Summary
Мы создали условия для культуры нейронных клеток-предшественников из субвентрикулярной зоны и зубной извилины взрослого мозга прерий voles, в качестве дополнительного исследования in vitro, для анализа секс-зависимых различий между нейрогенными нишами, которые могут быть частью функциональных пластиковых изменений, связанных с социальным поведением.
Abstract
Нейросферы являются первичными клеточными агрегатами, которые состоят из нервных стволовых клеток и клеток-предшественников. Эти 3D структуры являются отличным инструментом для определения дифференциации и распространения потенциала нервных стволовых клеток, а также для создания клеточных линий, чем можно повести с течением времени. Кроме того, нейросферы могут создать нишу (in vitro), что позволяет моделирование динамических меняющихся условиях, таких как различные факторы роста, гормоны, нейротрансмиттеры, среди других. Микротус охрогастер (prairie vole) является уникальной моделью для понимания нейробиологической основы социально-сексуального поведения и социального познания. Тем не менее, клеточные механизмы, участвующие в этом поведении, не очень хорошо известны. Протокол направлен на получение нейронных клеток-предшественников из нейрогенных ниш взрослой прерии vole, которые культурироваться в условиях неприятеля, для создания нейросфер. Размер и количество нейросфер зависят от региона (субвентрикулярной зоны или зубной извилины) и пола прерии vole. Этот метод является замечательным инструментом для изучения секс-зависимых различий в нейрогенных нишах in vitro и нейропластичных изменений, связанных с социальным поведением, таким как парная связь и двухпарадный уход. Кроме того, когнитивные условия, которые влечет за собой дефицит в социальных взаимодействий (расстройства аутистического спектра и шизофрении) могут быть рассмотрены.
Introduction
Прерии vole (Microtus ochrogaster), член семьи Cricetidae, является небольшое млекопитающее, чья жизненная стратегия развивается как социально моногамный и весьма общительный вид. Как самцы, так и самки устанавливают прочную парную связь после спаривания или длительных периодов сожительства, характеризующихся разделением гнезда, защитой своей территории и проявлением двухродногоухода за потомством 1,2,3,4. Таким образом, прерии vole является ценной моделью для понимания нейробиологической основы социально-сексуального поведения и нарушений в социальном познании5.
Взрослый нейрогенез является одним из наиболее важных процессов нервной пластичности, что приводит к поведенческим изменениям. Например, наша исследовательская группа сообщила в мужских voles, что социальное сожительство с спариванием увеличение пролиферации клеток в субвентрикулярной зоне (ВЗ) и субгранулярной зоне в зубной извилине (DG) гиппокампа, предполагая, что взрослый нейрогенез может играть определенную роль в формировании парных связей, вызванных спариванием в прерии voles (неопубликованные данные). С другой стороны, хотя области мозга, где новые нейроны генерируются и интегрированы хорошо известны, молекулярные и клеточные механизмы, участвующие в этих процессах остаются неопределенными из-за технических недостатков во всеймодели мозга 6. Например, сигнальные пути, контролирующие экспрессию генов и другие клеточные виды деятельности, имеют относительно короткий период активации (обнаружение фосфопротеома)7. Одной из альтернативных моделей являются изолированные и культурные взрослые нервные стволовые клетки или клетки-предшественники для выяснения молекулярных компонентов, участвующих во взрослом нейрогенезе.
Первым подходом к поддержанию в пробирке нервных прекурсоров от взрослого млекопитающего (мыши) мозга был анализ нейросфер, которые являются клеточными агрегатами, растущими в непристремленных условиях, которые сохраняют их мультипотентный потенциал для генерации нейронов, а такжеастроцитов 8,9,10. Во время их развития, есть процесс отбора, где только предшественники будут реагировать на митогены, такие как эпидермальный фактор роста (EGF) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2) размножаться и генерироватьнейросферы 8,9,10.
К нашим знаниям, в литературе не сообщается о протоколе получения взрослых нейронных прародителей из прерий voles. Здесь мы создали культурные условия для изоляции прогениторов нейронов от нейрогенных ниш и их поддержания в пробирке через анализ формирования нейросферы. Таким образом, эксперименты могут быть разработаны для выявления молекулярных и клеточных механизмов, участвующих в распространении, миграции, дифференциации и выживании нервных стволовых клеток и прародителей, процессов, которые до сих пор неизвестны в прерии vole. Кроме того, выяснение различий в пробирке в свойствах клеток, полученных из ВЗ и ГД, может предоставить информацию о роли нейрогенных ниш в нервной пластичности, связанных с изменениями в социально-сексуальном поведении и когнитивном поведении, а также о дефиците социальных взаимодействий (расстройство аутистического спектра и шизофрения), которые также могут быть секс-зависимыми.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование было одобрено Комитетом по этике исследований Института нейробиологии, Национального университета Мексики и Национального института перинатологии (2018-1-163). Воспроизводство, уход и гуманные конечные точки животных были созданы в соответствии с официальным мексиканским стандартом (NOM-062-00-1999) на основе "Ley General de Salud en Materia de Investigaci'n para la Salud" (Общий закон о здравоохранении для исследований в области здравоохранения) мексиканской секретарии здравоохранения.
1. Решения и подготовка запасов
- Подготовь N2 культурную среду с 485 мл модифицированного орла Dulbecco Medium-F12 (DMEM-F12), 5 мл дополнения N2 (100x), 5 мл глутамина (100x) и 5 мл антибиотико-антимикотической (100x).
- Приготовьте культурную среду B27 с 480 мл нейробазальной среды, 10 мл добавки B27 (50x), 5 мл глутамина и 5 мл антибиотико-антимикотического (100x).
- Восстановленный порошок коллагеназы в 1x PBS (фосфат-буферный солевой раствор) для получения алицитов с активностью 100 единиц/ЗЛ (1000x) и хранить при -20 градусах Цельсия. Обратите внимание, что активность коллагеназы зависит от количества компаний.
- Подготовка dispase акции aliquots путем растворения 5 мг порошка диспаса в 1x PBS (50 мг/мл). Хранить при -20 градусов по Цельсию.
- Подготовьте энзиматический раствор со 100 мл среды DMEM-F12, 50 мкл стоковой коллагеназы (100 единиц/ЗЛ), чтобы иметь окончательную концентрацию 50 U/mL и 333 л биржевой диспазы (50 мг/мл), чтобы иметь окончательную концентрацию 0,33 мг/мл.
- Для приготовления стирального раствора, до 1000 мл 1x PBS, добавьте 0,4766 г HEPES (окончательная концентрация 2 мМ), 3,6 г D-глюкозы (окончательная концентрация 20 мМ) и 2,1 г NaHCO3 (окончательная концентрация 25 мм).
- Подготовка поли-L-орнитин акции aliquots (1 мг/мл) с использованием стерильной воды и хранить при -20 градусов по Цельсию.
- Подготовь рабочее решение поли-Л-орнитин. Разбавить запас алицита (1 мг/мл) в 49 мл стерильной воды для окончательной концентрации 20 мкг/мл.
- Приготовьте рабочее решение из ламинина. Разбавить 25 л ламинина (1 мг/мл исходного бульона) в 5 мл стерильной воды для окончательной концентрации 5 мкг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: После подготовки, фильтровать культуру средств массовой информации, рабочих и фондовых решений, чтобы избежать загрязнения. Используйте шприц или вакуумные фильтры с верхней частью бутылки (полиэтерсульфоновая мембрана размером 0,2 мкм). Культурные средства массовой информации и рабочие решения могут храниться до 30 дней при 4 градусах Цельсия, в то время как запасы могут храниться до четырех месяцев при -20 градусов по Цельсию.
2. Подготовка перед началом микродиссекции
- Стерилизовать хирургические инструменты путем автоклавирования или с горячим стеклянным шариком сухой стерилизатор.
- Очистите площадь поверхности микропереписью при строгих асептических и антисептических условиях (например, с озонизированной водой).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки микродиссекции обеих нейрогенных ниш из каждого мозга vole составляет около 30 мин. Рекомендуется работать с 1-4 животными на протяжении всей процедуры.
3. Извлечение всего мозга
- Анестезия взрослого вол (12-16 недель) при передозировке пентобарбитала (6,3 мг/животное) путем внутриперитонеальной инъекции. Проверить глубину анестезии по отсутствию педали рефлекс в ответ на твердый щепотку ноги.
- После того, как вол полностью анестезируется, вызвать эвтаназию путем обезглавливания и восстановить голову.
- Рассекайте кожу из черепа ножницами, делая хвостовой-ростральный разрез (15 мм в длину), чтобы разоблачить череп.
- Вырезать затылочной и межпариетальной кости и проследить разрез в череп вдоль сагиттаальных и теменых швов.
- Сделайте отверстие в черепе на стыке лобных и теменной костей с помощью ножниц, будучи очень осторожным, чтобы не повредить ткани мозга.
- Чтобы разоблачить мозг, удалите оставшиеся фрагменты черепа, которые покрывают оба полушария мозга острыми пинцетами.
- Используйте шпатель из нержавеющей стали, чтобы поднять весь мозг из черепной основания.
- Соберите мозг в центрифугу трубки (50 мл) с 20 мл холодного раствора мытья.
- Вымойте мозг дважды с холодным раствором мытья.
4. Микродиссеция нервной ткани
- Поместите чашку Петри на поверхность, окруженную льдом.
- Депозит мозга на блюдо и добавить 20 мл холодного раствора мытья.
- Скальпелем, в корональной плоскости, разделить мозг на два блока ткани (ростральной и каудальной). В качестве нейроанатомической ссылки выполните короналовый разрез на уровне Брегмы в передней-заднейоси 11 (рисунок 1A, сплошная линия).
- Из рострального блока извлекайте ткани ВЗ(рисунок 1B),в то время как из хвостового блока удаляют ГД(рисунок 1С).
- Рассекните ВЗ под стерео микроскопом.
- С типсами Дюмона держите одно из полушарий; затем вставьте, на высоте желудочка, тонкие кончики второго Dumont тибры под тканью, что линии caudate-putamen (Рисунок 2A).
- Откройте типсы вдоль спинной оси, чтобы отделить ткань.
- Соберите ткань ВЗ на человека в центрифуге трубки с 2 мл холодного раствора мытья. Не объединить ткани более двух животных.
- Повторите микропересмешие в другом полушарии.
- Храните трубку, содержащую двустороннюю ткань ВЗ на льду, и продолжайте рассеивания ГД.
- Рассекаете ГД из хвостового блока под стерео микроскопом.
- С помощью скальпеля сделайте корональный разрез в блоке, чтобы получить два ломтика, в которых наблюдается образование гиппокампа. В качестве ориентира, разрез сделан на -2 мм Брегма координаты в передней-задней оси в соответствии сатласом мозга мыши 11 (рисунок 1A, пунктирная линия и рисунок 1C).
- С тибрами Дюмона, удерживайте один из ломтиков, и с тонкой точкой Dumont тибры сделать горизонтальный разрез между DG и CA1, а затем выполнить вертикальный разрез между DG и CA3, чтобы отделить DG (Рисунок 2B).
- Повторите вскрытие в первом ломтике другого полушария.
- Повторите вскрытие в обоих полушариях во втором ломтике.
- Соберите четыре ГД штук каждого vole в центрифуге трубки. Не объединить ткани DG более двух животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется вскрытие более чем одного животного, храните центрифуговые трубки с тканью V или DG на льду, продолжая рассекать остальную часть мозга. Удалите все кровеносные сосуды, которые покрывают ткани мозга во время вскрытия. Если сосуды не отбрасываются, культура может быть смешана с избытком эритроцитов и нарушить образование нейросферы.
5. Изоляция нервных клеток
- Поместите центрифуги труб внутри шкафа биобезопасности и ждать около 10 минут для фрагментов тканей, чтобы осаждать под действием силы тяжести.
- Снимите раствор для мытья и добавьте 1 мл теплого энзиматичного раствора в каждую трубку.
- Инкубировать трубки при 37 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
- Дезинтегрировать фрагменты тканей; пипетка вверх и вниз с 1 мл наконечник. Не пипетки более 30x.
- Провести вторую инкубацию 10 мин при 37 градусов по Цельсию.
- В конце второй инкубации, пипетка, чтобы разбить ткани. Не пипетки более 30x.
ПРИМЕЧАНИЕ: После пипетки, фрагменты ткани должны быть полностью разрушены; если они не распались, инкубировать еще 10 минут при 37 градусов по Цельсию и повторно пипетки. Период пищеварения не должен превышать 30 мин. - Добавьте 9 мл N2 среды на трубку, чтобы разбавить энзиматической обработки.
- Центрифуга труб при температуре 200 х г в течение 4 мин при комнатной температуре.
- Откажитесь от супернатанта и вымойте 10 мл N2 среды.
- Центрифуга на тех же условиях, что и шаг 5.8.
- Удалите супернатант из каждой трубки и повторно посовелите клеточные гранулы ВЗ и ГД в 2 мл и 1 мл среды B27, соответственно.
- Чтобы удалить любые не распадающиеся ткани, фильтруйте каждую клеточную суспензию с помощью клеточного ситечко (размер 40 мкм).
6. Формирование нейросфер
- Культура клетки прошли через ситечко в ультра-низкой крепления, 24-хорошо пластины. Используйте две скважины для ВЗ и одну скважину для ГД (1 мл B27 среднего/хорошо).
- Добавьте 20 нг/мл FGF2 и 20 нг/мл EGF к каждой колодец (окончательная концентрация 1x).
- Инкубационный при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 и высокая влажность (90-95%). Не беспокоить в течение 48 ч (день 1 и день 2 культуры, D1-D2).
- На третий день (D3) удалите половину среды культуры и замените ее свежей средой B27 (500 мкл на колодец), дополненной двойной концентрацией (2x) факторов роста.
- Повторяйте каждый третий день, измените культурную среду (половина) и замените ее свежей средой B27, дополненной двойной концентрацией (2x) факторов роста.
- В дни, когда нет необходимости менять культурную среду, добавьте факторы роста к конечной концентрации в 1x.
- Убедитесь, что нейросферы образуются вокруг D8-D10.
- На D10, изменить полную культуру среды для удаления всех мусора.
- Соберите средние и нейросферы по отдельности каждого хорошо в центрифуге труб.
- Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Эта процедура позволяет нейросферы осадков под действием силы тяжести.
- Удалите супернатант и resuspend в 1 мл свежей среды B27 дополняется факторами роста.
- Поместите нейросферы обратно в ту же ультра-низкую пластину крепления и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
- От D10 до D15, продолжайте менять половину среды и добавляя факторы роста.
7. Прохождение нейросфер
- На D15 первичной культуры, собирать нейросферы в центрифуги труб с помощью 1 мл пипетки. Вырезать наконечник пипетки, чтобы увеличить размер отверстия, чтобы избежать повреждения нейросферы.
- Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Нейросферы осаждаются гравитацией.
- Удалите носитель и добавьте 1 мл клеточной отслоения среды на трубку.
- Инкубировать трубки в течение 7 мин при 37 градусов по Цельсию.
- Pipette вверх и вниз с 1 мл отзыв демонтировать нейросферы.
- Разбавить клеточной отслоение среды с 3 мл B27 среды на трубку.
- Центрифуга клеточной подвески в течение 5 мин при 200 x g.
- Откажитесь от супернатанта и заново посовестийте каждую клеточной гранулой со свежей средой B27, дополненной факторами роста.
- Перезагнули клетки, полученные из ВЗ, в 4 мл средних и ГД-производных клеток в 2 мл среды.
- Культура клеток (проход 1) в новой ультра-низкой пластины крепления, удвоив количество скважин, которые были использованы в первичной культуре (4 и 2 скважины для ВЗ и ГД, соответственно).
- Меняйте половину среды каждый третий день и добавляйте факторы роста ежедневно.
- После 10 дней (D10) в проходе 1, изменить условия адепта в следующем отрывке.
8. Прохождение в условиях адептов
- Перед проведением прохода 2, подготовить покрытием пластин с поли-L-орнитин и ламинин.
- В 24-колодец пластины, добавить 500 л 1x поли-L-орнитин (20 мкг / мл) на колодец. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию на ночь.
- Удалить поли-L-орнитин и мыть 4x с 1x PBS (500 л / хорошо).
- Добавьте 200 л (минимальный объем для покрытия поверхности одной колодец) 1x ламинина (5 мкг/мл) на колодец и инкубировать в течение 2-3 ч при 37 градусах Цельсия перед культивированием клеток.
- Соберите нейросферы с 1 мл пипетки с разрезом советы в центрифугу трубки.
- Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы осадки нейросферы под действием силы тяжести.
- Откажитесь от супернатанта и заново поместите нейросферы в свежей среде B27 без факторов роста.
- Аспирировать ламинин из покрытой пластины и депозит нейросферы в скважины с помощью 1 мл пипетки с разрезом советы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предотвращение покрытием скважин от высыхания между удалением ламинина и покрытие нейросферы. - Разделите культуру на два условия:
- Поддержание дифференцированных нейросфер в течение 6 дней (D6). Изменение среды каждый третий день и добавить факторы роста ежедневно.
- Наблюдайте дифференциацию нейросферных клеток на 12 дней (D12). Изменение среды каждый третий день без факторов роста.
ПРИМЕЧАНИЕ: В конце D6 для недифференцированных или D12 для дифференциации условий, клетки могут быть использованы для обычной иммуногистохимии, анализ сортировки клеток, 5-этинил-2'-дезиуридин (EdU) окрашивание, экстракция РНК, среди других.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Нейросферы были сформированы из нервных стволовых клеток, изолированных от V и DG как женщин, так и мужчин взрослых прерий voles. Примерно через 8-10 дней после начала культуры, клетки должны были образовать нейросферы. Обратите внимание, что пластина может содержать мусор в основной культуре(рисунок 3A). Однако в отрывке 1 культура должна состоять только из нейросфер(рисунок 3B).
Большее количество нейросфер были получены от женского ВЗ по сравнению с мужскими ВЗ и ГД как женщин, так и мужчин(рисунок 4A). Эти данные свидетельствуют о том, что количество полученных нейросфер зависит от зоны распространения и vole секс. Как только нейросферы появились (D8-D10), они поддерживались в течение еще семи дней в культуре, и их рост контролировался в этот период. Диаметр нейросфер был измерен на D8, D11 и D14(таблица 1 и рисунок 4B). Размер нейросферы (диаметр) постепенно увеличивался в зависимости от дней культуры для мужских и женских voles в обоих нейронных регионах. Нейросферы, полученные из мужского мозга были меньше по сравнению с нейросферами, полученными из женского мозга в обеих нейрогенных областях (Рисунок 4B).
После 15 дней первичной культуры на плавучих условиях, нейросферы были расширены в проходе 1 в тех же условиях. Для последующего прохождения 2 клетки росли в клейкой культуре, хотя они были в состоянии придерживаться с момента прохождения 1. Прилипаемые нейросферы характеризовались на шестой день (D6) в присутствии факторов роста (недифференцированное состояние, рисунок 5A) или вместо этого до 15-го дня (D15) без факторов роста (дифференцированное состояние, рисунок 5B).
При D6 при недифференцированных условиях нейросферные клетки выражали гнездин (маркер для нейронных прародителей)(рисунок 6). Кроме того, удалось определить двойныекортиновые (DCX) положительные клетки (миграционные клетки) и маркер пролиферации Ki67, которые указывают на наличие либо нейрональных предшественников, либо незрелых нейронов. Тем не менее, отсутствие колокализации Ki67 с DCX свидетельствует о наличии постмитотических нейробластов(рисунок 7). Наконец, при D15 в условиях дифференциации были обнаружены зрелые нейроны (MAP2-положительные клетки), а также клетки с глиальным фенотипом (GFAP-положительные клетки), что демонстрирует потенциал дифференциации изолированных клеток(рисунок 8).
Рисунок 1: Дорсальный вид взрослого мозга vole и его нейрогенных областей. (A)Твердая линия на уровне Брегмы была анатомической ссылкой, чтобы разделить мозг на два блока, ростральный и каудальный. Пунктирная линия была ссылкой на разделение хвостового блока для получения двух ломтиков, содержащих ГД. (B) Корональный вид нейрональных областей, подвергшихся воздействию с первым разрезом, где находится ВЗ. (C)Корональная точка зрения анатомических областей, подвергшихся воздействию второго разреза, где находится ГД. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Анатомические ссылки для вскрытия нейрогенных областей. (A)Схема и фотография коронального раздела из рострального блока, показывающего расположение ВЗ (пунктирная линия). (B)Схема и фотография корональной секции из хвостового блока, показывающего вскрытие ГД. CPu, caudate putamen; V, желудочек; ВЗ, желудочковая зона, ГД, зубная извилина; CA1 и CA3, регионы гиппокампа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативные микрографы нейросферной культуры, полученные из нейрогенных ниш взрослой прерии vole. (A) Первичная культура нейросфер, изолированных от ВЗ женских voles на D10. (B) Прохождение 1 нейросфер, полученных из ВЗ женских voles на D10. Шкала баров - 200 мкм. n' 3 для каждой нейрогенной области и пола вол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Количество и размер нейросфер зависит как от пола, так и от нейрогенного источника. (A) Количество нейросфер в первичной культуре, полученных от ВЗ и ГД как у женщин, так и у мужчин voles на D10. Данные анализировались с помощью одной стороны ANOVA с последующими специальными тестами Tukey. Значительные различия были обнаружены между самкой ВЗ и остальными группами, No p'lt;0.001. (B)Диаметр нейросфер по всему D8-D14 в первичной культуре зависел от vole пола. Данные были проанализированы с помощью двухголочковой ANOVA, за которой последовали пост-специальные тесты Туки. Внутригрупповые сравнения (различия в пределах одной и той же группы) показали увеличение размера нейросферы между D8 против D11 и D14, (P'lt;0.05, йо-0,001, йо-п'л;0.0001); и D11 против D14 (яп.0.001) в ВЗ и ГД женских и мужских voles. Межгрупповое сравнение (различия между группами в одном регионе) показало, что женские нейросферы ВЗ и ГД больше, чем мужские нейросферы в D11 и D14. Пярдз;0.0001. ВЗ был получен от самцов и самок voles (n'3, в группе). Были проанализированы 15 женских и 10 мужских нейросфер. ГД была получена от самцов и самок voles (n'3, в группе). Обработано 8 женских нейросфер и 5 мужских нейросфер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Репрезентативные изображения нейросфер, полученных от самки ВЗ, обученные в условиях адгезии в отрывке 2. (A)Нейросферы придерживались в проходе 2 с факторами роста на D2. (B)Нейросфера полученных клеток, придерживающихся в проходе 2 без факторов роста на D10. Масштабная планка 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Рисунок 6: Выражение nestin в нейросферах. Репрезентативные, эпифлюоресценции-микроскопические изображения гнездин-положительных клеток, полученных из V- как женского, так и мужского взрослого мозга на недифференцированной стадии. Масштаб баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Выражение DCX и Ki67 в нейросферах. Представитель эпифлюоресценции-микроскопии изображения DCX-, Ki67-положительных клеток и слияния, полученных из V е взрослых женщин и мужского мозга на недифференцированной стадии. Масштаб баров 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Выражение MAP2 и GFAP в нейросферах. Репрезентативные, эпифлюоресценции-микроскопические изображения MAP2 (зрелые нейроны) и GFAP (глиальных клеток) положительные клетки, полученные из V- взрослых женских и мужских мозгов на дифференцированной стадии. Масштаб баров 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Размер нейросферы (мкм) | |||||
| Vz | Dg | ||||
| Дни культуры | Секс | Средний ± SD | Дни культуры | Секс | Средний ± SD |
| D8 | F | 102.1±18.2 | D8 | F | 55,3±8,5 |
| М | 86,5±15,1 | М | 37,6±6,8 | ||
| D11 | F | 217,3±35,7 | D11 | F | 142,1±15,4 |
| М | 158,9±47,2 | М | 71,8±14,4 | ||
| D14 | F | 306,6±44,4 | D14 | F | 243,8±37,4 |
| М | 210,8±42,3 | М | 120.2±19.1 | ||
Таблица 1: Количественная оценка среднего размера (диаметра) нейросфер, изолированных от нейрогенных ниш в первичной культуре. Значительные различия показаны на рисунке 4. ВЗ был получен от самцов и самок voles (n'3, в группе). Было проанализировано 15 нейросфер у самок и десять у самцов. ГД была получена от самцов и самок voles (n'3, в группе). Восемь женских нейросфер и пять мужских нейросфер были обработаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стадией получения культуры нервных стволовых клеток является период пищеварения с энзиматическим раствором, который не должен превышать более 30 минут, поскольку он может снизить жизнеспособность клеток. Нейросферы должны появиться через 8-10 дней после первоначальной культуры; если они не появятся к 12-го дню, отбросьте культуру и повторите эксперимент, сократив период пищеварения. Другой проблемой является кровеносные сосуды, которые покрывают ткани мозга. Они должны быть полностью удалены во время вскрытия, потому что избыток эритроцитов может помешать образованию нейросфер.
Этот протокол позволяет расширить плавающие нейросферы до прохождения 2 и изменения в условиях адепта для оценки нейросферы полученных клеток. Тем не менее, он имеет ограничения, такие как снижение нейрогенного потенциала, который переключается на глиогенную дифференциацию при последовательных проходах в качестве адаптационного ответа на условия in vitro12. По этой причине мы рекомендовали охарактеризовать нейросферы в первичной культуре и прохождении 1, и продолжить следующий проход только в том случае, если требуется расширить клетки для экспериментов, которые не связаны с выяснением различий из-за происхождения.
Интересно, что внутренние различия могут быть найдены в первичной культуре нейросфер в результате нейроанатомии (ВЗ или ГД) или секс-зависимых (женщины или мужчины) источник. Таким образом, количество и диаметр нейросфер, полученных из обоих нейрогенных областей женщин, выше по сравнению с мужчинами. Это может быть функциональное различие в женской нише мозга по сравнению с мужчинами, которые молекулярные механизмы могут быть изучены в пробирке с этим анализом.
Клеточная культура нейросфер, полученных из взрослого мозга vole является ценным инструментом, который может помочь решить расхождения между исследованиями in vivo. Например, Фаулер и его коллеги сообщили, что социальная изоляция на 48 ч вызывает увеличение 5-Бромо-2'-дезиуридин (BrdU)-позитивных клеток в ВЗ, не влияя на DG6. В отличие от этого, Lieberwirth и др.; продемонстрировали снижение пролиферации клеток в DG13. Кроме того, культура in vitro может быть моделью для оценки молекулярных механизмов в нейрогенных регионах, которые могут быть связаны с поведенческими изменениями в социальной модели, такой как прерии vole. Например, было высказано предположение, что воздействие новорожденных вызывает, как в не-родительских и родительских voles, увеличение BrdU-положительных клеток вГД 14. Результаты этого исследования могут быть подтверждены с помощью нашего протокола клеточной культуры с маркировкой BrdU. Однако, хотя большинство исследований на voles и других млекопитающих использовать BrdU маркировки для выявления новых клеток, недостаток заключается в том, чтолаббелирование может измениться в зависимости отинъекционных доз 15. EdU, другой аналог тимидин, является идеальной альтернативой для идентификации клеток в фазе клеточного цикла в культурах пробирки. В том же эксперименте, можно иметь несколько периодов для включения ЭдУ, и в отличие от BrdU, денатурации ДНК или инкубации с антителами это не является необходимым для его обнаружения. Кроме того, ЭдУ-позитивные клетки могут быть оценены для совместной локализации с маркерами для выявления цикла деления клеток (Ki67) и определения их фенотипа с помощью маркеров нервных стволовых клеток или прародителей (Nestin, Sox2 и Pax6).
Культура нейросфер может быть создана в качестве модели для изучения влияния гормонов, малых молекул или препаратов в скорости распространения, нейрогенеза и эпигенетических модификаций в нервных стволовых клетках и прародителей прерий voles. Например, предыдущие исследования показали роль гормонов стресса (например, кортикостерона) и эстрогенов в регуляции взрослого нейрогенеза в прериях voles, но основные механизмырегулирования неизвестны 6.
Наконец, расстройства аутистического спектра (ASD) и шизофрения (СЗ) связаны с нарушениями всоциальном познании 16,17. Интересно, что окситоцин и аргинин-вазопрессин играют основополагающую роль в социальном и эмоциональном поведении, а вариации экспрессии генов в их рецепторах (OXTR и вазопрессин 1a (V1AR), соответственно), связаны как сASD,так и с18,19,20,21. Кроме того, изменение нейрогенеза и нервной миграции во время нейроразвития вовлечены в физиопатологиюэтих поведенческих расстройств 22,23,24. Таким образом, мы предлагаем проанализировать молекулярные механизмы опосредовано этими гормонами на нейрогенез, нейронной миграции и других клеточных событий, изменения которых связаны с неврологическими расстройствами с использованием прерии vole клеточной культуры в пробирке модели из-за OXTR и V1AR рецепторы находятся в прерии voleгиппокамп 25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами CONACYT 252756 и 253631; УНАМ-ДГАПА-ПАПИИТ В202818 и В203518; INPER 2018-1-163 и NIH P51OD11132. Мы благодарим Дейси Гаска, Карлоса Лосано, Мартин Гарсия, Алехандру Кастилью, Нидию Эрнандес, Джессику Норрис и Сюзанну Кастро за отличную техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, Pt 1 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
