraîchement autoclaved et refroidir le mélange de gel à la température ambiante.
- Préparer une solution fraîche de persulfate d’ammonium à 10 % (w/v).
2. Assemblage des plaques de verre et de l’unité d’électrophorèse
- Laver tout l’appareil nécessaire pour l’électrophorèse de gel et l’électro-blotting avec du détergent. Frottez-les doucement à l’aide d’une éponge molle pour enlever le tampon résiduel et l’acrylamide, rincez à l’eau et laissez-les sécher.
- Assembler les deux plaques de verre ensemble et les placer fermement sur l’éponge. Utilisez une plaque de 1 mm d’épaisseur pour cette configuration. Assurez-vous que les plaques sont au même niveau pour éviter les fuites.
- Pour le mélange de gel de 10 mL, ajouter 8 μL de TEMED et 80 μL de solution de persulfate d’ammonium fraîchement préparée 10 % (w/v).
- Sans tarder, mélangez délicatement et versez-le entre les plaques de verre assemblées. Placez soigneusement le peigne. Évitez de générer des bulles d’air à cette étape.
- Laisser le gel se polymériser pendant environ 45 min.
- Laver le gel polymérisé avec de l’eau stérile avant de placer à l’intérieur de la configuration de gel-running.
- Assemblez les plaques à l’intérieur de la cassette en cours d’exécution et retirez le peigne doucement.
- Verser 1x TBE stériles fraîchement préparés, pH 8,2 dans le réservoir.
- Lavez soigneusement les puits en canalisant le tampon pour enlever les cristaux de sel. Cette étape aide l’échantillon d’ARN à courir uniformément à travers le gel.
- Effectuer une pré-course à 80 V pendant 30 min.
3. Préparation du colorant de chargement et des échantillons
- Pour 10 mL de colorant de chargement de gel, peser 5 mg de bleu bromophénol, 5 mg de cyanol de xylène, ajouter 10 mL de formamide déionisé soigneusement et bien les mélanger.
- Aliquot 10 μg d’ARN total dans un tube stérile de 1,5 mL et sécher les échantillons à l’aide d’un speedvac. Ne pas trop sécher les échantillons.
- Resuspendez les échantillons d’ARN dans 8 μL de chargement.
- Chauffer les échantillons à 98 °C pendant 2 min, laisser refroidir pendant 1 min à RT, vortex et faire tourner les échantillons, pendant 3 fois. Cette étape est essentielle pour une resuspension appropriée et à son tour cela contribue à une charge égale des échantillons.
4. Électrophorèse de gel
- Arrêter la pré-course et laver les puits avant le chargement de l’échantillon.
- Chauffer les échantillons à 98 °C pendant 1 min et charger les échantillons à chaud dans le puits à l’aide de pointes capillaires. Insérez la pointe au fond du puits, de sorte que l’échantillon occupe une couche mince dans le puits.
- Chargement complet de tous les échantillons. Inclure pour charger le marqueur de décennie d’ARN.
- Exécuter le gel à 80 V jusqu’à ce que le colorant bleu bromophénol fonctionne presque complètement. Le bleu bromophénol fonctionne à 10 pb dans un gel d’acrylamide de 15%.
5. Préparation à l’électro-blotting
- Coupez la membrane N+nylon aux dimensions de la plaque de verre et étiquetez la membrane à son coin supérieur droit avec un crayon HB.
- Placez doucement la membrane à la surface de l’eau stérile, face au côté étiqueté vers la surface de l’eau. Pré-tremper la membrane pendant 15 min.
- Coupez 4 morceaux de papier blotting I aux dimensions de la fibre pad.
- Préparer le sandwich au gel pour placer le côté gris de la cassette dans un plateau propre.
- Pré-mouiller le tampon de fibres et le placer sur la cassette. Enlever les bulles d’air.
- Pré-mouiller un morceau de papier blotting en 1x TBE et placer sur le tampon de fibre. Retirer les bulles d’air en roulant une pipette en plastique sur le papier. Déposer un autre morceau de papier blotting pré-humide et enlever les bulles d’air.
- Retirez soigneusement le gel de la cassette en cours d’exécution et placez-le sur la configuration du sandwich, de sorte que le premier échantillon d’ARN chargé est vers la droite.
- Tremper délicatement la membrane pré-trempée dans 1x TBE et la placer sur le gel, face au côté étiqueté vers le bas. Rouler pour enlever les bulles d’air.
- Trempez un morceau de papier blotting, posez-le sur la membrane et retirez les bulles d’air. Trempez un autre morceau de papier blotting, placez-le sur la configuration de sandwich et retirez les bulles d’air.
- Complétez le sandwich en plaçant un tampon de fibres pré-humides sur la configuration et fermez fermement la cassette.
- Placez la cassette transblot dans le module et remplissez 1x TBE, pH 8.2 jusqu’à la marque de ballonnement.
- Transfert à 10 V, nuit à 4 °C.
- Après transfert, placez la membrane humide sur une feuille de papier et croisez immédiatement l’ARN à la membrane par irradiation avec une lumière UV de 254 nm (120 000 μjoules/cm²). La tache croisée peut être stockée à 4 °C pour une hybridation ultérieure.
6. Préparation de la sonde radiolabeled
- Concevoir une sonde complètement complémentaire au petit ARN qui doit être détectée.
- Terminer l’étiquette de la sonde en utilisant ƳP32ATP (obtenu de BRIT) à son extrémité de 5' en combinant les composants selon la recette fournie dans le tableau 1.
- Incuber le mélange de réaction ci-dessus à 37 °C pendant 30 min.
- Séparer les ƳP32ATP de la sonde en utilisant une colonne Sephadex G-25 selon le protocole du fabricant.
7. Hybridation de la tache
- Placez la tache croisée, côté ARN face à l’intérieur d’une bouteille d’hybridation.
- Mélanger vigoureusement le tampon d’hybridation ultra-sensible, ajouter 10 mL de celui-ci et incuber la tache à l’intérieur d’un four d’hybridation maintenu à 35 °C, avec rotation.
- Effectuer la pré-hybridation pendant 20 min.
- Retirez la bouteille du four et ajoutez doucement la sonde étiquetée dans le tampon d’hybridation.
- Hybrider la tache à 35 °C, avec rotation pendant 12 h.
- Après hybridation, transférer soigneusement la solution d’hybridation dans un tube de 15 mL. Cette solution peut être stockée à 4 °C jusqu’à la réutilisation.
- Effectuez un lavage rapide de la tache pendant 2 min pour éliminer la solution d’hybridation excédentaire en ajoutant la mémoire tampon SSC 2x plus 0,5 % de SDS. Jetez la solution.
- Incuber la tache avec un tampon SSC 2x plus 0,5% de SDS pour 35 °C, avec rotation pendant 30 min.
- Laver la tache à nouveau avec 0,5 x tampon SSC plus 0,5% SDS pour 35°C, avec rotation pendant 30 min.
- Placez la tache à l’intérieur d’un couvercle d’hybridation, retirez l’excès de tampon et scellez-la.
- Exposez-le à un écran d’imageur de rayonnement sans phosphore pendant la nuit à l’intérieur d’une cassette.
- Détecter le signal d’hybridation à l’aide d’un imageur biomoléculaire et analyser les résultats à l’aide d’un logiciel approprié.
- Dénudez la tache en l’incuber à 80 °C, avec rotation pendant 30 min avec tampon SSC de 0,5 X plus 0,1 % de SDS et tampon SSC 0,1 X plus 0,1 % SDS pendant 30 min.
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Representative Results
Dans cette démonstration, nous avons détecté et quantifié l’expression de miR397 dans différents tissus de riz indica var whiteponni (Figure 1). miR397 est un miRNA de 22 nt et miRNA conservé. L’expression de miR397 peut être détectée dans tous les échantillons testés. Selon les données de séquençage de prochaine génération, l’échantillon 1 (tissu de semis) a miR397 à 5 lectures par million (tr/min). Nous avons détecté son signal confortablement, indiquant que la méthode est très sensible et peut être utilisé pour détecter même les miARN abondantes très faibles. Dans cette expérience, nous avons utilisé miR168 et U6 comme commandes de chargement.
Dans cette tache (Figure 1), la force des signaux a été quantifiée à l’aide d’ImageJ. L’expression de miR397 est la plus élevée dans la gaine végétale de feuille.
Figure 1 : Détection et quantification de l’expression de miR397 dans différents tissus d’échantillons de riz. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Tampon et solution | Recette | Commentaires |
| 10 X TBE | Tampon Tris 0.89M | le pH doit être réglé à 8.2 à l’aide d’acide acétique |
| 0,89 M d’acide borique | ||
| 30mM EDTA | ||
| Mélange de gel | 15% acrylamide-bisacrylamide sol, 19:1 | Le mélange de gel ne doit pas contenir de cristaux d’urée |
| Urée 8M | ||
| 1X TBE | ||
| Colorant de chargement de gel | 0,05 %(w/v) bleu bromophénol | Il faut faire attention lors de la manipulation du formamide déionisé |
| 0,05 %(w/v) Xylène xyanol | ||
| 100 % de formamide déionisé | ||
| Étiquetage de la sonde | Tampon PNK (10X, 2 μL) | Ce mélange contient des molécules radioactives, cette étape doit être effectuée par personel formé à l’intérieur d’un laboratoire radioactif |
| Enzyme PNK (1 μL) | ||
| Oligo (100 μM, 0,1 μL) | ||
| ƳP32 ATP (4 μL) | ||
| Tampon de lavage - I | 2X SSC | |
| 0,5 % (w/v) SDS | ||
| Tampon de lavage - II | SSC 0.5X | |
| 0,5 % (w/v) SDS | ||
| Tampon de décapage - I | SSC 0.5X | |
| 0,1 % (w/v) SDS | ||
| Tampon de décapage - II | 0.1X SSC | |
| 0,1 % (w/v) SDS |
Tableau 1 : Tableau des recettes.
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Discussion
Cette méthode peut être largement utilisée pour la détection et la quantification de petits ARN, y compris les miARN moins abondants. Le protocole décrit principalement les étapes de dénaturation de l’ARN total dans un tampon de chargement, la séparation de taille par électrophorèse de gel, le transfert de l’ARN à une membrane, le lien croisé de l’ARN sur la membrane et l’hybridation à l’aide de sondes oligo parés radiolabeled souhaitées.
L’étape critique pour toute expérience de blotting est l’utilisation d’ARN de bonne qualité pour la préparation de l’échantillon. Avant de charger les gels, il faut s’assurer que les échantillons coulent librement et ne collent pas aux pointes de chargement. Il faut faire attention pendant le chargement de l’échantillon, la pointe doit être insérée juste au-dessus du fond du puits afin que l’échantillon occupe une couche mince dans le puits. La température du four d’hybridation doit être maintenue à 35 °C pour la détection des miARN qui sont extrêmement moins abondantes. Pour l’hybridation répétée de la tache, rangez la membrane à 4 °C en la maintenant humide dans 2x SSC.
Cette méthode peut être utilisée pour détecter les petits ARN à partir de tissus riches en polysaccharides et polyphénols8. Dans ce protocole, l’utilisation du séchage sous vide pour concentrer les échantillons d’ARN offre une meilleure stabilité et moins de perte d’échantillon par rapport à d’autres méthodes plus anciennes9. D’autres modifications de la méthode comprennent, la propagation de la membrane dans l’eau avant de tremper dans 1x TBE lors de l’électro-transfert. Cela améliore l’efficacité du transfert d’ARN, offrant une meilleure résolution de tache.
L’utilisation des radioisotopes, qui a besoin d’un personnel qualifié et d’un laboratoire de radioisotopes, est une limitation majeure de la méthode. Cette méthode fournit ici des informations détaillées sur toutes les étapes impliquées dans l’analyse des taches d’ARN pour la détection des miARN. Ce protocole assure également la taille du petit ARN en dehors de sa détection de signal10. La technique fournit un outil robuste pour les biologistes moléculaires pour estimer l’abondance de divers petits ARN tels que les miARN, les siARN secondaires et les arnas.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent l’accès au laboratoire de rayonnement fourni par l’institut hôte et BRIT pour les radioisotopes. Le laboratoire PVS est soutenu par le National Center for Biological Sciences, le Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) du Department of Biotechnology, Gouvernement de l’Inde. Mp reconnaît DBT-Research Associateship, DBT, Gouvernement de l’Inde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
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- Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
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- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
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- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
