Summary

Kultur af Neurosfærer Stammer fra neurogene nicher i Adult Prairie Voles

Published: June 10, 2020
doi:

Summary

Vi etablerede betingelserne for at kultur neurale progenitor celler fra subventrikulære zone og dentate gyrus af den voksne hjerne prærie voles, som en supplerende in vitro undersøgelse, at analysere de kønsafhængige forskelle mellem neurogene nicher, der kunne være en del af funktionelle plast ændringer forbundet med social adfærd.

Abstract

Neurosfærer er primære celle aggregater, der omfatter neurale stamceller og progenitor celler. Disse 3D-strukturer er et glimrende værktøj til at bestemme differentiering og spredning potentiale neurale stamceller, samt at generere cellelinjer end der kan analyseres over tid. Også, neurosfærer kan skabe en niche (in vitro), der gør det muligt modellering af den dynamiske skiftende miljø, såsom varierende vækstfaktorer, hormoner, neurotransmittere, blandt andre. Microtus ochrogaster (prærievole) er en unik model for at forstå det neurobiologiske grundlag for socio-seksuel adfærd og social kognition. Men, de cellulære mekanismer, der er involveret i disse adfærdsmønstre er ikke kendt. Protokollen har til formål at opnå neurale progenitor celler fra neurogene nicher af den voksne prærie vole, som er dyrket under ikke-klæbende forhold, at generere neurosfærer. Størrelsen og antallet af neurosfærer afhænger af regionen (subventrikulær zone eller dentate gyrus) og køn prærien vole. Denne metode er et bemærkelsesværdigt værktøj til at studere kønsafhængige forskelle i neurogene nicher in vitro og neuroplasticitet ændringer forbundet med social adfærd såsom par limning og biparental pleje. Også, kognitive tilstande, der medfører underskud i sociale interaktioner (autisme spektrum forstyrrelser og skizofreni) kunne undersøges.

Introduction

Prærien vole (Microtus ochrogaster), et medlem af Cricetidae familien, er et lille pattedyr, hvis liv strategi udvikler sig som en socialt monogame og meget omgængelig art. Både hanner og hunner etablere en varig par obligation efter parring eller lange perioder med samliv karakteriseret ved at dele reden, forsvare deres område, og vise biparental pleje for deres afkom1,2,3,4. Således prærien vole er en værdifuld model for at forstå det neurobiologiske grundlag for socio-seksuel adfærd og funktionsnedsættelser i social kognition5.

Voksen neurogenese er en af de mest altoverskyggende processer neurale plasticitet, der fører til adfærdsmæssige ændringer. For eksempel rapporterede vores forskningsgruppe i hanvoles, at social samliv med parring øget celleprolifererende i subventrikulær zone (VZ) og subgranular zone i dentate gyrus (DG) af hippocampus, hvilket tyder på, at voksne neurogenese kan spille en rolle i dannelsen af par binding induceret ved parring i prærievoles (ikke-offentliggjorte data). På den anden side, selv om hjernen regioner, hvor nye neuroner er genereret og integreret er velkendte, de molekylære og cellulære mekanismer, der er involveret i disse processer forbliver ubestemt på grund af tekniske ulemper i hele hjernen model6. For eksempel har signalvejene, der styrer genekspression og andre cellulære aktiviteter, en relativt kort aktiveringsperiode (påvisning af fosforetom)7. En alternativ model er isolerede og dyrkede voksne neurale stamceller eller progenitor celler til at belyse molekylære komponenter involveret i voksne neurogenese.

Den første tilgang til at opretholde in vitro neurale prækursorer fra voksne pattedyr (mus) hjerne var analysen af neurosfærer, som er cellulære aggregater vokser under ikke-vedholdne forhold, som bevarer deres multipotente potentiale til at generere neuroner, samt astrocytter8,9,10. Under deres udvikling, er der en udvælgelsesproces, hvor kun prækursorer vil reagere på mitogener såsom Epidermal Vækstfaktor (EGF) og Fibroblast Vækstfaktor 2 (FGF2) at formere sig og generere neurosfærer8,9,10.

Så til vores viden, er ingen protokol rapporteret i litteraturen for at opnå voksne neurale forfædre fra prærie voles. Her etablerede vi kulturbetingelserne for at isolere neuronale forfædre fra neurogene nicher og deres in vitro vedligeholdelse gennem neurosphere formation assay. Således kan eksperimenter udformes til at identificere de molekylære og cellulære mekanismer, der er involveret i spredning, migration, differentiering og overlevelse af de neurale stamceller og forfædre, processer, der stadig er ukendte i prærien vole. Desuden belyse in vitro forskelle i egenskaberne af cellerne stammer fra VZ og DG kunne give oplysninger om den rolle, neurogene nicher i neurale plasticitet forbundet med ændringer i socio-seksuel adfærd og kognitiv adfærd, og underskud i sociale interaktioner (autisme spektrum lidelse og skizofreni), som også kunne være sex-afhængige.

Protocol

Undersøgelsen blev godkendt af Forskningsetisk Komité under Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexico og Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). Dyrenes reproduktion, pleje og humane endepunkter blev etableret efter den officielle mexicanske standard (NOM-062-Z00-1999) baseret på “Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud” (general health law for health research) fra den mexicanske Sundhedsminister. 1. Fremstilling af løsni…

Representative Results

Neurosfærer blev dannet af neurale stamceller isoleret fra VZ og DG for både kvindelige og mandlige voksne prærie voles. Omkring 8-10 dage efter start af kulturen, celler bør have dannet neurosfærer. Bemærk, at pladen kan indeholde snavs i den primære kultur (Figur 3A). I passage 1 bør kulturen dog kun bestå af neurosfærer (figur 3B). Et større antal neurosfærer blev opnået fra den kvindelige VZ sammenlignet med den mandl…

Discussion

En fase for at opnå en neuralstamcellekultur er fordøjelsesperioden med den enzymatiske opløsning, som ikke bør overstige mere end 30 min. Neurosfærerne bør dukke op på 8-10 dage efter indledende kultur; hvis de ikke opstår ved dag 12, kasseres kulturen og gentager eksperimentet, hvilket reducerer fordøjelsesperioden. Et andet problem er de blodkar, der dækker hjernevæv. De bør fjernes helt under dissektionen, fordi overskuddet af erythrocytter kan forstyrre neurosfærerne dannelse.

<p class="jove_content…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskning blev støttet af tilskud CONACYT 252756 og 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 og IN203518; INPER 2018-1-163 og NIH P51OD11132. Vi takker Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris og Susana Castro for deres fremragende tekniske bistand.

Materials

Antibodies Antibody ID
Anti-Nestin GeneTex GTX30671 RRID:AB_625325
Anti-Doublecortin MERCK AB2253 RRID:AB_1586992
Anti-Ki67 Abcam ab66155 RRID:AB_1140752
Anti-MAP2 GeneTex GTX50810 RRID:AB_11170769
Anti-GFAP SIGMA G3893 RRID:AB_477010
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11029 RRID:AB_2534088
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11036 RRID:AB_10563566
Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11073 RRID:AB_2534117
Culture reagents
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific/Gibco 15240062 100X
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific/Gibco 17504044 50X
Collagenase, Type IV Thermo Fisher Scientific/Gibco 17104019 Powder
Dispase Thermo Fisher Scientific/Gibco 17105041 Powder
DMEM/F12, HEPES Thermo Fisher Scientific/Gibco 11330032
Glucose any brand Powder, Cell Culture Grade
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific/Gibco 35050061 100X
HEPES any brand Powder, Cell Culture Grade
Mouse Laminin Corning 354232 1 mg/mL
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific/Gibco 17502048 100X
NAHCO3 any brand Powder, Suitable for Cell Culture
Neurobasal Thermo Fisher Scientific/Gibco 21103049
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific/Gibco 10010023 1X
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma-Aldrich P3655 Powder
Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic Peprotech AF-100-18B
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific/Gibco A1110501 100 mL
Disposable material
24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates Corning/Costar 3473
24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning/Costar 3526
40 µm Cell Strainer Corning/Falcon 352340 Blue
Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore Corning 431118 PES membrane, 45 mm diameter neck
Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube any brand with conical bottom
Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. any brand
Sterile cotton gauzes
Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL any brand
Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL any brand
Sterile surgical gloves any brand
Syringe Filters, 0.22 µm pore Merk Millipore SLGPR33RB Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter
Equipment and surgical instruments
Biological safety cabinet
Dissecting Scissors
Dumont Forceps
Motorized Pipet Filler/Dispenser
Micropipettes
Petri Dishes
Scalpel Blades
Stainless-steel Spatula

References

  1. Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
  2. Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
  3. Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
  4. Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).
  5. McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
  6. Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
  7. Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
  8. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  9. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
  10. Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
  11. Paxinos, G., Keith, B. J. F. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
  12. Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
  13. Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
  14. Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
  15. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
  16. Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
  17. Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
  18. Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
  19. Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
  20. Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
  21. Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
  22. Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
  23. Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
  24. Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
  25. Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5′ flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
  26. Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).

Play Video

Cite This Article
Ávila-González, D., Young, L. J., Camacho, F., Paredes, R. G., Díaz, N. F., Portillo, W. Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles. J. Vis. Exp. (160), e61402, doi:10.3791/61402 (2020).

View Video