Summary
Sosyal davranışlarla ilişkili fonksiyonel plastik değişikliklerin bir parçası olabilecek nörojenik nişler arasındaki cinsiyete bağımlı farklılıkları analiz etmek için, subventriküler bölgeden nöral progenitor hücrelerini kültüraltına alma ve çayır volelerinin yetişkin beyninin dentat giruslarını tamamlayıcı bir in vitro çalışma olarak belirledik.
Abstract
Nörosferler nöral kök hücreleri ve progenitor hücreleri oluşturan birincil hücre agregalarıdır. Bu 3D yapılar, nöral kök hücrelerin farklılaşma ve çoğalma potansiyelini belirlemek ve zaman içinde tahmin edilenegöre hücre hatları oluşturmak için mükemmel bir araçtır. Ayrıca, nörosferler bir niş oluşturabilirsiniz (in vitro) dinamik değişen ortamın modelleme sağlayan, bu tür değişen büyüme faktörleri gibi, hormonlar, nörotransmitterler, diğerleri arasında. Microtus ochrogaster (çayır sıçanı) sosyo-cinsel davranışlar ve sosyal biliş nörobiyolojik temelini anlamak için benzersiz bir modeldir. Ancak, bu davranışlarda yer alan hücresel mekanizmalar iyi bilinmemektedir. Protokol, nörosfer ler üretmek için, yapışık olmayan koşullar altında kültüre giren yetişkin çayır sıçanının nörojenik nişlerinden nöral progenitor hücreleri elde etmeyi amaçlıyor. Nörosferlerin büyüklüğü ve sayısı bölgeye (subventriküler bölge veya dentat girus) ve çayır sıçanının cinsiyetine bağlıdır. Bu yöntem, in vitro nörojenik nişlerde cinsiyete bağlı farklılıkları ve çift bağ ve çift ebeveyn bakımı gibi sosyal davranışlarla ilişkili nöroplastisite değişikliklerini incelemek için dikkate değer bir araçtır. Ayrıca, sosyal etkileşimlerde (otizm spektrum bozuklukları ve şizofreni) açıkları gerektiren bilişsel koşullar incelenebilir.
Introduction
Çayır sıçanı(Microtus ochrogaster),Cricetidae familyasından, sosyal olarak tek eşli ve son derece sosyal bir tür olarak gelişen küçük bir memeli türüdür. Hem erkek hem de dişiler çiftleşme veya yuva paylaşımı ile karakterize birlikte yaşama uzun süre sonra kalıcı bir çift bağ kurmak, kendi toprakları savunmak, ve kendi döl leri için biebeveyn bakım gösteren1,2,3,4. Böylece, çayır sıçanı sosyo-cinsel davranış ve sosyal biliş bozuklukları nın nörobiyolojik temelini anlamak için değerli bir modeldir5.
Erişkin nörogenez, davranış değişikliklerine yol açan nöral plastisitenin en önemli süreçlerinden biridir. Örneğin, araştırma grubumuz erkek volelerde hipokampusun subventriküler zonu (VZ) ve subgranular bölgede hücre çoğalmasının arttığını bildirmiş, bu da yetişkin nörogenezinin çayır voles (yayınlanmamış veriler) çiftleşme ile indüklenen çift bağ oluşumunda rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Öte yandan, yeni nöronların üretildiği ve entegre edildiği beyin bölgeleri iyi bilinmesine rağmen, bu süreçlerde yer alan moleküler ve hücresel mekanizmalar tüm beyin modeli6'dakiteknik sakıncalar nedeniyle belirsizliğini korumaktadır. Örneğin, gen ekspresyonu ve diğer hücresel faaliyetleri kontrol eden sinyal yolları nispeten kısa bir aktivasyon süresine sahiptir (fosfoproteom saptanması)7. Bir alternatif model izole ve yetişkin nörogenezi dahil moleküler bileşenleri açıklamak için yetişkin nöral kök hücreleri veya ata hücreleri kültürlü.
Yetişkin memeli in vitro nöral öncülleri korumak için ilk yaklaşım (fare) beyin nörosferlerin analizi oldu, hangi hücresel agregalar nöronlar oluşturmak için onların çok güçlü potansiyelini korumak non-yapışık koşullar altında büyüyen olan, yanı sıra astrositler8,9,10. Gelişimleri sırasında, sadece öncüllerin Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) ve Fibroblast Büyüme Faktörü 2 (FGF2) gibi mitojenlere yanıt verecekleri birseçim süreci vardır.
Bilgimiz dahilinde, literatürde bozkır farelerinden yetişkin nöral atalar elde etmek için bir protokol bildirilmemiştir. Burada, nöronal ataları nörojenik nişlerden ve bunların in vitro bakımlarından nörosfer formasyonu analizi ile izole etmek için kültür koşullarını oluşturduk. Böylece, deneyler nöral kök hücrelerin ve atalarının çoğalması, göçü, farklılaşması ve hayatta kalması, çayır faresinde hala bilinmeyen süreçler de dahil olmak üzere moleküler ve hücresel mekanizmaları belirlemek üzere tasarlanabilir. Ayrıca, VZ ve DG türetilen hücrelerin özellikleri in vitro farklılıkları açıklığa kavuşturan sosyo-cinsel davranış ve bilişsel davranışlardeğişiklikleri ile ilişkili nöral plastisite nörojenik nişler rolü hakkında bilgi sağlayabilir, ve sosyal etkileşimlerde açıkları (otizm spektrum bozukluğu ve şizofreni), aynı zamanda cinsiyete bağımlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Meksika ve Instituto Nacional de Perinatologia Araştırma Etik Komitesi (2018-1-163) tarafından onaylanmıştır. Hayvanların üreme, bakım ve insancıl uç noktaları Resmi Meksika Standardı (NOM-062-Z00-1999) "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (Sağlık Araştırma Genel Sağlık Yasası) Meksika Sağlık Secretaria of Sait dayalı aşağıdaki kurulmuştur.
1. Çözümler ve hisse senetleri hazırlama
- 485 mL Ile Bir N2 kültür ortamı Hazırlamak 485 Dulbecco Modifiye Kartal Orta-F12 (DMEM-F12), 5 mL N2 takviyesi (100x), glutamin takviyesi 5 mL (100x) ve antibiyotik antimikotik 5 mL (100x).
- Nörobazal orta 480 mL, B27 takviyesi 10 mL (50x), glutamin takviyesi 5 mL ve antibiyotik-antimikotik 5 mL (100x) ile bir B27 kültür ortamı hazırlayın.
- 1x PBS (Fosfat-tamponlu salin) 100 adet/μL (1000x) aktivitesi ile aliquots elde etmek ve -20 °C'de depolamak için kollajenaz tozunu yeniden oluşturun. Dikkat, kollajenaz aktivitesi şirketlerin çok sayısına bağlıdır.
- 1x PBS (50 mg/mL) içinde 5 mg dispase tozu eriterek dispase stok aliquots hazırlayın. -20 °C'de saklayın.
- 100 mL DMEM-F12 orta, 50 μL stok kollajenaz (100 birim/μL) ile enzimatik bir çözelti hazırlayın ve son konsantrasyonu 50 U/mL ve 333 μL (50 mg/mL) son konsantrasyona sahip olmak için 0,33 mg/mL'lik bir konsantrasyona sahip olun.
- 1.000 mL 1x PBS'ye kadar bir yıkama çözeltisi hazırlamak için 0.4766 g HEPES (son konsantrasyon 2 mM), 3.6 g D-glukoz (son konsantrasyon 20 mM) ve 2.1 g NaHCO3 (son konsantrasyon 25 mM) ekleyin.
- Poli-L-ornitin stok aliquots (1 mg /mL) steril su kullanarak hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
- Poli-L-ornitin in çalışma çözeltisi hazırlayın. 20 g/mL'lik son konsantrasyon için 49 mL steril suda bir stok aliquot (1mg/mL) seyreltin.
- Laminin çalışma bir çözüm hazırlayın. Son konsantrasyon için 5 μg/mL'lik steril suda 25 μL laminin (1 mg/mL orijinal stok) seyreltin.
NOT: Hazırlandıktan sonra, kontaminasyonu önlemek için kültür ortamını, çalışma ve stok çözümlerini filtreleyin. Şırınga veya şişe üstü vakum filtreleri (0,2 m gözenek boyutuna sahip polyethersülfone membran) kullanın. Kültür ortamı ve iş çözümleri 4 °C'de 30 güne kadar, stoklar ise -20 °C'de dört aya kadar saklanabilir.
2. Mikrodiseksiyona başlamadan önce hazırlık
- Cerrahi aletleri otoklavlama veya sıcak cam boncuk kuru sterilizatör ile sterilize edin.
- Mikrodisese yüzey alanını katı aseptik ve antiseptik koşullar altında (örneğin ozonize suyla) temizleyin.
NOT: Her bir vole beyninden her iki nörojenik nişin mikrodiseksiyon zamanlaması yaklaşık 30 dk'dır. Tüm prosedür için 1-4 hayvan ile çalışma önerilir.
3. Tüm beynin çıkarılması
- Intraperitoneal enjeksiyon yoluyla pentobarbital (6.3 mg/animal) aşırı dozda erişkin vole (12-16 hafta) anestezi. Bir firma ayak ucurması yanıt olarak pedal refleks yokluğunda anestezi derinliğini doğrulayın.
- Bir kez sıçan tamamen anestezi, decapitation tarafından ötenazi neden ve baş kurtarmak.
- Kafatasından makasla deri inceleyin, kafatasını ortaya çıkarmak için kaudal-rostral kesi (15 mm uzunluğunda) olun.
- Oksipital ve interparietal kemikleri kesin ve sagittal ve parietal dikişler boyunca kafatası içine bir kesi iz.
- Ön ve parietal kemiklerin kesiştiği noktada makas kullanarak kafatasında bir delik açarak beyin dokusuna zarar vermemeye dikkat edin.
- Beyni ortaya çıkarmak için, her iki beyin yarımküresini de keskin uçlu cımbızla kaplayan kalan kafatası parçalarını çıkarın.
- Kafatası tabanından tüm beyin kaldırmak için paslanmaz çelik spatula kullanın.
- Beyni 20 mL soğuk yıkama çözeltisi ile bir santrifüj tüpüne (50 mL) toplayın.
- Soğuk yıkama solüsyonu ile beyni iki kez yıkayın.
4. Nöral dokunun mikrodiseksiyonu
- Buzla çevrili bir yüzeye petri kabı yerleştirin.
- Beyni tabağa yatırın ve 20 mL soğuk yıkama solüsyonu ekleyin.
- Bir neşter ile, koronal düzlemde, doku iki blok (rostral ve kaudal) içine beyin bölmek. Nöroanatomik bir referans olarak, anterior-posterior eksen11 (Şekil 1A, solid line) Bregma düzeyinde koronal kesim gerçekleştirin.
- Rostral bloktan, VZ dokusunu ayıklayın(Şekil 1B),kaudal bloktan ise DG'yi çıkarın (Şekil 1C).
- VZ'yi stereo mikroskop altında inceleyin.
- Bir Dumont forceps ile, hemisfer birini tutun; sonra, eklemek, ventrikül yüksekliğinde, kaudate-putamen hatları doku altında ikinci bir Dumont forceps ince uçlar (Şekil 2A).
- Dokuyu ayırmak için dorsoventral eksen boyunca forcepleri açın.
- 2 mL soğuk yıkama çözeltisi ile bir santrifüj tüpünde kişi başına VZ dokusunu toplayın. İkiden fazla hayvanın dokusunu birleştirmeyin.
- Diğer yarımküredeki mikrodizdisesiyi tekrarlayın.
- İki taraflı VZ dokusunu içeren tüpü buzüzerinde saklayın ve DG'yi incelemeye devam edin.
- DG'yi stereo mikroskop altında kaudal bloktan ayırın.
- Bir neşter ile, iki dilim elde etmek için blok içine bir koronal kesim yapmak, hangi hipokampal oluşumu gözlenir. Bir dönüm noktası olarak, kesme fare beyinatlası 11 (Şekil 1A, noktalı çizgi ve Şekil 1C)göre ön-posterior ekseninde -2 mm Bregma koordinatları yapılır.
- Dumont forceps ile, dilimlerden birini tutun ve ince noktalı Dumont forceps ile DG ve CA1 arasında yatay bir kesim yapmak ve daha sonra DG ve CA3 arasında dg ayırmak için dikey bir kesi gerçekleştirmek (Şekil 2B).
- Diseksiyonu diğer yarımkürenin ilk diliminde tekrarlayın.
- İkinci dilimde her iki yarımkürede de diseksiyonu tekrarlayın.
- Bir santrifüj tüp her vole dört DG parçaları toplamak. İkiden fazla hayvanın DG dokusunu havuza mayın.
NOT: Birden fazla hayvanın diseksiyonu gerekiyorsa, beynin geri kalanını incelemeye devam ederken santrifüj tüplerini VZ veya DG dokusu ile buz üzerinde saklayın. Diseksiyon sırasında beyin dokusunu kaplayan tüm kan damarlarını çıkarın. Damarlar atılmazsa, kültür eritrosit lerin fazlalığı ile karıştırılabilir ve nörosfer oluşumunu bozabilir.
5. Nöral hücrelerin izolasyonu
- Santrifüj tüplerini biyogüvenlik kabininin içine yerleştirin ve doku parçalarının yer çekimine göre çökeltmesini yaklaşık 10 dakika bekleyin.
- Yıkama çözeltisini çıkarın ve her tüpe 1 mL sıcak enzimatik çözelti ekleyin.
- Tüpleri 37 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın.
- Doku parçalarını parçalamak; 1 mL uçlu yukarı ve aşağı pipet. 30x'ten fazla pipet yapmayın.
- 37 °C'de 10 dk ikinci kuluçka yıkın.
- İkinci kuluçka sonunda, pipet dokuları kırmak için. 30x'ten fazla pipet yapmayın.
NOT: Pipetlemeden sonra doku parçaları tamamen parçalanmalıdır; parçalanmazlarsa, 37 °C'de 10 dakika daha kuluçkaya yatırın ve yeniden pipet. Sindirim süresi 30 dakikayı geçmemelidir. - Enzimatik tedaviyi sulandırmak için tüp başına 9 mL N2 orta ekleyin.
- Tüpleri oda sıcaklığında 4 dk 200 x g'da santrifüj edin.
- Supernatant atın ve N2 orta 10 mL ile yıkayın.
- Adım 5.8 ile aynı koşullar altında santrifüj.
- Her tüpten süpernatant çıkarın ve Sırasıyla 2 mL ve 1 mL B27 orta VZ ve DG hücre peletleri askıya.
- Parçalanmamış herhangi bir dokuyu çıkarmak için, her hücre süspansiyonunu bir hücre süzgeci (boyut 40 μm) kullanarak filtreleyin.
6. Nörosfer oluşumu
- Kültür hücreler süzgeçten ultra-düşük bir eki, 24-iyi plaka içine geçti. VZ için iki kuyu ve DG için bir kuyu kullanın (1 mL B27 orta / iyi).
- Her kuyuya 20 ng/mL FGF2 ve 20 ng/mL EGF ekleyin (son konsantrasyon 1x).
- 37 °C, %5 CO2 ve yüksek nem (%90-95) oranında kuluçkaya yatırın. 48 saat (kültürün 1.ve 2. gün ve 2.
- Üçüncü gün (D3), kültür ortamının yarısını çıkarın ve çift konsantrasyon (2x) büyüme faktörleri ile desteklenen taze B27 ortamı (kuyu başına 500 μL) ile değiştirin.
- Her üç günde bir tekrarlayın, kültür ortamını değiştirin (yarısı) ve çift konsantrasyon (2x) büyüme faktörleri ile desteklenen taze bir B27 ortamı ile değiştirin.
- Kültür ortamını değiştirmenin gerekli olmadığı günlerde, büyüme faktörleri 1x'lik son konsantrasyona ekleyin.
- Nörosferlerin D8-D10 etrafında oluştuğundan emin olun.
- D10'da, tüm enkazı kaldırmak için tüm kültür ortamını değiştirin.
- Santrifüj tüplerde her kuyunun orta ve nörosferlerini ayrı ayrı toplayın.
- Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka. Bu işlem nörosferlerin yer çekimine göre çökmesine izin verir.
- Büyüme faktörleri ile desteklenen taze B27 orta 1 mL supernatant çıkarın ve resuspend.
- Nörosferleri aynı ultra düşük ek plakaya geri yerleştirin ve 37 °C, %5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
- D10'dan D15'e, ortamın yarısını değiştirmeye ve büyüme faktörleri eklemeye devam edin.
7. Nörosferlerin geçişi
- Birincil kültürün D15'inde, 1 mL pipet kullanarak nörosferleri santrifüj tüplere toplayın. Nörosferlerin zarar görmesini önlemek için açılış boyutunu artırmak için pipet ucu kesin.
- Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka. Nörosferler yerçekimiyle çökelti.
- Orta çıkarın ve tüp başına hücre ayırma orta 1 mL ekleyin.
- Tüpleri 37 °C'de 7 dakika kuluçkaya yatırın.
- Pipet yukarı ve aşağı 1 mL ucu ile nörosferleri sökmek için.
- Hücre ayırma ortamını tüp başına 3 mL B27 ortası ile seyreltin.
- 200 x g5 dakika hücre süspansiyon santrifüj .
- Supernatant atın ve büyüme faktörleri ile desteklenen taze bir B27 orta ile her hücre pelet resuspend.
- VZ'den türetilmiş hücreleri 4 mL orta ve DG kaynaklı hücreleri 2 mL orta alanda yeniden askıya alın.
- Kültür hücreleri (geçiş 1) birincil kültürde kullanılan kuyuların sayısını iki katına çıkararak yeni bir ultra-düşük ek plaka (vz ve DG için 4 ve 2 kuyu, sırasıyla).
- Her üç günde bir ortamın yarısını değiştirin ve her gün büyüme faktörleri ekleyin.
- 1. paragrafta 10 gün (D10) sonra, bir sonraki pasajda uygun koşullara göre değiştirin.
8. Yapışkan koşullarda geçiş
- Pasaj 2'yi gerçekleştirmeden önce, poli-L-ornitin ve laminin ile kaplı plakalar hazırlayın.
- 24 kuyulu plakalarda, kuyu başına 500 μL 1x poli-L-ornitin (20 μg/mL) ekleyin. Bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Poli-L-ornitini çıkarın ve 1x PBS (500 μL/iyi) ile 4 x yıkayın.
- Kuyu başına 1x laminin (5 μg/mL) 200 μL (tek bir kuyunun yüzeyini kapsayacak minimum hacim) ekleyin ve hücreleri yetiştirmeden önce 37 °C'de 2-3 saat kuluçkaya yatırın.
- Bir santrifüj tüp içine kesilmiş ipuçları ile 1 mL pipet ile nörosferler toplayın.
- Yerçekimi ile nörosferleri çökeltmek için oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
- Supernatant atın ve büyüme faktörleri olmadan taze B27 ortamda nörosferler resuspend.
- Kaplamalı plakadan laminin aspire ve kesilmiş ipuçları ile 1 mL pipetler kullanarak kuyuiçine nörosferler mevduat.
NOT: Kaplamalı kuyuların laminin çıkarılması ve nörosferlerin kaplaması arasında kurumasını önleyin. - Kültürü iki koşula ayırın:
- Diferansiye nörosferleri 6 gün (D6) koruyun. Her üç günde bir ortamı değiştirin ve her gün büyüme faktörleri ekleyin.
- Nörosferden türetilmiş hücrelerin 12 gün (D12) farklılaşmasını gözlemleyin. Büyüme faktörleri olmadan her üç günde bir ortamı değiştirin.
NOT: Farklılaşma koşulları için D6 veya D12'nin sonunda, hücreler konvansiyonel immünohistokimya, hücre ayıklama analizi, 5-Ethynyl-2'-deoksiuridin (EdU) boyama, RNA ekstraksiyonu için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nörosferler hem dişi hem de erkek erişkin çayır sıçanlarının VZ ve DG'sinden izole edilen nöral kök hücrelerden oluşmuştur. Kültüre başladıktan yaklaşık 8-10 gün sonra hücreler nörosferleri oluşturmuş olmalıdır. Plakanın birincil kültürde enkaz içerebileceğini unutmayın(Şekil 3A). Ancak, paragraf 1'de kültür sadece nörosferlerden oluşmalıdır (Şekil 3B).
Kadın VZ'den hem dişilerin hem de erkeklerin erkek VZ ve DG'si ile karşılaştırıldığında daha fazla sayıda nörosfer elde edilmiştir(Şekil 4A). Bu veriler, elde edilen nörosfer sayısının proliferatif bölgeye ve sıçan cinsiyetine bağlı olduğunu göstermektedir. Nörosferler ortaya çıktıktan sonra (D8-D10), kültürde yedi gün daha tutuldular ve büyümeleri bu dönemde izlendi. Nörosferlerin çapı D8, D11 ve D14(Tablo 1 ve Şekil 4B)üzerinde ölçüldü. Nörosferin büyüklüğü (çapı) her iki nöronal bölgelerde erkek ve dişi sıçanlar için kültür günlerine göre kademeli olarak artmıştır. Erkek beyinlerinden elde edilen nörosferler, her iki nörojenik alanda da kadın beyninden elde edilen nörosferlere göre daha küçüktü(Şekil 4B).
Yüzen koşullarda birincil kültür 15 gün sonra, nörosferler aynı koşullar altında geçiş 1 genişletildi. Sonraki pasaj 2 için, hücreler yapışkan kültürde büyüdü, onlar geçiş 1 beri uymayı başardık rağmen. Bağlı nörosferler büyüme faktörlerinin varlığında altıncı (D6) veya büyüme faktörleri olmadan 15 (D15) gününe kadar (diferansiye durum, Şekil 5B)olarak karakterize edildi.
D6'da farklılaşma koşulları altında, nörosferden türetilmiş hücreler nestin (nöral atalar için bir belirteç) ifade edilir(Şekil 6). Ayrıca, doublecortin (DCX) pozitif hücreleri (göç hücreleri) ve nöronal öncüllerin veya olgunlaşmamış nöronların varlığını gösteren proliferasyon belirteci Ki67'yi tanımlamak mümkün oldu. Ancak, DCX ile Ki67 kolokalizasyon eksikliği postmitotik nöroblastların varlığını göstermektedir (Şekil 7). Son olarak, D15'te farklılaşma koşulları altında olgun nöronlar (MAP2-pozitif hücreler) ve izole hücrelerin farklılaşma potansiyelini gösteren glial fenotip (GFAP-pozitif hücreler) içeren hücreler bulunmuştur (Şekil 8).
Şekil 1: Yetişkin bir sıçan beyninin ve nörojenik bölgelerinin dorsal görünümü. (A)Bregma düzeyindeki katı çizgi, beyni rostral ve kaudal olmak üzere iki bloka ayırmak için anatomik referanstır. Noktalı çizgi DG içeren iki dilim elde etmek için kaudal blok bölmek için referans oldu. (B) VZ'nin bulunduğu ilk kesi ile maruz kalan nöronal bölgelerin koronal görünümü. (C) DG'nin bulunduğu ikinci kesi ile maruz kalan anatomik bölgelerin koronal görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nörojenik bölgelerin diseksiyonu için anatomik referanslar. (A) VZ konumunu (noktalı çizgi) gösteren rostral bloktan koronal bölümün şeması ve fotoğrafı. (B) DG diseksiyonu gösteren kaudal bloktan koronal bölümün şeması ve fotoğrafı. CPu, caudate putamen; V, ventrikül; VZ, ventriküler bölge, DG, dentat girus; CA1 ve CA3, hipokampus bölgeleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nörosfer kültürünün temsili mikrografları yetişkin çayır sıçanının nörojenik nişlerinden türetilmiştir. (A) D10'daki dişi farelerin VZ'sinden izole edilen nörosferlerin birincil kültürü. (B) D10'daki dişi farelerin VZ'sinden türetilen nörosferlerin 1. Ölçek çubukları = 200 μm. n= 3 her nörojenik bölge ve sıçanın cinsiyeti için. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Nörosferlerin sayısı ve büyüklüğü hem cinsiyete hem de nörojenik kaynağa bağlıydı. (A) D10'da hem kadın hem de erkek sıçanlarda VZ ve DG'den elde edilen birincil kültürdeki nörosfer sayısı. Veriler tek yönlü ANOVA ile analiz edildi ve ardından Tukey'in post hoc testleri yapıldı. Dişi VZ ile diğer gruplar arasında ***p<0.001 arasında önemli farklılıklar saptandı. (B) Birincil kültürde D8-D14 boyunca nörosferlerin çapı vole cinsiyetine bağlıydı. Veriler iki yönlü ANOVA ile analiz edildi ve ardından Tukey'in post hoc testleri yapıldı. Grup içi karşılaştırmalar (aynı grup içindeki farklılıklar) D8 ile D11 ve D14 arasındaki nörosfer boyutunda bir artış gösterdi(*p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001); ve D11 vs D14 (+++ p<0.001) VZ ve DG kadın ve erkek voles. Gruplar arası karşılaştırma (aynı bölgedeki gruplar arasındaki farklar) dişi VZ ve DG nörosferlerinin D11 ve D14'teki erkek nörosferlerden daha büyük olduğunu göstermiştir. ### p<0.0001. VZ erkek ve dişi sıçanlardan (grup başına n=3) elde edildi. 15 kadın ve 10 erkek nörosfer incelendi. DG erkek ve dişi sıçanlardan (grup başına n=3) elde edildi. 8 kadın nörosferi ve 5 erkek nörosfer işlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 2. geçitteki yapışma koşullarında kültürlenmiş dişi VZ'den türetilen nörosferlerin temsili görüntüleri. (A) Nörosferler D2'de büyüme faktörleri ile 2. (B) Nörosfer kaynaklı hücreler D10'da büyüme faktörü olmaksızın 2. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Nörosferlerde yuvanın ekspresyonu. Farklılaşmamış evrede hem kadın hem de erkek erişkin beyinlerin VZ'sinden elde edilen nestin pozitif hücrelerin temsilcisi, epifloresan-mikroskopi görüntüleri. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: NÖROSFERLERDE DCX ve Ki67 ekspresyonu. DCX-, Ki67-pozitif hücrelerin temsili epifloresan-mikroskopi görüntüleri ve farklılaşmamış aşamada hem yetişkin kadın hem de erkek beyinvz türetilen birleştirme. Ölçek çubukları = 25 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: NÖROSFERLERDE MAP2 ve GFAP ekspresyonu. Map2 (olgun nöronlar) ve GFAP (glial hücreler) pozitif hücrelerin temsilcisi, epifloresan-mikroskopi görüntüleri farklılaştırılmış aşamada hem yetişkin kadın hem de erkek beyinlerin VZ türetilmiştir. Ölçek çubukları = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Nörosferlerin büyüklüğü (μm) | |||||
| Vz | Dg | ||||
| Kültür günleri | Seks | Ortalama ± SD | Kültür günleri | Seks | Ortalama ± SD |
| D8 | F | 102.1±18.2 | D8 | F | 55,3±8,5 |
| M | 86,5±15,1 | M | 37,6±6,8 | ||
| D11 | F | 217.3±35.7 | D11 | F | 142.1±15.4 |
| M | 158,9±47,2 | M | 71,8±14,4 | ||
| D14 | F | 306,6±444,4 | D14 | F | 243,8±37,4 |
| M | 210,8±42,3 | M | 120.2±19,1 | ||
Tablo 1: Birincil kültürde nörojenik nişlerden izole edilen nörosferlerin ortalama boyutunun (çapının) ölçülmesi. Şekil 4'teönemli farklılıklar gösterilmiştir. VZ erkek ve dişi sıçanlardan (grup başına n=3) elde edildi. Dişilerden 15, erkeklerden 10 nörosfer incelendi. DG erkek ve dişi sıçanlardan (grup başına n=3) elde edildi. Sekiz dişi nörosfer ve beş erkek nörosfer işlendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir sinir kök hücre kültürü elde etmek için bir aşama enzimatik çözelti ile sindirim dönemi, hangi hücre canlılığını azaltabilir çünkü 30 dakikadan fazla olmamalıdır. Nörosferler ilk kültürden 8-10 gün sonra ortaya çıkmalıdır; 12. güne kadar ortaya çıkmazlarsa, kültürü atın ve deneyi tekrarlayın, sindirim süresini kısaltın. Başka bir sorun beyin dokusunu kaplayan kan damarları. Eritrositlerin aşırı nörosfer oluşumunu engelleyebilir, çünkü onlar tamamen diseksiyon sırasında kaldırılmalıdır.
Bu protokol, yüzen nörosferlerin geçit 2'ye kadar genişletilmesine ve nörosferden elde edilen hücreleri değerlendirmek için yapışık koşullara geçmesine olanak sağlar. Ancak, in vitro koşullara bir adaptasyon yanıtı olarak ardışık pasajlarda gliojenik farklılaşma geçer nörojenik potansiyelinde bir azalma gibi sınırlamalar vardır12. Bu nedenle, birincil kültür ve pasaj 1 nörosferler karakterize tavsiye ve bir sonraki pasaj ile sadece kökeni nedeniyle açıklayıcı farklılıklar içermeyen deneyler için hücreleri genişletmek için gerekli ise devam.
İlginçtir, içsel farklılıklar nöroanatomik bir sonucu olarak nörosferlerin birincil kültür bulunabilir (VZ veya DG) veya cinsiyete bağımlı (kadın veya erkek) kaynak. Böylece, kadınların her iki nörojenik bölgelerinden elde edilen nörosferlerin sayısı ve çapı erkeklere göre daha yüksektir. Bu erkek ile karşılaştırıldığında kadın beyin niş fonksiyonel bir fark olabilir, hangi moleküler mekanizmalar bu tetkik ile in vitro çalışılabilir.
Yetişkin beyin sıçanından elde edilen nörosferlerin hücre kültürü, in vivo çalışmaları arasındaki tutarsızlıkları çözmeye yardımcı olabilecek değerli bir araçtır. Örneğin, Fowler ve iş arkadaşları 48 saat için sosyal izolasyon DGetkilemeden,VZ 5-Bromo-2'-deoksiürin (BrdU)-pozitif hücrelerde bir artış ayolan bildirdi 6 . Buna karşılık, Lieberwirth ve ark.; DG13'tehücre çoğalmasında azalma göstermiştir. Ayrıca, in vitro kültür, çayır sıçanı gibi sosyal bir modelde davranış değişiklikleri ile ilişkili olabilir nörojenik bölgelerde moleküler mekanizmaları değerlendirmek için bir model olabilir. Örneğin, yenidoğanlara maruz kalmanın hem ebeveyn dışı hem de ebeveyn sıçanlarında DG14'tekiBrdU pozitif hücrelerinin artmasına neden olduğu ileri sürülmuştur. Bu çalışmanın bulguları BrdU etiketleme ile hücre kültürü protokolü müzakiremiz kullanılarak doğrulanabilir. Ancak, sıçanlar ve diğer memeliler üzerinde yapılan çalışmaların çoğu yeni hücreleri tanımlamak için BrdU etiketleme kullanmak rağmen, bir dezavantajı laboratuvar enjekte dozlara bağlı olarak değişebilir15. EdU, başka bir timidin analog, in vitro kültürlerde hücre döngüsü fazı altında hücreleri tanımlamak için ideal bir alternatiftir. Aynı deneyde, EdU'nun dahil edilmesi için birkaç dönem olması mümkündür ve BrdU'nun aksine, DNA denatürasyonu veya antikorlarla kuluçka ya da inkübasyon tespiti için gerekli değildir. Ayrıca, EdU-pozitif hücreler hücre bölünmesi döngüsünü (Ki67) tanımlamak ve nöral kök hücre veya atalarının belirteçleri (Nestin, Sox2 ve Pax6) kullanarak fenotipbelirlemek için belirteçleri ile birlikte lokalizasyon için değerlendirilebilir.
Nörosfer kültürü, hormonların, küçük moleküllerin veya ilaçların çoğalma hızındaki etkisini, nöral kök hücrelerdeki nörogenez ve epigenetik modifikasyonları ve çayır sıçanlarının atalarını incelemek için bir model olarak kurulabilir. Örneğin, önceki çalışmalarda stres hormonlarının rolü ileri sürülmüştür (kortikosteron gibi) ve bozkır sıçanlarında yetişkin nörogenezinin düzenlenmesinde östrojenler, ancak altta yatan düzenleyici mekanizmalar bilinmemektedir6.
Son olarak, otizm spektrum bozuklukları (ASD) ve şizofreni (SZ) sosyal biliş bozuklukları ile ilgilidir16,17. İlginçtir, oksitosin ve arginin-vazopressin sosyal ve duygusal davranış temel bir role sahip, ve reseptörlerinde gen ekspresyonu varyasyonları (OXTR ve vazopressin 1a (V1AR), sırasıyla) hem ASD ve SZileilişkilidir18 ,19,20,21. Ayrıca nörogelişim sırasında nörogenezde ve nöral göçte değişiklik bu davranış bozukluklarının fizyopatolojisinde de yer almaktadır22,23,24. Böylece, nörogenez, nöral göç ve değişiklikler nedeniyle PROXTR ve V1AR reseptörleri nedeniyle vitro model prairie vole hücre kültürü kullanarak nörolojik bozukluklar ile ilgili diğer hücresel olaylar üzerinde bu hormonlar aracılık moleküler mekanizmaları analiz etmek için önermek çayır vole hipokampus25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma CONACYT 252756 ve 253631 hibeler tarafından desteklenmiştir; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 ve IN203518; INPER 2018-1-163 ve NIH P51OD11132. Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris ve Susana Castro'ya mükemmel teknik yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, Pt 1 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
