Summary
Vi etablerte betingelsene for å dyrke nevrale stamceller fra subventrikulær sone og bulke gyrus av den voksne hjernen til prærievoles, som en komplementær in vitro-studie, for å analysere de kjønnsavhengige forskjellene mellom nevrogene nisjer som kan være en del av funksjonelle plastendringer forbundet med sosial atferd.
Abstract
Nevrosfærer er primære celleaggregater som omfatter nevrale stamceller og stamceller. Disse 3D-strukturene er et utmerket verktøy for å bestemme differensierings- og spredningspotensialet til nevrale stamceller, samt å generere cellelinjer enn det som kan analyseres over tid. Også, neurosfærer kan skape en nisje (in vitro) som tillater modellering av det dynamiske skiftende miljøet, for eksempel varierende vekstfaktorer, hormoner, nevrotransmittere, blant andre. Microtus ochrogaster (prærievole) er en unik modell for å forstå det nevrobiologiske grunnlaget for sosio-seksuell atferd og sosial kognisjon. Cellulære mekanismer som er involvert i disse atferdene er imidlertid ikke godt kjent. Protokollen tar sikte på å få nevrale stamceller fra de nevrogene nisjene til den voksne prærievole, som er dyrket under ikke-tilklutnende forhold, for å generere nevrosfærer. Størrelsen og antall neurosfærer avhenger av regionen (subventrikulær sone eller bulke gyrus) og sex av prærievole. Denne metoden er et bemerkelsesverdig verktøy for å studere kjønnsavhengige forskjeller i nevrogene nisjer in vitro og nevroplastisitetsendringer forbundet med sosial atferd som parbinding og biparental omsorg. Også kognitive forhold som medfører underskudd i sosiale interaksjoner (autismespekterforstyrrelser og schizofreni) kan undersøkes.
Introduction
Prærievole (Microtus ochrogaster), medlem av Cricetidae-familien, er et lite pattedyr hvis livsstrategi utvikler seg som en sosialt monogam og svært omgjengelig art. Både menn og kvinner etablerer et varig parbånd etter parring eller lange perioder med samboerskap preget av å dele reiret, forsvare sitt territorium og vise biparental omsorg for deres avkom1,2,3,4. Dermed er prærievole en verdifull modell for å forstå det nevrobiologiske grunnlaget for sosio-seksuell atferd og funksjonsnedsettering i sosial kognisjon5.
Voksen nevrogenese er en av de mest avgjørende prosessene med neural plastisitet som fører til atferdsendringer. For eksempel rapporterte vår forskningsgruppe i mannlige voles at sosial samboerskap med parring økte cellespredning i subventrikulær sone (VZ) og subgranulær sone i dentate gyrus (DG) av hippocampus, noe som tyder på at voksen nevrogenese kan spille en rolle i dannelsen av parbinding indusert ved parring i prærievoles (upubliserte data). På den annen side, selv om hjerneområdene der nye nevroner genereres og integreres er velkjente, forblir molekylære og cellulære mekanismer som er involvert i disse prosessene ubestemte på grunn av tekniske ulemper i hele hjernemodellen6. For eksempel har signalveiene som kontrollerer genuttrykk og andre cellulære aktiviteter en relativt kort aktiveringsperiode (påvisning av fosfoproteom)7. En alternativ modell er isolert og kultivert voksen nevrale stamceller eller stamceller for å belyse molekylære komponenter involvert i voksen nevrogenese.
Den første tilnærmingen til å opprettholde in vitro nevrale forløpere fra voksen pattedyr (mus) hjernen var analysen av nøyrosfærer, som er cellulære aggregater vokser under ikke-tilhenger forhold som bevarer deres multipotente potensial til å generere nevroner, samt astrocytter8,9,10. Under utviklingen er det en utvelgelsesprosess der bare forløperne vil reagere på mitogener som Epidermal Growth Factor (EGF) og Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) for å spre og generere nevrosfærer8,9,10.
Så vidt vi vet, rapporteres ingen protokoll i litteraturen for å få voksne nevrale forfedre fra prærievoles. Her etablerte vi kulturforholdene for å isolere nevronale forfedre fra nevrogene nisjer og deres in vitro-vedlikehold gjennom nevrosfæreformasjonsanalysen. Dermed kan eksperimenter utformes for å identifisere molekylære og cellulære mekanismer som er involvert i spredning, migrasjon, differensiering og overlevelse av nevrale stamceller og forfedre, prosesser som fortsatt er ukjente i prærievole. Videre kan belyse in vitro forskjeller i egenskapene til cellene avledet fra VZ og DG gi informasjon om rollen som nevrogene nisjer i neural plastisitet forbundet med endringer i sosio-seksuell atferd og kognitiv atferd, og underskudd i sosiale interaksjoner (autismespekterforstyrrelse og schizofreni), som også kan være kjønnsavhengig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien ble godkjent av Forskningsetikkkomiteen i Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexico og Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). Reproduksjon, omsorg og humane endepunkter av dyrene ble etablert etter den offisielle meksikanske standarden (NOM-062-Z00-1999) basert på "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (Generell helselov for helseforskning) av den meksikanske secretaria of Health.
1. Forberedelser til løsninger og aksjer
- Forbered et N2 kulturmedium med 485 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium-F12 (DMEM-F12), 5 ml N2 supplement (100x), 5 ml glutamin supplement (100x) og 5 ml antibiotika-antimykotisk (100x).
- Forbered et B27 kulturmedium med 480 ml neurobasal medium, 10 ml B27 supplement (50x), 5 ml glutamintilskudd og 5 ml antibiotika-antimykotisk (100x).
- Rekonstituer kollagenasepulver i 1x PBS (Fosfatbufret saltvann) for å oppnå aliquots med en aktivitet på 100 enheter/μL (1000x) og oppbevares ved -20 °C. Legg merke til, kollagen aktivitet avhenger av partinummeret av selskapene.
- Forbered dispase lager aliquots ved å oppløse 5 mg dispase pulver i 1x PBS (50 mg / ml). Oppbevares ved -20 °C.
- Forbered en enzymatisk løsning med 100 ml DMEM-F12 medium, 50 μL lagercollagenase (100 enheter/μL) for å ha en endelig konsentrasjon på 50 E/ml og 333 μL lager dispase (50 mg/ml) for å ha en endelig konsentrasjon på 0,33 mg/ml.
- For å forberede en vaskeløsning, til 1000 ml 1x PBS, tilsett 0,4766 g HEPES (endelig konsentrasjon 2 mM), 3,6 g D-glukose (endelig konsentrasjon 20 mM) og 2,1 g NaHCO3 (endelig konsentrasjon 25 mM).
- Forbered poly-L-ornitin lager aliquots (1 mg / ml) ved hjelp av sterilt vann og lagre ved -20 °C.
- Forbered en arbeidsløsning av poly-L-ornitin. Fortynn en lager aliquot (1mg/ml) i 49 ml sterilt vann for en endelig konsentrasjon på 20 μg/ml.
- Forbered en arbeidsløsning av laminin. Fortynn 25 μL laminin (1 mg/ml originalt lager) i 5 ml sterilt vann for en endelig konsentrasjon på 5 μg/ml.
MERK: Etter tilberedning må du filtrere kulturmediene, arbeids- og lagerløsningene for å unngå kontaminering. Bruk en sprøyte eller flaske-top vakuumfiltre (polyetersulfon membran med en 0,2 μm pore størrelse). Kulturmediene og arbeidsløsningene kan lagres i opptil 30 dager ved 4 °C, mens bestandene kan lagres i opptil fire måneder ved -20 °C.
2. Forberedelse før mikrodisseksjonen startes
- Steriliser kirurgiske instrumenter ved autoklavering eller med en varm glassperle tørr sterilisator.
- Rengjør mikrodisseksjonsoverflaten under strenge aseptiske og antiseptiske forhold (f.eks. med ozonisert vann).
MERK: Tidspunktet for mikrodisseksjon av begge nevrogene nisjer fra hver vole hjerne er ca 30 min. Arbeid med 1-4 dyr for hele prosedyren anbefales.
3. Ekstraksjon av hele hjernen
- Bedøve den voksne vole (12-16 uker) med en overdose av pentobarbital (6,3 mg/dyr) gjennom intraperitoneal injeksjon. Kontroller dybden av anestesi ved fravær av pedalrefleks som svar på en fast tåklem.
- Når vole er helt bedøvet, indusere eutanasi ved halshugging og gjenopprette hodet.
- Disseker huden fra skallen med saks, noe som gjør et caudal-rostral snitt (15 mm lang) for å avsløre skallen.
- Skjær occipital og interparietal bein og spore et snitt inn i skallen langs sagittal og parietal suturer.
- Lag et hull i skallen i krysset mellom frontale og parietal bein ved hjelp av saks, vær veldig forsiktig så du ikke skader hjernevevet.
- For å eksponere hjernen, fjern de gjenværende kraniefragmentene som dekker begge hjernehalvkulene med skarp spisse pinsett.
- Bruk en slikkepott i rustfritt stål til å løfte hele hjernen fra kranialbasen.
- Samle hjernen i en sentrifuge rør (50 ml) med 20 ml kaldvask løsning.
- Vask hjernen to ganger med kaldvaskeløsningen.
4. Mikrodisseksjon av nevrale vev
- Legg en petriskål på en overflate omgitt av is.
- Deponer hjernen på parabolen og tilsett 20 ml kaldvaskløsning.
- Med en skalpell, i koronalplanet, del hjernen i to blokker av vev (rostral og caudal). Som en nevroanatomisk referanse, utfør koronarkuttet på Bregma-nivå i fremre-bakreakse 11 (Figur 1A, fast linje).
- Fra rostralblokken trekker du ut VZ-vevet (figur 1B), mens fra haleblokken fjerner du DG (figur 1C).
- Disseker VZ under et stereomikroskop.
- Med en Dumont tang, hold en av halvkulene; deretter setter du inn, på høyden av ventrikkelen, de fine spissene til en annen Dumont tang under vevet som linjer caudate-putamen (Figur 2A).
- Åpne tangen langs dorsoventralaksen for å skille vevet.
- Samle VZ vev per person i en sentrifuge rør med 2 ml kaldvask løsning. Ikke pool vevet av mer enn to dyr.
- Gjenta mikrodisseksjonen på den andre halvkule.
- Oppbevar røret som inneholder det bilaterale VZ-vevet på isen og fortsett å dissekere DG.
- Disseker DG fra haleblokken under et stereomikroskop.
- Med en skalpell, gjør en koronar skåret inn i blokken for å oppnå to skiver, hvor hippocampalformasjonen observeres. Som et landemerke er kuttet laget på -2 mm Bregma koordinater i fremre-bakre aksen i henhold til musen hjernen atlas11 (Figur 1A, stiplet linje og figur 1C).
- Med en Dumont tang, hold en av skiver, og med fine-punkts Dumont tang gjøre en horisontal kutt mellom DG og CA1 og deretter utføre et vertikalt snitt mellom DG og CA3 å skille DG (Figur 2B).
- Gjenta disseksjonen i den første delen av den andre halvkule.
- Gjenta disseksjonen på begge halvkuler i den andre skiven.
- Samle de fire DG-bitene av hver vole i et sentrifugerør. Ikke basseng DG vev av mer enn to dyr.
MERK: Hvis disseksjon av mer enn ett dyr er nødvendig, oppbevar sentrifugerørene med VZ- eller DG-vevet på is mens du fortsetter å dissekere resten av hjernen. Fjern alle blodkar som dekker hjernevevet mens dissekering. Hvis fartøyene ikke kastes, kan kulturen blandes med et overskudd av erytrocytter og forstyrre neurosphere dannelse.
5. Isolering av nevrale celler
- Plasser sentrifugerørene inne i biosikkerhetsskapet og vent ca 10 min for vevfragmentene for å utløse tyngdekraften.
- Fjern vaskeoppløsningen og tilsett 1 ml av den varme enzymatiske løsningen til hvert rør.
- Inkuber rørene ved 37 °C i 10 min.
- Oppløse vevfragmentene; pipetten opp og ned med en 1 ml tupp. Ikke pipette mer enn 30x.
- Utfør en ny inkubasjon på 10 min ved 37 °C.
- På slutten av den andre inkubasjonen, pipette for å bryte opp vevet. Ikke pipette mer enn 30x.
MERK: Etter pipettering skal vevsfragmentene være helt oppløst; Hvis de ikke går i oppløsning, inkuber i ytterligere 10 min ved 37 °C og re-pipette. Fordøyelsesperioden bør ikke overstige 30 min. - Tilsett 9 ml N2 medium per rør for å fortynne den enzymatiske behandlingen.
- Sentrifuger rørene ved 200 x g i 4 min ved romtemperatur.
- Kast det overnaturlige og vask med 10 ml N2 medium.
- Sentrifuge under samme forhold som trinn 5.8.
- Fjern supernatanten fra hvert rør og gjenoppusst cellepellets av VZ og DG i henholdsvis 2 ml og 1 ml av B27-mediet.
- Hvis du vil fjerne eventisjonsvev som ikke er oppløst, filtrerer du hver cellulær suspensjon ved hjelp av en cellesil (størrelse 40 μm).
6. Dannelse av nevrosfærer
- Kultur cellene gikk gjennom silen inn i en ultra-lav vedlegg, 24-brønns plate. Bruk to brønner for VZ og en brønn for DG (1 ml B27 medium/brønn).
- Tilsett 20 ng/ml FGF2 og 20 ng/ml EGF til hver brønn (endelig konsentrasjon 1x).
- Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 og høy luftfuktighet (90-95 %). Ikke forstyrr i 48 timer (dag 1 og dag 2 av kultur, D1-D2).
- På den tredje dagen (D3), fjern halvparten av kulturmediet og erstatt det med frisk B27 medium (500 μL per brønn) supplert med dobbel konsentrasjon (2x) av vekstfaktorer.
- Gjenta hver tredje dag, endre kulturmediet (halvparten av det) og erstatte det med et friskt B27 medium supplert med dobbel konsentrasjon (2x) av vekstfaktorer.
- På dager da det ikke er nødvendig å endre kulturmediet, legg til vekstfaktorer til en endelig konsentrasjon på 1x.
- Sørg for at nevrosfærene dannes rundt D8-D10.
- På D10 endrer du hele kulturmediet for å fjerne alt rusk.
- Samle mediet og nevrosfærer individuelt av hver brønn i sentrifuge rør.
- Inkuber i 10 min ved romtemperatur. Denne prosedyren tillater neurosfærer nedbør ved tyngdekraften.
- Fjern den overnaturlige og resuspend i 1 ml frisk B27 medium supplert med vekstfaktorer.
- Plasser nevrosfærene tilbake i samme ultra-lave festeplate og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.
- Fra D10 til D15, fortsett å endre halvparten av mediet og legge til vekstfaktorer.
7. Passasje av neurosfærer
- Ved D15 av den primære kulturen, samle neurosfærer i sentrifuge rør ved hjelp av 1 ml pipette. Klipp pipettespissen for å øke størrelsen på åpningen for å unngå skade på nevrosfærene.
- Inkuber i 10 min ved romtemperatur. Nevrosfærer utløses av tyngdekraften.
- Fjern mediet og tilsett 1 ml celleavløsningsmedium per rør.
- Inkuber rørene i 7 min ved 37 °C.
- Pipette opp og ned med en 1 ml tupp for å demontere nevrosfærene.
- Fortynn celleavløsningsmediet med 3 ml B27 medium per rør.
- Sentrifuger cellefjæringen i 5 min ved 200 x g.
- Kast den overnaturlige og resuspend hver celle pellet med en frisk B27 medium supplert med vekstfaktorer.
- Resuspend VZ-avledede celler i 4 ml medium og DG-avledede celler i 2 ml medium.
- Kultur cellene (passasje 1) i en ny ultra-lav festeplate ved å doble antall brønner som ble brukt i primærkulturen (henholdsvis 4 og 2 brønner for VZ og DG).
- Endre halvparten av mediet hver tredje dag og legg til vekstfaktorer daglig.
- Etter 10 dager (D10) i passasje 1, endre til tilholdelsesforhold i neste passasje.
8. Passasjen under tilholdelsesforhold
- Før du utfører passasjen 2, forbered belagte plater med poly-L-ornitin og laminin.
- I 24-brønnsplater tilsetter du 500 μL μL 1x poly-l-ornitin (20 μg/ml) per brønn. Inkuber ved 37 °C over natten.
- Fjern poly-L-ornitin og vask 4x med 1x PBS (500 μL/ brønn).
- Tilsett 200 μL (minimum volum for å dekke overflaten av en enkelt brønn) på 1x laminin (5 μg/ml) per brønn og inkuber i 2-3 timer ved 37 °C før de dyrker cellene.
- Samle nevrosfærene med 1 ml pipette med kuttede spisser i et sentrifugerør.
- Inkuber i 10 min ved romtemperatur for å utløse nevrosfærene ved tyngdekraften.
- Kast de overnaturante og gjenoppusse nevrosfærene i frisk B27 medium uten vekstfaktorer.
- Aspirer laminin fra den bebelagte platen og deponer neurosfærene i brønnene ved hjelp av 1 ml pipetter med kuttespisser.
MERK: Unngå at belagte brønner tørker ut mellom fjerning av laminin og plating neurosfærer. - Del kulturen i to forhold:
- Oppretthold differensierte nevrosfærer i 6 dager (D6). Endre mediet hver tredje dag og legg til vekstfaktorer daglig.
- Vær oppmerksom på differensiering av neurosphere-avledede celler med 12 dager (D12). Endre mediet hver tredje dag uten vekstfaktorer.
MERK: På slutten av D6 for udifferensiert eller D12 for differensieringsforhold kan cellene brukes til konvensjonell immunohistochemistry, cellesorteringsanalyse, blant annet 5-Ethynyl-2'-deoksyuridin (EdU), RNA-ekstraksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neurosfærer ble dannet fra nevrale stamceller isolert fra VZ og DG av både kvinnelige og mannlige voksne prærievoles. Omtrent 8-10 dager etter at kulturen startet, skulle cellene ha dannet nevrosfærene. Legg merke til at platen kan inneholde rusk i primærkulturen (figur 3A). Men i passasje 1 bør kulturen bare bestå av nevrosfærer (figur 3B).
Et høyere antall neurosfærer ble hentet fra den kvinnelige VZ sammenlignet med den mannlige VZ og DG av både kvinner og menn (figur 4A). Disse dataene tyder på at antall neurosfærer oppnådd avhenger av den proliferative sonen og vole sex. Når nevrosfærene dukket opp (D8-D10), ble de opprettholdt i ytterligere syv dager i kultur, og deres vekst ble overvåket i denne perioden. Diameteren på nevrosfærene ble målt på D8, D11 og D14 (tabell 1 og figur 4B). Neurosphere størrelse (diameter) økte gradvis i henhold til kulturdagene for mannlige og kvinnelige voles i begge nevronale regioner. Neurosfærer avledet fra de mannlige hjernene var mindre i forhold til nevrosfærene avledet fra den kvinnelige hjernen i begge nevrogene områder (figur 4B).
Etter 15 dager med primærkultur på flytende forhold ble nevrosfærene utvidet i passasje 1 under samme forhold. For den påfølgende passasje 2 vokste cellene i klebekultur, selv om de var i stand til å følge siden passasje 1. Vedvarende nevrosfærer ble karakterisert på dag seks (D6) i nærvær av vekstfaktorer (udifferensiert tilstand, figur 5A) eller i stedet til dag 15 (D15) uten vekstfaktorer (differensiert tilstand, figur 5B).
Ved D6 under undifferentiasjonsforhold uttrykte de neurosphere-avledede cellene nestin (en markør for nevrale forfedre) (figur 6). Det var også mulig å identifisere doublecortin (DCX) positive celler (migrasjonsceller) og spredningsmarkøren Ki67, som indikerer tilstedeværelsen av enten nevronale forløpere eller umodne nevroner. Imidlertid antyder mangelen på colocalization av Ki67 med DCX tilstedeværelsen av postmitotiske nevroblaster (figur 7). Til slutt, ved D15 under differensieringsforhold, ble modne nevroner (MAP2-positive celler) funnet, samt celler med glialfenotypen (GFAP-positive celler), som viser differensieringspotensialen til de isolerte cellene (figur 8).
Figur 1: Dorsal syn på en voksen vole hjerne og dets nevrogene regioner. (A) Den solide linjen på Bregma nivå var den anatomiske referansen for å skille hjernen i to blokker, rostral og caudal. Den stiplede linjen var referansen til å dele caudalblokken for å få to skiver som inneholdt DG. (B) Koronar utsikt over de nevronale områdene eksponert med det første snittet, hvor VZ ligger. (C) Koronar utsikt over de anatomiske områdene eksponert med det andre snittet, hvor DG ligger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Anatomiske referanser for disseksjon av nevrogene regioner. (A) Ordningen og fotografiet av koronardelen fra rostralblokken som viser VZ-plasseringen (stiplet linje). (B) Ordningen og fotografiet av koronarseksjonen fra haleblokken som viser DG-disseksjonen. CPu, caudate putamen; V, ventrikkel; VZ, ventrikulær sone, DG, bulke gyrus; CA1 og CA3, regioner i hippocampus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative mikrografer av nevrosfærer kultur avledet fra nevrogene nisjer av den voksne prærievole. (A) Primær kultur av neurosfærer isolert fra VZ av kvinnelige voles på D10. (B) Passasje 1 av neurosfærer avledet fra VZ av kvinnelige voles på D10. Vektstenger = 200 μm. n= 3 for hver nevrogene region og kjønn på volen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Antall og størrelse på nevrosfærer var avhengig av både kjønn og nevrogen kilde. (A)Antall neurosfærer i primærkulturen hentet fra VZ og DG i både kvinnelige og mannlige voles på D10. Data ble analysert med en enveis ANOVA etterfulgt av en Tukeys post hoc-tester. Det ble funnet betydelige forskjeller mellom den kvinnelige VZ og resten av gruppene, ***p<0,001. (B)Diameteren på nevrosfærene i hele D8-D14 i primærkulturen var avhengig av vole sex. Data ble analysert med en toveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc-tester. Sammenligninger mellom gruppe (forskjeller i samme gruppe) viste en økning i nøyrosfærestørrelsen mellom D8 vs. D11 og D14, (*p<0,05, ***p<0.001, ****p<0.0001); og D11 vs. D14 (+++ p<0,001) i VZ og DG av kvinnelige og mannlige voles. Sammenligning mellom grupper (forskjeller mellom grupper i samme region) viste at kvinnelige VZ- og DG-nevrosfærer er større enn mannlige nevrosfærer ved D11 og D14. ### p<0.0001. VZ ble hentet fra menn og kvinnelige voles (n=3, per gruppe). 15 kvinnelige og 10 mannlige nevrosfærer ble analysert. DG ble hentet fra menn og kvinnelige voles (n=3, per gruppe). 8 kvinnelige nevrosfærer og 5 mannlige nevrosfærer ble behandlet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative bilder av nevrosfærer avledet fra den kvinnelige VZ dyrket i vedheftsforhold i passasje 2. (A) Neurosfærer fulgte i passasje 2 med vekstfaktorer ved D2. (B)Neurosphere-avledede celler fulgte i passasje 2 uten vekstfaktorer ved D10. Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Uttrykk for nestin i neurospheres. Representative, epifluorescence-mikroskopibilder av nestinpositive celler avledet fra VZ av både kvinnelige og mannlige voksne hjerner på det udifferensierte stadiet. Skala barer = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Uttrykk for DCX og Ki67 i nevrosfærer. Representative epifluorescence-mikroskopi bilder av DCX-, Ki67-positive celler og fusjonere avledet fra VZ av både voksne kvinnelige og mannlige hjerner på udifferensiert stadium. Skala barer = 25 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Uttrykk for MAP2 og GFAP i nevrosfærer. Representative, epifluorescence-mikroskopi bilder av MAP2 (modne nevroner) og GFAP (glial celler) positive celler avledet fra VZ av både voksne kvinnelige og mannlige hjerner på differensiert stadium. Skala barer = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Størrelsen på nevrosfærer (μm) | |||||
| Vz | Dg | ||||
| Kulturdager | sex | Gjennomsnittlig ± SD | Kulturdager | sex | Gjennomsnittlig ± SD |
| D8 | F | 102.1±18.2 | D8 | F | 55.3±8.5 |
| M | 86.5± 15.1 | M | 37.6±6.8 | ||
| D11 Leilighet | F | 217.3± 35,7 | D11 Leilighet | F | 142.1±15.4 |
| M | 158,9± 47,2 | M | 71.8±14.4 | ||
| D14 Leilighet | F | 306,6± 44,4 | D14 Leilighet | F | 243,8± 37,4 |
| M | 210.8±42.3 | M | 120.2±19.1 | ||
Tabell 1: Kvantifisering av den gjennomsnittlige størrelsen (diameter) av nevrosfærer isolert fra nevrogene nisjer i primærkulturen. Signifikante forskjeller er vist i figur 4. VZ ble hentet fra menn og kvinnelige voles (n=3, per gruppe). Femten nevrosfærer fra kvinner og ti fra menn ble analysert. DG ble hentet fra menn og kvinnelige voles (n=3, per gruppe). Åtte kvinnelige nevrosfærer og fem mannlige nevrosfærer ble behandlet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et stadium for å oppnå en nevrale stamcellekultur er fordøyelsesperioden med den enzymatiske løsningen, som ikke bør overstige mer enn 30 min fordi det kan redusere celle levedyktigheten. Nevrosfærene bør dukke opp på 8-10 dager etter innledende kultur; hvis de ikke kommer frem innen dag 12, kast kulturen og gjenta eksperimentet, og reduser fordøyelsesperioden. Et annet problem er blodårene som dekker hjernevevet. De bør fjernes helt under disseksjonen fordi overskuddet av erytrocytter kan forstyrre neurosfærer formasjonen.
Denne protokollen gjør det mulig å utvide de flytende nevrosfærene til passasje 2 og endre til tilholdende forhold for å evaluere de nøyrosphere-avledede cellene. Det har imidlertid begrensninger som en reduksjon i det nevrogene potensialet, som bytter til gliogen differensiering ved påfølgende passasjer som en tilpasningsrespons på in vitro-forhold12. Av denne grunn anbefalte vi å karakterisere nevrosfærene i primærkulturen og passasje 1, og fortsette med neste passasje bare hvis det er nødvendig å utvide cellene for eksperimenter som ikke involverer belysende forskjeller på grunn av opprinnelsen.
Interessant, iboende forskjeller kan bli funnet i den primære kulturen av nevrosfærer som følge av nevroanatomiske (VZ eller DG) eller sexavhengig (kvinner eller menn) kilde. Dermed er antall og diameter av neurosfærer avledet fra begge nevrogene regioner av kvinner høyere sammenlignet med menn. Dette kan være en funksjonell forskjell i den kvinnelige hjernenisjen sammenlignet med det hos menn, hvilke molekylære mekanismer kan studeres in vitro med denne analysen.
Cellekultur av neurosfærer avledet fra den voksne hjernevole er et verdifullt verktøy som kan bidra til å løse avvik mellom studier in vivo. Fowler og kollegaer rapporterte for eksempel at sosial isolasjon i 48 timer induserer en økning i 5-Bromo-2'-deoksyuridin (BrdU)-positive celler i VZ, uten å påvirke DG6. I motsetning lieberwirth et al.; viste en reduksjon i cellespredning i DG13. Videre kan in vitro kultur være en modell for evaluering av molekylære mekanismer i nevrogene regioner som kan være forbundet med atferdsendringer i en sosial modell som prærievole. For eksempel har det blitt foreslått at eksponering for nyfødte induserer, i både ikke-foreldre- og foreldrevoles, en økning av BrdU-positive celler i DG14. Funnene i denne studien kan bekreftes ved hjelp av vår cellekulturprotokoll med BrdU-merking. Men selv om de fleste studier på voles og andre pattedyr bruker BrdU merking for å identifisere nye celler, en ulempe er at labbeling kan endres avhengig av injisert doser15. EdU, en annen thymidin analog, er et ideelt alternativ for å identifisere celler under cellesyklusfasen in vitro kulturer. I samme eksperiment er det mulig å ha flere perioder for inkorporering av EdU, og i motsetning til BrdU, DNA-denaturation eller inkubasjon med antistoffer er det ikke nødvendig for deteksjon. EdU-positive celler kan også vurderes for sam-lokalisering med markører for å identifisere celledelingssyklusen (Ki67) og bestemme fenotypen ved hjelp av markører av nevrale stamceller eller stamceller (Nestin, Sox2 og Pax6).
Nevrosfærekulturen kan etableres som en modell for å studere effekten av hormoner, små molekyler eller legemidler i spredningsraten, nevrogenese og epigenetiske modifikasjoner i nevrale stamceller og forfedre av prærievoles. For eksempel har tidligere studier foreslått rollen til stresshormonene (som kortikosteron) og østrogener i reguleringen av voksen nevrogenese i prærievoles, men de underliggende regulatoriske mekanismene erukjente 6.
Til slutt er autismespekterforstyrrelser (ASD) og schizofreni (SZ) relatert til funksjonsnedsettering i sosialkognisjon 16,17. Interessant, oxytocin og arginin-vasopressin har en grunnleggende rolle i sosial og emosjonell atferd, og genuttrykk variasjoner i sine reseptorer (OXTR og vasopressin 1a (V1AR), henholdsvis) er forbundet med både ASD og SZ18,19,20,21. Videre er endring i nevrogenese og neural migrasjon under nevroutvikling involvert i fysipatologien til disse atferdsforstyrrelsene22,23,24. Dermed foreslår vi å analysere molekylære mekanismer mediert av disse hormonene på nevrogenese, neural migrasjon og andre cellulære hendelser hvis endringer er relatert til nevrologiske lidelser ved hjelp av prærievole cellekultur in vitro modell på grunn OXTR og V1AR reseptorer finnes i prærievole hippocampus25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av tilskudd CONACYT 252756 og 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 og IN203518; INPER 2018-1-163 og NIH P51OD11132. Vi takker Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris og Susana Castro for deres utmerkede tekniske hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, Pt 1 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
