Vi etablerede betingelserne for at kultur neurale progenitor celler fra subventrikulære zone og dentate gyrus af den voksne hjerne prærie voles, som en supplerende in vitro undersøgelse, at analysere de kønsafhængige forskelle mellem neurogene nicher, der kunne være en del af funktionelle plast ændringer forbundet med social adfærd.
Neurosfærer er primære celle aggregater, der omfatter neurale stamceller og progenitor celler. Disse 3D-strukturer er et glimrende værktøj til at bestemme differentiering og spredning potentiale neurale stamceller, samt at generere cellelinjer end der kan analyseres over tid. Også, neurosfærer kan skabe en niche (in vitro), der gør det muligt modellering af den dynamiske skiftende miljø, såsom varierende vækstfaktorer, hormoner, neurotransmittere, blandt andre. Microtus ochrogaster (prærievole) er en unik model for at forstå det neurobiologiske grundlag for socio-seksuel adfærd og social kognition. Men, de cellulære mekanismer, der er involveret i disse adfærdsmønstre er ikke kendt. Protokollen har til formål at opnå neurale progenitor celler fra neurogene nicher af den voksne prærie vole, som er dyrket under ikke-klæbende forhold, at generere neurosfærer. Størrelsen og antallet af neurosfærer afhænger af regionen (subventrikulær zone eller dentate gyrus) og køn prærien vole. Denne metode er et bemærkelsesværdigt værktøj til at studere kønsafhængige forskelle i neurogene nicher in vitro og neuroplasticitet ændringer forbundet med social adfærd såsom par limning og biparental pleje. Også, kognitive tilstande, der medfører underskud i sociale interaktioner (autisme spektrum forstyrrelser og skizofreni) kunne undersøges.
Prærien vole (Microtus ochrogaster), et medlem af Cricetidae familien, er et lille pattedyr, hvis liv strategi udvikler sig som en socialt monogame og meget omgængelig art. Både hanner og hunner etablere en varig par obligation efter parring eller lange perioder med samliv karakteriseret ved at dele reden, forsvare deres område, og vise biparental pleje for deres afkom1,2,3,4. Således prærien vole er en værdifuld model for at forstå det neurobiologiske grundlag for socio-seksuel adfærd og funktionsnedsættelser i social kognition5.
Voksen neurogenese er en af de mest altoverskyggende processer neurale plasticitet, der fører til adfærdsmæssige ændringer. For eksempel rapporterede vores forskningsgruppe i hanvoles, at social samliv med parring øget celleprolifererende i subventrikulær zone (VZ) og subgranular zone i dentate gyrus (DG) af hippocampus, hvilket tyder på, at voksne neurogenese kan spille en rolle i dannelsen af par binding induceret ved parring i prærievoles (ikke-offentliggjorte data). På den anden side, selv om hjernen regioner, hvor nye neuroner er genereret og integreret er velkendte, de molekylære og cellulære mekanismer, der er involveret i disse processer forbliver ubestemt på grund af tekniske ulemper i hele hjernen model6. For eksempel har signalvejene, der styrer genekspression og andre cellulære aktiviteter, en relativt kort aktiveringsperiode (påvisning af fosforetom)7. En alternativ model er isolerede og dyrkede voksne neurale stamceller eller progenitor celler til at belyse molekylære komponenter involveret i voksne neurogenese.
Den første tilgang til at opretholde in vitro neurale prækursorer fra voksne pattedyr (mus) hjerne var analysen af neurosfærer, som er cellulære aggregater vokser under ikke-vedholdne forhold, som bevarer deres multipotente potentiale til at generere neuroner, samt astrocytter8,9,10. Under deres udvikling, er der en udvælgelsesproces, hvor kun prækursorer vil reagere på mitogener såsom Epidermal Vækstfaktor (EGF) og Fibroblast Vækstfaktor 2 (FGF2) at formere sig og generere neurosfærer8,9,10.
Så til vores viden, er ingen protokol rapporteret i litteraturen for at opnå voksne neurale forfædre fra prærie voles. Her etablerede vi kulturbetingelserne for at isolere neuronale forfædre fra neurogene nicher og deres in vitro vedligeholdelse gennem neurosphere formation assay. Således kan eksperimenter udformes til at identificere de molekylære og cellulære mekanismer, der er involveret i spredning, migration, differentiering og overlevelse af de neurale stamceller og forfædre, processer, der stadig er ukendte i prærien vole. Desuden belyse in vitro forskelle i egenskaberne af cellerne stammer fra VZ og DG kunne give oplysninger om den rolle, neurogene nicher i neurale plasticitet forbundet med ændringer i socio-seksuel adfærd og kognitiv adfærd, og underskud i sociale interaktioner (autisme spektrum lidelse og skizofreni), som også kunne være sex-afhængige.
En fase for at opnå en neuralstamcellekultur er fordøjelsesperioden med den enzymatiske opløsning, som ikke bør overstige mere end 30 min. Neurosfærerne bør dukke op på 8-10 dage efter indledende kultur; hvis de ikke opstår ved dag 12, kasseres kulturen og gentager eksperimentet, hvilket reducerer fordøjelsesperioden. Et andet problem er de blodkar, der dækker hjernevæv. De bør fjernes helt under dissektionen, fordi overskuddet af erythrocytter kan forstyrre neurosfærerne dannelse.
<p class="jove_content…The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af tilskud CONACYT 252756 og 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 og IN203518; INPER 2018-1-163 og NIH P51OD11132. Vi takker Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris og Susana Castro for deres fremragende tekniske bistand.
Antibodies | Antibody ID | ||
Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
Culture reagents | |||
Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
Disposable material | |||
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
Sterile cotton gauzes | |||
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
Sterile surgical gloves | any brand | ||
Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
Equipment and surgical instruments | |||
Biological safety cabinet | |||
Dissecting Scissors | |||
Dumont Forceps | |||
Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
Micropipettes | |||
Petri Dishes | |||
Scalpel Blades | |||
Stainless-steel Spatula |