Summary
We stelden de voorwaarden voor de cultuur neurale voorloper cellen uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van de volwassen hersenen van prairie voles, als een aanvullende in vitro studie, om de seks-afhankelijke verschillen tussen neurogene niches die deel kunnen uitmaken van functionele plastic veranderingen in verband met sociaal gedrag te analyseren.
Abstract
Neurosferen zijn primaire celaggregaten die neurale stamcellen en voorlopercellen omvatten. Deze 3D-structuren zijn een uitstekend hulpmiddel om de differentiatie en proliferatie potentieel van neurale stamcellen te bepalen, evenals om cellijnen te genereren dan kan worden onderzocht na verloop van tijd. Ook kunnen neurosferen een niche (in vitro) creëren die het mogelijk maakt om de dynamische veranderende omgeving te modelleren, zoals verschillende groeifactoren, hormonen, neurotransmitters, onder andere. Microtus ochrogyster (prairie vole) is een uniek model voor het begrijpen van de neurobiologische basis van sociaal-seksueel gedrag en sociale cognitie. Echter, de cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij dit gedrag zijn niet bekend. Het protocol is bedoeld om neurale voorlopercellen te verkrijgen uit de neurogene niches van de volwassen prairievole, die worden gekweekt onder niet-aanhangende omstandigheden, om neurosferen te genereren. De grootte en het aantal neurosferen zijn afhankelijk van de regio (subventriculaire zone of dentate gyrus) en het geslacht van de prairievole. Deze methode is een opmerkelijk hulpmiddel om geslachtsafhankelijke verschillen in neurogene niches in vitro en de neuroplasticiteitsveranderingen in verband met sociaal gedrag zoals pairbinding en biparentale zorg te bestuderen. Ook cognitieve aandoeningen die leiden tot tekorten in sociale interacties (autisme spectrum stoornissen en schizofrenie) kunnen worden onderzocht.
Introduction
De prairie vole (Microtus ochrogrogaster), een lid van de Cricetidae familie, is een klein zoogdier waarvan de levensstrategie zich ontwikkelt als een sociaal monogame en zeer gezellige soort. Zowel mannen als vrouwen vestigen een blijvende paarband na de paring of lange perioden van samenwonen die worden gekenmerkt door het delen van het nest, het verdedigen van hun grondgebied en het tonen van biparentale zorg voor hun nageslacht1,2,3,4. Zo is de prairie vole een waardevol model voor het begrijpen van de neurobiologische basis van sociaal-seksueel gedrag en beperkingen in sociale cognitie5.
Volwassen neurogenese is een van de meest belangrijke processen van neurale plasticiteit die leidt tot gedragsveranderingen. Bijvoorbeeld, onze onderzoeksgroep gemeld in mannelijke woelmuis dat sociale samenwonen met paring verhoogde cel proliferatie in de subventriculaire zone (VZ) en subgranulaire zone in de dentate gyrus (DG) van de hippocampus, wat suggereert dat volwassen neurogenese kan een rol spelen in de vorming van paar binding veroorzaakt door paring in prairie voles (ongepubliceerde gegevens). Aan de andere kant, hoewel de hersengebieden waar nieuwe neuronen worden gegenereerd en geïntegreerd bekend zijn, blijven de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij deze processen onbepaald vanwege technische nadelen in het hele hersenmodel6. Zo hebben de signaleringstrajecten die de genexpressie en andere cellulaire activiteiten controleren een relatief korte activeringsperiode (detectie van fosfoprotenoom)7. Een alternatief model is geïsoleerd en gekweekte volwassen neurale stamcellen of voorloper cellen om moleculaire componenten die betrokken zijn bij volwassen neurogenese op te helderen.
De eerste benadering om in vitro neurale precursoren uit volwassen zoogdier (muis) hersenen te handhaven was de test van neurosferen, die cellulaire aggregaten groeien onder niet-aanhangende omstandigheden die hun multipotente potentieel om neuronen te genereren behouden,evenalsastrocyten 8,9,10. Tijdens hun ontwikkeling is er een selectieproces waarbij alleen de precursoren zullen reageren op mitogenen zoals de Epidermal Growth Factor (EFG) en Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) om neurosferen te vermenigvuldigen en neurosferen te genereren8,9,10.
Voor zover wij weten, wordt er geen protocol gemeld in de literatuur om volwassen neurale voorouders te verkrijgen van prairiewinnen. Hier hebben we de kweekomstandigheden vastgesteld om neuronale voorouders te isoleren van neurogene niches en hun in vitro onderhoud via de neurosfeervormingstest. Zo kunnen experimenten worden ontworpen om de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij proliferatie, migratie, differentiatie en overleving van de neurale stamcellen en voorouders, processen die nog onbekend zijn in de prairie vole te identificeren. Bovendien zou het ophelderen van in vitro verschillen in de eigenschappen van de cellen afgeleid van de VZ en DG informatie kunnen verschaffen over de rol van neurogene niches in neurale plasticiteit geassocieerd met veranderingen in sociaal-seksueel gedrag en cognitief gedrag, en tekorten in sociale interacties (autismespectrumstoornis en schizofrenie), die ook seksafhankelijk kunnen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studie werd goedgekeurd door de Research Ethics Committee van het Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexico en Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). De reproductie, verzorging en humane eindpunten van de dieren werden vastgesteld volgens de Officiële Mexicaanse Standaard (NOM-062-Z00-1999) op basis van de "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (General Health Law for Health Research) van de Mexicaanse Secretaria of Health.
1. Oplossingen en voorbereiding van voorraden
- Bereid een N2-kweekmedium voor met 485 mL van Dulbecco's Modified Eagle Medium-F12 (DMEM-F12), 5 mL N2-supplement (100x), 5 mL glutaminesupplement (100x) en 5 mL antibiotica-antimycotische (100x).
- Bereid een B27-kweekmedium voor met 480 mL neurobasaal medium, 10 mL B27-supplement (50x), 5 mL glutaminesupplement en 5 mL antibioticum-antimycotische (100x).
- Reconstitute collagenasepoeder in 1x PBS (Fosfaatgebufferde zoutoplossing) om aliquoten te verkrijgen met een activiteit van 100 eenheden/μL (1000x) en op te slaan bij -20 °C. Let op, collagenase activiteit is afhankelijk van het lot aantal van de bedrijven.
- Bereid dispase voorraad aliquots door het oplossen van 5 mg dispase poeder in 1x PBS (50 mg/mL). Bewaar bij -20 °C.
- Bereid een enzymatische oplossing voor met 100 mL DMEM-F12 medium, 50 μL stock collagenase (100 eenheden/μL) om een uiteindelijke concentratie van 50 U/mL en 333 μL voorraad dispase (50 mg/mL) te hebben om een uiteindelijke concentratie van 0,33 mg/mL te hebben.
- Voeg voor het bereiden van een wasoplossing tot 1.000 mL 1x PBS 0,4766 g HEPES (eindconcentratie 2 mM), 3,6 g D-glucose (eindconcentratie 20 mM) en 2,1 g NaHCO3 (uiteindelijke concentratie 25 mM) toe.
- Bereid poly-L-ornithine voorraad aliquots (1 mg/mL) met behulp van steriel water en bewaar op -20 °C.
- Bereid een werkende oplossing van poly-L-ornithine voor. Verdun een voorraad aliquot (1mg/mL) in 49 mL steriel water voor een uiteindelijke concentratie van 20 μg/mL.
- Bereid een werkende oplossing van laminine voor. Verdun 25 μL laminine (1 mg/mL oorspronkelijke bouillon) in 5 mL steriel water voor een uiteindelijke concentratie van 5 μg/mL.
OPMERKING: Na de voorbereiding filtert u de cultuurmedia, werk- en voorraadoplossingen om besmetting te voorkomen. Gebruik een spuit of fles-top vacuümfilters (polyethersulfone membraan met een 0,2 μm porie grootte). De cultuurmedia en werkoplossingen kunnen maximaal 30 dagen bij 4 °C worden opgeslagen, terwijl de voorraden maximaal vier maanden bij -20 °C kunnen worden opgeslagen.
2. Voorbereiding vóór aanvang van de microdissection
- Steriliseren chirurgische instrumenten door autoclaving of met een hete glazen kraal droge sterilisator.
- Reinig het microdossectieoppervlak onder strikte aseptische en antiseptische omstandigheden (bijvoorbeeld met ozonwater).
OPMERKING: De timing van microdissection van beide neurogene niches van elke woelmuis is ongeveer 30 min. Werken met 1-4 dieren voor de gehele procedure wordt aanbevolen.
3. Extractie van de hele hersenen
- Verdoven de volwassen woelmuis (12-16 weken) met een overdosis pentobarbital (6,3 mg/dier) via intraperitoneale injectie. Controleer de diepte van anesthesie door de afwezigheid van pedaalreflex in reactie op een stevige teensnuif.
- Zodra de vole volledig verdoofd is, induceer euthanasie door onthoofding en herstel het hoofd.
- Ontleden de huid van de schedel met een schaar, waardoor een caudal-rostral incisie (15 mm lang) om de schedel bloot te leggen.
- Snijd de occipitale en interpariëtale botten en traceer een incisie in de schedel langs de sagittale en pariëtale hechtingen.
- Maak een gat in de schedel op de kruising van frontale en pariëtale botten met behulp van een schaar, heel voorzichtig niet aan het hersenweefsel beschadigen.
- Om de hersenen bloot te leggen, verwijder de resterende schedelfragmenten die beide hersenhelften bedekken met een scherppuntige pincet.
- Gebruik een roestvrijstalen spatel om de hele hersenen uit de schedelbasis te tillen.
- Verzamel de hersenen in een centrifugebuis (50 mL) met 20 mL koude wasoplossing.
- Was de hersenen twee keer met de koude wasoplossing.
4. Microdissection van het neurale weefsel
- Plaats een petrischaal op een oppervlak omringd door ijs.
- Deponeren de hersenen op de schotel en voeg 20 mL van koude wasoplossing.
- Met een scalpel, in het coronale vlak, verdeel de hersenen in twee blokken weefsel (rostral en caudal). Als neuroanatomische referentie voert u de coronale snede op Bregma-niveau uit in de voorste as11 (figuur 1A, vaste lijn).
- Haal uit het rostralblok het VZ-weefsel(figuur 1B)eruit, terwijl het DG uit het staartblok wordt verwijderd (figuur 1C).
- Ontleed de VZ onder een stereomicroscoop.
- Met een Dumont tang, houd een van de hemisferen; dan, steek, op de hoogte van de ventrikel, de fijne uiteinden van een tweede Dumont tang onder het weefsel dat lijnen de caudate-putamen (Figuur 2A).
- Open de tang langs de dorsoventrale as om het weefsel te scheiden.
- Verzamel het VZ-weefsel per individu in een centrifugebuis met 2 mL koude wasoplossing. Pool het weefsel van meer dan twee dieren niet.
- Herhaal de microdissection in het andere halfrond.
- Bewaar de buis met het bilaterale VZ-weefsel op ijs en blijf het DG ontleden.
- Ontleed het DG uit het staartblok onder een stereomicroscoop.
- Met een scalpel, maak een coronale gesneden in het blok om twee plakjes te verkrijgen, waarin de hippocampal formatie wordt waargenomen. Als oriëntatiepunt wordt de snede gemaakt op -2 mm Bregma coördinaten in de voorste achterste as volgens de muishersenenatlas11 (figuur 1A, stippellijn en figuur 1C).
- Met een Dumont tang, houd een van de plakjes, en met fijnpunt Dumont tangen maken een horizontale snede tussen DG en CA1 en voer vervolgens een verticale incisie tussen de DG en CA3 om de DG te scheiden (Figuur 2B).
- Herhaal de dissectie in het eerste deel van het andere halfrond.
- Herhaal de dissectie in beide hemisferen in het tweede segment.
- Verzamel de vier DG-stukken van elke woelmuis in een centrifugebuis. Het DG-weefsel van meer dan twee dieren mag niet worden samengevoegd.
OPMERKING: Als ontleding van meer dan één dier nodig is, bewaar de centrifugebuizen met het VZ- of DG-weefsel op ijs terwijl u de rest van de hersenen blijft ontleden. Verwijder alle bloedvaten die betrekking hebben op het hersenweefsel tijdens het ontleden. Als de vaten niet worden weggegooid, kan de cultuur worden gemengd met een overmaat aan erytrocyten en de vorming van de neurosfeer verstoren.
5. Isolatie van neurale cellen
- Plaats de centrifugebuizen in de bioveiligheidskast en wacht ongeveer 10 minuten tot de weefselfragmenten door de zwaartekracht neerslaan.
- Verwijder de wasoplossing en voeg 1 mL van de warme enzymatische oplossing toe aan elke buis.
- Incubeer de buizen op 37 °C gedurende 10 minuten.
- Desintegreren van de weefselfragmenten; pipet op en neer met een tip van 1 mL. Niet pipette meer dan 30x.
- Voer een tweede incubatie van 10 min uit bij 37 °C.
- Aan het einde van de tweede incubatie, pipet te breken van de weefsels. Niet pipette meer dan 30x.
OPMERKING: Na het pipetten moeten de weefselfragmenten volledig uiteenvallen; als ze niet uiteenvallen, nog eens 10 minuten bij 37 °C en opnieuw pipetten. De spijsverteringsperiode mag niet meer dan 30 min bedragen. - Voeg 9 mL N2-medium per buis toe om de enzymatische behandeling te verdunnen.
- Centrifugeren de buizen op 200 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi de supernatant weg en was met 10 mL N2-medium.
- Centrifuge onder dezelfde voorwaarden als stap 5.8.
- Verwijder de supernatant uit elke buis en zet de celpellets van de VZ en DG opnieuw op in respectievelijk 2 mL en 1 mL van het B27-medium.
- Als u niet-gedesintegreerd weefsel wilt verwijderen, filtert u elke cellulaire suspensie met een celzeef (maat 40 μm).
6. Neurosferen vorming
- Cultuur van de cellen doorgegeven door de zeef in een ultra-lage bevestiging, 24-well plaat. Gebruik twee putten voor de VZ en een goed voor de DG (1 mL van B27 medium / goed).
- Voeg 20 ng/mL FGF2 en 20 ng/mL VAN EFG toe aan elke put (uiteindelijke concentratie 1x).
- Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 en hoge luchtvochtigheid (90-95%). Niet storen voor 48 uur (dag 1 en dag 2 van de cultuur, D1-D2).
- Verwijder op de derde dag (D3) de helft van het kweekmedium en vervang het door vers B27-medium (500 μL per put) aangevuld met dubbele concentratie (2x) groeifactoren.
- Herhaal elke derde dag, verander het kweekmedium (de helft ervan) en vervang het door een vers B27-medium aangevuld met dubbele concentratie (2x) van groeifactoren.
- Op dagen dat het niet nodig is om het kweekmedium te veranderen, voeg groeifactoren toe aan een uiteindelijke concentratie van 1x.
- Zorg ervoor dat de neurosferen worden gevormd rond D8-D10.
- Bij de D10, verander de volledige cultuur medium om alle puin te verwijderen.
- Verzamel de medium en neurosferen individueel van elke put in centrifugebuizen.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Deze procedure maakt neurosferen neerslag door de zwaartekracht.
- Verwijder de supernatant en resuspend in 1 mL van verse B27 medium aangevuld met groeifactoren.
- Plaats de neurosferen terug in dezelfde ultralaage bevestigingsplaat en broed op 37 °C, 5% CO2.
- Van D10 naar D15, blijven veranderen de helft van het medium en het toevoegen van groeifactoren.
7. Passage van de neurosferen
- Bij D15 van de primaire cultuur, verzamel de neurosferen in centrifugebuizen met behulp van 1 mL pipet. Snijd de pipetpunt om de grootte van de opening te vergroten om schade aan de neurosferen te voorkomen.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Neurosferen neerslaan door de zwaartekracht.
- Verwijder het medium en voeg 1 mL van het cellossedement medium per buis toe.
- Broed de buizen 7 min bij 37 °C.
- Pipette op en neer met een tip van 1 mL om de neurosferen te ontmantelen.
- Verdun het cellossedementmedium met 3 mL B27-medium per buis.
- Centrifuge de celsuspensie gedurende 5 min op 200 x g.
- Gooi de supernatant weg en verhoog elke celpellet opnieuw met een vers B27-medium aangevuld met groeifactoren.
- Resuspend de VZ-afgeleide cellen in 4 mL van medium en de DG-afgeleide cellen in 2 mL van medium.
- Kweek de cellen (passage 1) in een nieuwe ultralaage bevestigingsplaat door het aantal putten te verdubbelen dat in de primaire cultuur werd gebruikt (respectievelijk 4 en 2 putten voor VZ en DG).
- Verander elke derde dag de helft van het medium en voeg dagelijks groeifactoren toe.
- Na 10 dagen (D10) in passage 1, verander dan in de volgende passage in de randvoorwaarden.
8. De passage in aanhankelijke omstandigheden
- Voor het uitvoeren van de passage 2, bereid gecoate platen met poly-L-ornithine en laminine.
- Voeg in 24-bronplaten 500 μL 1x poly-L-ornithine (20 μg/mL) per put toe. Incubeer bij 37 °C 's nachts.
- Verwijder de poly-L-ornithine en was 4x met 1x PBS (500 μL/well).
- Voeg 200 μL (minimum volume om het oppervlak van een enkele put te dekken) van 1x laminine (5 μg/mL) per put toe en broed gedurende 2-3 uur bij 37 °C uit voordat de cellen worden gekweekt.
- Verzamel de neurosferen met 1 mL pipet met snijtips in een centrifugebuis.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de neurosferen te neerslaan door de zwaartekracht.
- Gooi de supernatant weg en verhoog de neurosferen in vers B27-medium zonder groeifactoren.
- Aspirate de laminine van de gecoate plaat en deponeren van de neurosferen in de putten met behulp van 1 mL pipetten met snijpunten.
OPMERKING: Voorkom dat gecoate putten uitdrogen tussen laminineverwijdering en beplating van neurosferen. - Verdeel de cultuur in twee voorwaarden:
- Houd gedifferentieerde neurosferen gedurende 6 dagen (D6). Verander het medium elke derde dag en voeg dagelijks groeifactoren toe.
- Observeer differentiatie van de neurosfeer-afgeleide cellen met 12 dagen (D12). Verander het medium elke derde dag zonder groeifactoren.
OPMERKING: Aan het einde van D6 voor ongedifferentieerde of D12 voor differentiatievoorwaarden, kunnen de cellen worden gebruikt voor conventionele immunohistochemie, celsorteeranalyse, 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) vlekken, RNA-extractie, onder anderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neurosferen werden gevormd uit neurale stamcellen geïsoleerd van de VZ en DG van zowel vrouwelijke als mannelijke volwassen prairie woelmuis. Ongeveer 8-10 dagen na het starten van de cultuur, cellen moeten hebben gevormd de neurosferen. Houd er rekening mee dat de plaat puin in de primaire cultuur kan bevatten(figuur 3A). In passage 1 mag de cultuur echter alleen bestaan uit neurosferen(figuur 3B).
Een hoger aantal neurosferen werden verkregen van de vrouwelijke VZ in vergelijking met de mannelijke VZ en DG van zowel vrouwen als mannen (figuur 4A). Deze gegevens suggereren dat het aantal verkregen neurosferen afhangt van de proliferative zone en de woeste seks. Zodra de neurosferen verschenen (D8-D10), werden ze gehandhaafd voor nog eens zeven dagen in de cultuur, en hun groei werd gecontroleerd tijdens deze periode. De diameter van de neurosferen werd gemeten op D8, D11 en D14(tabel 1 en figuur 4B). De grootte van de neurosfeer (diameter) steeg geleidelijk volgens de dagen van cultuur voor mannelijke en vrouwelijke woelmuis in beide neuronale gebieden. Neurosferen afgeleid van de mannelijke hersenen waren kleiner in vergelijking met de neurosferen afgeleid van de vrouwelijke hersenen in beide neurogene gebieden(figuur 4B).
Na 15 dagen van primaire cultuur op drijvende omstandigheden, werden de neurosferen uitgebreid in passage 1 onder dezelfde omstandigheden. Voor de daaropvolgende passage 2 groeiden de cellen in kleefcultuur, hoewel ze zich sinds passage 1 konden hechten. De aanhankelijke neurosferen werden gekenmerkt op dag zes (D6) in aanwezigheid van groeifactoren (ongedifferentieerde toestand, figuur 5A)of in plaats daarvan tot dag 15 (D15) zonder groeifactoren (gedifferentieerde toestand, figuur 5B).
Bij D6 onder undifferentiatie-omstandigheden, de neurosfeer-afgeleide cellen uitgedrukt nestine (een marker voor neurale voorouders) (Figuur 6). Ook was het mogelijk om doublecortine (DCX) positieve cellen (migratiecellen) en de proliferatiemarker Ki67 te identificeren, die de aanwezigheid van neuronale precursoren of onrijpe neuronen aangeven. Echter, het gebrek aan colocalisatie van Ki67 met DCX suggereert de aanwezigheid van postmitotische neuroblasten (Figuur 7). Ten slotte werden bij D15 onder differentiatieomstandigheden volwassen neuronen (MAP2-positieve cellen) gevonden, evenals cellen met het gliafenotype (GFAP-positieve cellen), die differentiatiepotentieel van de geïsoleerde cellen aantoont (figuur 8).
Figuur 1: Dorsale kijk op een volwassen woelmuis en zijn neurogene gebieden. (A) De vaste lijn op Bregma niveau was de anatomische verwijzing naar de hersenen te scheiden in twee blokken, rostral en caudal. De stippellijn was de verwijzing naar het caudalblok te verdelen om twee segmenten met het DG te verkrijgen. (B) Coronale weergave van de neuronale gebieden blootgesteld met de eerste incisie, waar de VZ zich bevindt. (C) Coronale weergave van de anatomische gebieden blootgesteld met de tweede incisie, waar het DG is gevestigd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Anatomische verwijzingen naar de ontleding van neurogene gebieden. (A) Regeling en foto van de coronale sectie van het rostral blok met de VZ-locatie (stippellijn). (B) Regeling en foto van de coronale sectie van het staartblok met de dissectie van het DG. CPu, caudate putamen; V, ventrikel; VZ, ventriculaire zone, DG, dentate gyrus; CA1 en CA3, regio's van de hippocampus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve micrografen van neurosferen cultuur afgeleid van neurogene niches van de volwassen prairie vole. (A) Primaire cultuur van neurosferen geïsoleerd van de VZ van vrouwelijke woelmuis op D10. (B) Passage 1 van neurosferen afgeleid van de VZ van vrouwelijke woelmuis op D10. Schaalstaven = 200 μm. n= 3 voor elk neurogeen gebied en geslacht van de woelmuis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Het aantal en de grootte van neurosferen hing af van zowel geslacht als neurogene bron. (A) Het aantal neurosferen in de primaire cultuur dat bij VZ en DG is verkregen in zowel vrouwelijke als mannelijke woelmuis bij D10. Gegevens werden geanalyseerd met een one-way ANOVA, gevolgd door een Tukey's post hoc tests. Er werden aanzienlijke verschillen gevonden tussen de vrouwelijke VZ en de rest van de groepen, ***p<0,001. (B) De diameter van de neurosferen in de hele D8-D14 in de primaire cultuur hing af van de woelmuis. Gegevens werden geanalyseerd met een twee-weg ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc tests. Intragroepvergelijkingen (verschillen binnen dezelfde groep) toonden een toename van de neurosfeergrootte tussen D8 vs. D11 en D14(*p<0,05, ***p<0,001, ****p<0,0001); en D11 vs. D14 (+++ p<0.001) in de VZ en DG van vrouwelijke en mannelijke woelmuis. Intergroepsvergelijking (verschillen tussen groepen in dezelfde regio) toonde aan dat vrouwelijke VZ- en DG-neurosferen groter zijn dan mannelijke neurosferen bij D11 en D14. ### p<0.0001. VZ werd verkregen uit mannetjes en vrouwelijke woelmuis (n=3, per groep). 15 vrouwelijke en 10 mannelijke neurosferen werden geanalyseerd. DG werd verkregen uit mannetjes en vrouwelijke woelmuis (n=3, per groep). 8 vrouwelijke neurosferen en 5 mannelijke neurosferen werden verwerkt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Representatieve beelden van neurosferen afgeleid van de vrouwelijke VZ gekweekt in hechtingsomstandigheden in passage 2. (A) Neurosferen in passage 2 met groeifactoren bij D2. (B) Neurosfeer-afgeleide cellen nageleefd in passage 2 zonder groeifactoren bij D10. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Expressie van nestine in neurosferen. Representatieve, epifluorescentie-microscopie beelden van nestine-positieve cellen afgeleid van de VZ van zowel vrouwelijke als mannelijke volwassen hersenen in het ongedifferentieerde stadium. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Expressie van DCX en Ki67 in neurosferen. Representatieve epifluorescentie-microscopie beelden van DCX-, Ki67-positieve cellen en samenvoegen afgeleid van de VZ van zowel volwassen vrouwelijke als mannelijke hersenen in het ongedifferentieerde stadium. Schaalbalken = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Expressie van MAP2 en GFAP in neurosferen. Representatieve, epifluorescentie-microscopie beelden van MAP2 (volwassen neuronen) en GFAP (gliacellen) positieve cellen afgeleid van de VZ van zowel volwassen vrouwelijke als mannelijke hersenen in het gedifferentieerde stadium. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Grootte van neurosferen (μm) | |||||
| Vz | Dg | ||||
| Dagen van cultuur | Sex | Gemiddelde ± SD | Dagen van cultuur | Sex | Gemiddelde ± SD |
| D8 | F | 102.1±18,2 | D8 | F | 55±8,5 |
| M | 86±15,1 | M | 37±6,8 | ||
| D11 | F | 217.3±35,7 | D11 | F | 142,1±15,4 |
| M | 158,9±47,2 | M | 71±14,4 | ||
| D14 | F | 306±44,4 | D14 | F | 243,8±37,4 |
| M | 210,8±42,3 | M | 120±19.1 | ||
Tabel 1: Kwantificering van de gemiddelde grootte (diameter) van neurosferen geïsoleerd van neurogene niches in de primaire cultuur. In figuur 4worden aanzienlijke verschillen weergegeven . VZ werd verkregen uit mannetjes en vrouwelijke woelmuis (n=3, per groep). Vijftien neurosferen van vrouwen en tien van mannen werden geanalyseerd. DG werd verkregen uit mannetjes en vrouwelijke woelmuis (n=3, per groep). Acht vrouwelijke neurosferen en vijf mannelijke neurosferen werden verwerkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een stadium om een neurale stamcelcultuur te verkrijgen is de spijsverteringsperiode met de enzymatische oplossing, die niet meer dan 30 min mag bedragen omdat het de levensvatbaarheid van cellen zou kunnen verminderen. De neurosferen moeten ontstaan op 8-10 dagen na de eerste cultuur; als ze niet op dag 12 tevoorschijn komen, gooi de cultuur weg en herhaal het experiment, waardoor de spijsverteringsperiode wordt verkort. Een ander probleem is de bloedvaten die betrekking hebben op het hersenweefsel. Ze moeten volledig worden verwijderd tijdens de dissectie, omdat de overmaat van erythrocyten kan interfereren met de neurosferen vorming.
Dit protocol maakt het mogelijk de zwevende neurosferen uit te breiden tot passage 2 en te veranderen in aanhangende omstandigheden om de neurosfeer-afgeleide cellen te evalueren. Het heeft echter beperkingen zoals een afname van het neurogene potentieel, dat overschakelt naar gliogene differentiatie in opeenvolgende passages als aanpassingsreactie op in vitro voorwaarden12. Om deze reden hebben we aanbevolen het karakteriseren van de neurosferen in de primaire cultuur en passage 1, en doorgaan met de volgende passage alleen als het nodig is om de cellen uit te breiden voor experimenten die niet gepaard gaan met het ophelderen van verschillen als gevolg van de oorsprong.
Interessant is dat intrinsieke verschillen kunnen worden gevonden in de primaire cultuur van neurosferen als gevolg van de neuroanatomische (VZ of DG) of geslachtsafhankelijke (vrouwen of mannen) bron. Zo zijn het aantal en de diameter van neurosferen afkomstig van beide neurogene gebieden van vrouwen hoger in vergelijking met mannen. Dit kan een functioneel verschil in de vrouwelijke hersenen niche in vergelijking met die bij mannen, die moleculaire mechanismen kunnen worden bestudeerd in vitro met deze test.
Celkweek van neurosferen afgeleid van de volwassen hersenwe is een waardevol hulpmiddel dat kan helpen bij het oplossen van discrepanties tussen studies in vivo. Fowler en collega's meldden bijvoorbeeld dat sociaal isolement voor 48 uur een toename van 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)-positieve cellen in de VZ veroorzaakt, zonder dat dit gevolgen heeft voor dg6. In tegenstelling, Lieberwirth et al.; aangetoond dat de celproliferatie in DG13afneemt . Bovendien kan in vitro cultuur een model zijn voor het evalueren van de moleculaire mechanismen in neurogene regio's die geassocieerd kunnen worden met gedragsveranderingen in een sociaal model zoals de prairievole. Er is bijvoorbeeld gesuggereerd dat blootstelling aan pasgeborenen, zowel in niet-ouderlijke als in de ouderlijke woelmuis, een toename van BrdU-positieve cellen in dg14veroorzaakt . De bevindingen van deze studie kunnen worden bevestigd met behulp van ons celcultuurprotocol met BrdU-etikettering. Hoewel de meeste studies over voles en andere zoogdieren BrdU-etikettering gebruiken om nieuwe cellen te identificeren, is een nadeel dat de labbeling kan veranderen afhankelijk van de geïnjecteerde doses15. EdU, een andere thymidine analoog, is een ideaal alternatief om cellen te identificeren onder de celcyclusfase in vitro culturen. In hetzelfde experiment is het mogelijk om verschillende perioden te hebben voor de integratie van EdU, en in tegenstelling tot BrdU, DNA-denaturatie of incubatie met antilichamen is het niet nodig voor de detectie ervan. Ook kunnen EdU-positieve cellen worden beoordeeld op colokalisatie met markers om de celdelingscyclus (Ki67) te identificeren en hun fenotype te bepalen met behulp van markers van neurale stamcellen of voorlopers (Nestin, Sox2 en Pax6).
De neurosferen cultuur kan worden vastgesteld als een model om het effect van hormonen, kleine moleculen of drugs in de proliferatie tarief, neurogenese en epigenetische modificaties in de neurale stamcellen en voorlopers van prairie voles studie. Bijvoorbeeld, eerdere studies hebben gesuggereerd de rol van de stress hormonen (zoals corticosteron) en oestrogenen in de regulering van volwassen neurogenese in prairie woelmuis, maar de onderliggende regulerende mechanismen zijn onbekend6.
Ten slotte zijn autismespectrumstoornissen (ASS) en schizofrenie (SZ) gerelateerd aan stoornissen in sociale cognitie16,17. Interessant is dat oxytocine en arginine-vasopressine een fundamentele rol spelen in sociaal en emotioneel gedrag, en genexpressievariaties in hun receptoren (oxtr en vasopressine 1a (V1AR), respectievelijk) worden geassocieerd met zowel ASS als SZ18,19,20,21. Bovendien zijn verandering in neurogenese en neurale migratie tijdens de neuroontwikkeling betrokken bij de fysiopathologie van deze gedragsstoornissen22,23,24. Zo stellen we voor om de moleculaire mechanismen gemedieerd door deze hormonen op neurogenese, neurale migratie en andere cellulaire gebeurtenissen waarvan de veranderingen zijn gerelateerd aan neurologische aandoeningen met behulp van prairie vole cel cultuur in vitro model als gevolg OXTR en V1AR receptoren zijn te vinden in de prairie vole hippocampus25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies CONACYT 252756 en 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 en IN203518; INPER 2018-1-163 en NIH P51OD11132. Wij danken Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris en Susana Castro voor hun uitstekende technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, Pt 1 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
