Summary
Vi etablerede betingelserne for at kultur neurale progenitor celler fra subventrikulære zone og dentate gyrus af den voksne hjerne prærie voles, som en supplerende in vitro undersøgelse, at analysere de kønsafhængige forskelle mellem neurogene nicher, der kunne være en del af funktionelle plast ændringer forbundet med social adfærd.
Abstract
Neurosfærer er primære celle aggregater, der omfatter neurale stamceller og progenitor celler. Disse 3D-strukturer er et glimrende værktøj til at bestemme differentiering og spredning potentiale neurale stamceller, samt at generere cellelinjer end der kan analyseres over tid. Også, neurosfærer kan skabe en niche (in vitro), der gør det muligt modellering af den dynamiske skiftende miljø, såsom varierende vækstfaktorer, hormoner, neurotransmittere, blandt andre. Microtus ochrogaster (prærievole) er en unik model for at forstå det neurobiologiske grundlag for socio-seksuel adfærd og social kognition. Men, de cellulære mekanismer, der er involveret i disse adfærdsmønstre er ikke kendt. Protokollen har til formål at opnå neurale progenitor celler fra neurogene nicher af den voksne prærie vole, som er dyrket under ikke-klæbende forhold, at generere neurosfærer. Størrelsen og antallet af neurosfærer afhænger af regionen (subventrikulær zone eller dentate gyrus) og køn prærien vole. Denne metode er et bemærkelsesværdigt værktøj til at studere kønsafhængige forskelle i neurogene nicher in vitro og neuroplasticitet ændringer forbundet med social adfærd såsom par limning og biparental pleje. Også, kognitive tilstande, der medfører underskud i sociale interaktioner (autisme spektrum forstyrrelser og skizofreni) kunne undersøges.
Introduction
Prærien vole (Microtus ochrogaster), et medlem af Cricetidae familien, er et lille pattedyr, hvis liv strategi udvikler sig som en socialt monogame og meget omgængelig art. Både hanner og hunner etablere en varig par obligation efter parring eller lange perioder med samliv karakteriseret ved at dele reden, forsvare deres område, og vise biparental pleje for deres afkom1,2,3,4. Således prærien vole er en værdifuld model for at forstå det neurobiologiske grundlag for socio-seksuel adfærd og funktionsnedsættelser i social kognition5.
Voksen neurogenese er en af de mest altoverskyggende processer neurale plasticitet, der fører til adfærdsmæssige ændringer. For eksempel rapporterede vores forskningsgruppe i hanvoles, at social samliv med parring øget celleprolifererende i subventrikulær zone (VZ) og subgranular zone i dentate gyrus (DG) af hippocampus, hvilket tyder på, at voksne neurogenese kan spille en rolle i dannelsen af par binding induceret ved parring i prærievoles (ikke-offentliggjorte data). På den anden side, selv om hjernen regioner, hvor nye neuroner er genereret og integreret er velkendte, de molekylære og cellulære mekanismer, der er involveret i disse processer forbliver ubestemt på grund af tekniske ulemper i hele hjernen model6. For eksempel har signalvejene, der styrer genekspression og andre cellulære aktiviteter, en relativt kort aktiveringsperiode (påvisning af fosforetom)7. En alternativ model er isolerede og dyrkede voksne neurale stamceller eller progenitor celler til at belyse molekylære komponenter involveret i voksne neurogenese.
Den første tilgang til at opretholde in vitro neurale prækursorer fra voksne pattedyr (mus) hjerne var analysen af neurosfærer, som er cellulære aggregater vokser under ikke-vedholdne forhold, som bevarer deres multipotente potentiale til at generere neuroner, samt astrocytter8,9,10. Under deres udvikling, er der en udvælgelsesproces, hvor kun prækursorer vil reagere på mitogener såsom Epidermal Vækstfaktor (EGF) og Fibroblast Vækstfaktor 2 (FGF2) at formere sig og generere neurosfærer8,9,10.
Så til vores viden, er ingen protokol rapporteret i litteraturen for at opnå voksne neurale forfædre fra prærie voles. Her etablerede vi kulturbetingelserne for at isolere neuronale forfædre fra neurogene nicher og deres in vitro vedligeholdelse gennem neurosphere formation assay. Således kan eksperimenter udformes til at identificere de molekylære og cellulære mekanismer, der er involveret i spredning, migration, differentiering og overlevelse af de neurale stamceller og forfædre, processer, der stadig er ukendte i prærien vole. Desuden belyse in vitro forskelle i egenskaberne af cellerne stammer fra VZ og DG kunne give oplysninger om den rolle, neurogene nicher i neurale plasticitet forbundet med ændringer i socio-seksuel adfærd og kognitiv adfærd, og underskud i sociale interaktioner (autisme spektrum lidelse og skizofreni), som også kunne være sex-afhængige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen blev godkendt af Forskningsetisk Komité under Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexico og Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). Dyrenes reproduktion, pleje og humane endepunkter blev etableret efter den officielle mexicanske standard (NOM-062-Z00-1999) baseret på "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (general health law for health research) fra den mexicanske Sundhedsminister.
1. Fremstilling af løsninger og lagre
- Forbered et N2-kulturmedium med 485 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium-F12 (DMEM-F12), 5 ml N2-supplement (100x), 5 ml glutamintilskud (100x) og 5 ml antibiotisk antimykotisk (100x).
- Forbered et B27-kulturmedium med 480 ml neurobasalt medium, 10 ml B27-supplement (50x), 5 ml glutamintilskud og 5 ml antimykotisk antimykotisk (100x).
- Rekonstituere collagenasepulver i 1x PBS (fosfat-bufferet saltvand) for at opnå aliquots med en aktivitet på 100 enheder/μL (1000x) og opbevares ved -20 °C. Bemærk, kollagenase aktivitet afhænger af partiets antal af virksomhederne.
- Forbered dispase lager aliquots ved at opløse 5 mg dispase pulver i 1x PBS (50 mg/ml). Opbevares ved -20 °C.
- Der forberedes en enzymatisk opløsning med 100 ml DMEM-F12-medium, 50 μL lagerlagen (100 enheder/μL) for at få en endelig koncentration på 50 U/ml og 333 μL lager dispase (50 mg/ml) for at have en endelig koncentration på 0,33 mg/ml.
- Til fremstilling af en vaskeopløsning til 1.000 ml 1x PBS tilsættes 0,4766 g HEPES (slutkoncentration 2 mM), 3,6 g D-glukose (slutkoncentration 20 mM) og 2,1 g NaHCO3 (slutkoncentration 25 mM).
- Der tilberedes poly-L-ornithinbestanden aliquots (1 mg/ml) med sterilt vand og opbevares ved -20 °C.
- Forbered en arbejdsopløsning af poly-L-ornithin. En bestand aliquot (1mg/ml) fortyndes i 49 ml sterilt vand til en endelig koncentration på 20 μg/ml.
- Forbered en fungerende løsning af laminin. 25 μL laminin (1 mg/ml originalt lager) fortyndes i 5 ml sterilt vand i en endelig koncentration på 5 μg/ml.
BEMÆRK: Efter klargøring filtreres kulturmedierne, arbejds- og lagerløsningerne for at undgå forurening. Brug en sprøjte eller flaskestøvsugerfiltre (polyethersulfonmembran med en 0,2 μm porestørrelse). Kulturmedierne og arbejdsløsningerne kan opbevares i op til 30 dage ved 4 °C, mens lagrene kan opbevares i op til fire måneder ved -20 °C.
2. Forberedelse før påbegynder mikrodissektionen
- Steriliser kirurgiske instrumenter ved autoclaving eller med en varm glas perle tør sterilisator.
- Rengør mikrodissektionsoverfladen under strenge aseptiske og antiseptiske forhold (f.eks. med ozoniseret vand).
BEMÆRK: Timingen af mikrodissektion af både neurogene nicher fra hver vole hjerne er ca 30 min. Det anbefales at arbejde med 1-4 dyr til hele proceduren.
3. Udvinding af hele hjernen
- Bedøve voksne vole (12-16 uger) med en overdosis af pentobarbital (6.3 mg/animal) gennem intraperitoneal injektion. Kontroller dybden af anæstesi ved fraværet af pedal refleks som reaktion på en fast tå knivspids.
- Når vole er helt bedøvet, fremkalde dødshjælp ved halshugning og inddrive hovedet.
- Disseker huden fra kraniet med en saks, hvilket gør en caudal-rostral snit (15 mm lang) for at afsløre kraniet.
- Skær occipital og interparietal knogler og spore et snit ind i kraniet langs sagittal og parietal suturer.
- Lav et hul i kraniet ved krydset af frontale og parietal knogler ved hjælp af en saks, være meget omhyggelig med ikke at beskadige hjernevæv.
- At udsætte hjernen, fjerne de resterende kranium fragmenter, der dækker både hjernehalvdel med skarp-spidse pincet.
- Brug en spatel i rustfrit stål til at løfte hele hjernen fra kraniebasen.
- Hjernen opsamls i et centrifugerør (50 ml) med 20 ml koldvaskopløsning.
- Vask hjernen to gange med koldvaskopløsningen.
4. Mikrodissektion af neurale væv
- Placer en petriskål på en overflade omgivet af is.
- Aflejr hjernen på fadet og tilsæt 20 ml koldvaskopløsning.
- Med en skalpel, i koronal flyet, opdele hjernen i to blokke af væv (rostral og hale. Som neuroanatomisk reference udføres koronalsnittet på Bregma-niveau i den forreste-bageste akse11 (Figur 1A, solid linje).
- Fra rostralblokken udtrækkes VZ-vævet (figur 1B), mens GD ( Figur 1C ) fjernes fra kredsblokken .
- Disseker VZ under et stereomikroskop.
- Med en Dumont-krafterne skal du holde en af halvkuglerne; derefter indsætte, på højden af hjertekammer, de fine spidser af en anden Dumont scer under vævet, der linjer caudate-putamen (Figur 2A).
- Åbn stang langs dorsoventral akse for at adskille vævet.
- VZ-vævet opsamls pr. person i et centrifugerør med 2 ml koldvaskopløsning. Du må ikke samle vævet på mere end to dyr.
- Gentag mikrodissektionen på den anden halvkugle.
- Rør, der indeholder det bilaterale VZ-væv på isen, opbevares, og GD fortsættes.
- Dissekere GD fra haleblokken under et stereomikroskop.
- Med en skalpel, lave en koronal skåret i blokken for at opnå to skiver, hvor hippocampal dannelse er observeret. Som et vartegn, er snittet lavet på -2 mm Bregma koordinater i den forreste-posterior akse i henhold til musen hjernen atlas11 (Figur 1A, stiplede linje og figur 1C).
- Med en Dumont-styrke skal du holde en af skiverne, og med fine Dumont-skær foretager dumont-skærene et horisontalt snit mellem GD og CA1 og udfører derefter et lodret snit mellem GD og CA3 for at adskille GD(figur 2B).
- Gentag dissektion i den første skive af den anden halvkugle.
- Gentag dissektion i begge halvkugler i den anden skive.
- Saml de fire DG stykker af hver vole i en centrifuge rør. GD-væv på mere end to dyr må ikke samles.
BEMÆRK: Hvis dissektion af mere end ét dyr er påkrævet, opbevares centrifugerørene sammen med VZ- eller DG-væv på is, mens resten af hjernen dissekerer. Fjern alle blodkar, der dækker hjernevævet, mens dissekere. Hvis fartøjerne ikke kasseres, kan kulturen blandes med et overskud af erythrocytter og forstyrre neurosfæredannelse.
5. Isolering af neurale celler
- Placer centrifugerørene inde i biosikkerhedsskabet, og vent ca. 10 minutter på, at vævsfragmenterne udfældes af tyngdekraften.
- Fjern vaskeopløsningen, og tilsæt 1 ml af den varme enzymatiske opløsning til hvert rør.
- Slangerne inkuberes ved 37 °C i 10 min.
- Udspn af vævsfragmenterne; pipette op og ned med en 1 ml spids. Må ikke pipette mere end 30x.
- Der foretages endnu en inkubation på 10 min ved 37 °C.
- I slutningen af den anden inkubation, pipette at bryde op væv. Må ikke pipette mere end 30x.
BEMÆRK: Efter pipettering skal vævsfragmenterne være fuldstændig opløst; hvis de ikke er opløst, inkuberes i yderligere 10 minutter ved 37 °C og re-pipette. Fordøjelsesperioden bør ikke overstige 30 min. - Der tilsættes 9 ml N2-medium pr. rør for at fortynde den enzymatiske behandling.
- Centrifuge rørene ved 200 x g i 4 min ved stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres, og der vaskes med 10 ml N2-medium.
- Centrifuge på samme betingelser som trin 5.8.
- Supernatanten fjernes fra hvert rør, og cellepillerene i VZ og DG opspjæls igen i henholdsvis 2 ml og 1 ml B27-mediet.
- For at fjerne ikke-opløst væv, filtrere hver cellulære suspension ved hjælp af en celle si (størrelse 40 μm).
6. Neurosfærer dannelse
- Kultur cellerne passerede gennem sien i en ultra-lav vedhæftet fil, 24-brønd plade. Brug to brønde til VZ og en brønd til GD (1 ml B27 medium/brønd).
- Der tilsættes 20 ng/ml FGF2 og 20 ng/ml EGF til hver brønd (slutkoncentration 1x).
- Inkubere ved 37 °C, 5% CO2 og høj luftfugtighed (90-95%). Forstyr ikke i 48 timer (dag 1 og dag 2 i kultur, D1-D2).
- På den tredje dag (D3) fjernes halvdelen af kulturmediet og erstattes med frisk B27-medium (500 μL pr. brønd) suppleret med dobbelt koncentration (2x) af vækstfaktorer.
- Gentag hver tredje dag, ændre kultur medium (halvdelen af det) og erstatte det med en frisk B27 medium suppleret med dobbelt koncentration (2x) af vækstfaktorer.
- På dage, hvor det ikke er nødvendigt at ændre kulturmediet, skal du tilføje vækstfaktorer til en endelig koncentration på 1x.
- Sørg for, at neurosfærerne dannes omkring D8-D10.
- På D10 skal du ændre hele kulturmediet for at fjerne alt snavs.
- Saml medium og neurosfærer individuelt af hver brønd i centrifuge rør.
- Inkuber i 10 min ved stuetemperatur. Denne procedure tillader neurosfærer nedbør ved tyngdekraften.
- Fjern supernatant og resuspend i 1 ml frisk B27 medium suppleret med vækstfaktorer.
- Neurosfærerne hældes tilbage i samme ultralave fastgørelsesplade og inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2.
- Fra D10 til D15 skal du fortsætte med at ændre halvdelen af mediet og tilføje vækstfaktorer.
7. Passage af neurosfærer
- På D15 af den primære kultur, indsamle neurosfærer i centrifuge rør ved hjælp af 1 ml pipette. Skær pipetten spidsen for at øge størrelsen af åbningen for at undgå skader på neurosfærer.
- Inkuber i 10 min ved stuetemperatur. Neurosfærer bundfalder af tyngdekraften.
- Fjern mediet og tilsæt 1 ml af celledeachmentsmediet pr. rør.
- Slangerne inkuberes i 7 min. ved 37 °C.
- Pipette op og ned med en 1 ml spids til at demontere neurosfærer.
- Celleudredtningsmediet fortyndes med 3 ml B27-medium pr. rør.
- Centrifuge celle suspension i 5 min ved 200 x g.
- Kassér supernatanten og opspjæn din cellepille igen med et frisk B27-medie suppleret med vækstfaktorer.
- Opslæmmede de VZ-afledte celler i 4 ml medium og DG-afledte celler i 2 ml medium.
- Cellerne (passage 1) kulturkultureres i en ny ultralav fastgørelsesplade ved at fordoble antallet af brønde, der blev brugt i den primære kultur (henholdsvis 4 og 2 brønde til VZ og GD).
- Skift halvdelen af mediet hver tredje dag og tilføje vækstfaktorer dagligt.
- Efter 10 dage (D10) i passage 1, ændre til overholdelse betingelser i den næste passage.
8. Passagen under overholdelse af betingelser
- Før passage 2 udføres, klargørs belagte plader med poly-L-ornithin og laminin.
- I 24-brønds plader tilsættes 500 μL 1x poly-L-ornithin (20 μg/ml) pr. brønd. Inkuberes ved 37 °C natten over.
- Poly-L-ornithin fjernes, og 4x vaskes med 1x PBS (500 μL/brønd).
- Der tilsættes 200 μL (mindste volumen til dækning af overfladen af en enkelt brønd) på 1x laminin (5 μg/ml) pr. brønd og inkuberes i 2-3 timer ved 37 °C, før cellerne dyrkes.
- Indsamle neurosfærer med 1 ml pipette med skåret tips i en centrifuge rør.
- Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur for at udfælde neurosfærerne ved tyngdekraften.
- Kassér supernatanten og resuspend neurosfærerne i frisk B27-medium uden vækstfaktorer.
- Aspirate laminin fra den belagte plade og deponere neurosfærer i brøndene ved hjælp af 1 ml pipetter med cut tips.
BEMÆRK: Undgå belagte brønde i at tørre ud mellem laminin fjernelse og plating neurosfærer. - Del kulturen op i to betingelser:
- Opretholde differentierede neurosfærer i 6 dage (D6). Skift mediet hver tredje dag og tilføje vækstfaktorer dagligt.
- Overhold differentiering af de neurosfærebaserede celler med 12 dage (D12). Skift mediet hver tredje dag uden vækstfaktorer.
BEMÆRK: Ved slutningen af D6 for udifferentieret eller D12 for differentiering betingelser, kan cellerne anvendes til konventionel immunohistokemi, cellesortering analyse, 5-Ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) farvning, RNA ekstraktion, blandt andre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neurosfærer blev dannet af neurale stamceller isoleret fra VZ og DG for både kvindelige og mandlige voksne prærie voles. Omkring 8-10 dage efter start af kulturen, celler bør have dannet neurosfærer. Bemærk, at pladen kan indeholde snavs i den primære kultur (Figur 3A). I passage 1 bør kulturen dog kun bestå af neurosfærer (figur 3B).
Et større antal neurosfærer blev opnået fra den kvindelige VZ sammenlignet med den mandlige VZ og DG for både hunner og hanner (figur 4A). Disse data tyder på, at antallet af neurosfærer opnået afhænger af proliferative zone og vole sex. Når neurosfærer dukkede op (D8-D10), de blev opretholdt i yderligere syv dage i kultur, og deres vækst blev overvåget i denne periode. Neurosfærernes diameter blev målt på D8, D11 og D14 (tabel 1 og figur 4B). Neurosfærens størrelse (diameter) steg gradvist i henhold til kulturens dage for mandlige og kvindelige voles i begge neuronale regioner. Neurosfærer afledt af de mandlige hjerner var mindre i forhold til de neurosfærer, der stammer fra den kvindelige hjerne i begge neurogene områder (Figur 4B).
Efter 15 dages primær kultur på flydende forhold blev neurosfærerne udvidet i passage 1 under de samme betingelser. For den efterfølgende passage 2 voksede cellerne i klæbekultur, selv om de var i stand til at holde sig siden passage 1. Genklæbede neurosfærer var karakteriseret ved dag seks (D6) i nærvær af vækstfaktorer (udifferentieret tilstand, figur 5A) eller i stedet indtil dag 15 (D15) uden vækstfaktorer (differentieret tilstand, figur 5B).
Ved D6 under udifferentieringsbetingelser udtrykte de neurosfærebaserede celler nestin (en markør for neurale forfædre) (Figur 6). Det var også muligt at identificere dobbeltkorcortin (DCX) positive celler (migrationsceller) og spredningsmarkøren Ki67, hvilket indikerer tilstedeværelsen af enten neuronale prækursorer eller umodne neuroner. Men manglen på colocalization af Ki67 med DCX tyder på tilstedeværelsen af postmitotiske neuroblaster (Figur 7). Endelig blev der ved D15 under differentieringsbetingelser fundet modne neuroner (MAP2-positive celler) samt celler med gliafetotype (GFAP-positive celler), som viser de isolerede cellers differentieringspotentiale (Figur 8).
Figur 1: Dorsal opfattelse af en voksen vole hjerne og dens neurogene regioner. (A) Den faste linje på Bregma niveau var den anatomiske reference til at adskille hjernen i to blokke, rostral og caudal. Den stiplede linje var henvisningen til at opdele haleblokken for at få to skiver, der indeholdt GD. (B)Koronal opfattelse af neuronal regioner eksponeret med det første snit, hvor VZ er placeret. C) Koronar-syn på de anatomiske regioner, der er eksponeret med det andet snit, hvor generaldirektoratet er beliggende. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Anatomiske referencer til dissektion af neurogene regioner. (A)Skema og fotografi af koronalsektionen fra rostralblokken, der viser VZ-placeringen (stiplet linje). b) Ordning og fotografi af koronarsektionen fra haleblokken, der viser GD dissektion. CPu, caudate putamen; V, hjertekammer; VZ, ventrikelzone, DG, dentate gyrus; CA1 og CA3, områder af hippocampus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative mikrografer af neurosfærer kultur stammer fra neurogene nicher af den voksne prærievole. (A)Primær kultur af neurosfærer isoleret fra VZ af kvindelige voles på D10. (B) Passage 1 af neurosfærer afledt af VZ af kvindelige voles på D10. Skalabarer = 200 μm. n= 3 for hver neurogen region og vole-køns. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Antallet og størrelsen af neurosfærer afhang af både køn og neurogene kilder. A) Antallet af neurosfærer i primærkulturen fra VZ og GD i både kvindelige og mandlige voles på D10. Data blev analyseret med en envejs ANOVA efterfulgt af en Tukey's post hoc-test. Der blev konstateret betydelige forskelle mellem den kvindelige VZ og resten af grupperne* ***p<0,001. (B) Diameteren af neurosfærer i hele D8-D14 i den primære kultur afhang af vole sex. Data blev analyseret med en tovejs ANOVA efterfulgt af Tukey's post hoc-tests. Sammenligninger inden for koncernen (forskelle inden for samme gruppe) viste en stigning i neurospherestørrelsen mellem D8 vs. D11 og D14, (*p<0,05, ***p<0,001, **p<0,0001); og D11 vs. D14 (+++ p<0.001) i VZ og DG for kvindelige og mandlige voles. Sammenligning mellem grupper (forskelle mellem grupper i samme region) viste, at kvindelige VZ- og GD-neurosfærer er større end mandlige neurosfærer ved D11 og D14. ### p<0.0001. VZ blev fremstillet af hanner og kvindelige voles (n=3 pr. gruppe). 15 kvindelige og 10 mandlige neurosfærer blev analyseret. GD blev indhentet fra hanner og kvindelige voles (n=3 pr. gruppe). 8 kvindelige neurosfærer og 5 mandlige neurosfærer blev behandlet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative billeder af neurosfærer afledt af den kvindelige VZ dyrket i vedhæftningsforhold i passage 2. (A) Neurosfærer overholdt i passage 2 med vækstfaktorer på D2. b) Neurosfære-afledte celler, der er tilklæbet i passage 2 uden vækstfaktorer ved D10. Skalalinje = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Ekspression af nestin i neurosfærer. Repræsentative, epifluorescens-mikroskopi billeder af nestin-positive celler stammer fra VZ af både kvindelige og mandlige voksne hjerner på det udifferentierede stadium. Skalabarer = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Ekspression af DCX og Ki67 i neurosfærer. Repræsentative epifluorescens-mikroskopi billeder af DCX-, Ki67-positive celler og fusionere stammer fra VZ af både voksne kvindelige og mandlige hjerner på den udifferentierede fase. Skalabarer = 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Ekspression af MAP2 og GFAP i neurosfærer. Repræsentative, epifluorescens-mikroskopi billeder af MAP2 (modne neuroner) og GFAP (gliaceller) positive celler stammer fra VZ af både voksne kvindelige og mandlige hjerner på det differentierede stadium. Skalabarer = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Størrelsen af neurosfærer (μm) | |||||
| Vz | Gd | ||||
| Kulturens dage | Køn | Gennemsnitlig ± SD | Kulturens dage | Køn | Gennemsnitlig ± SD |
| kr. | F | 102.1±18.2 | kr. | F | 55,3±8,5 |
| M | 86,5±15,1 | M | 37,6±6,8 | ||
| kr. | F | 217,3±35,7 | kr. | F | 142,1±15,4 |
| M | 158,9±47,2 | M | 71,8±14,4 | ||
| kr. | F | 306,6±44,4 | kr. | F | 243,8±37,4 |
| M | 210,8±42,3 | M | 120,2±19,1 | ||
Tabel 1: Kvantificering af neurosfærernes gennemsnitlige størrelse (diameter) isoleret fra neurogene nicher i den primære kultur. Væsentlige forskelle er vist i figur 4. VZ blev fremstillet af hanner og kvindelige voles (n=3 pr. gruppe). Femten neurosfærer fra kvinder og ti fra mænd blev analyseret. GD blev indhentet fra hanner og kvindelige voles (n=3 pr. gruppe). Otte kvindelige neurosfærer og fem mandlige neurosfærer blev behandlet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En fase for at opnå en neuralstamcellekultur er fordøjelsesperioden med den enzymatiske opløsning, som ikke bør overstige mere end 30 min. Neurosfærerne bør dukke op på 8-10 dage efter indledende kultur; hvis de ikke opstår ved dag 12, kasseres kulturen og gentager eksperimentet, hvilket reducerer fordøjelsesperioden. Et andet problem er de blodkar, der dækker hjernevæv. De bør fjernes helt under dissektionen, fordi overskuddet af erythrocytter kan forstyrre neurosfærerne dannelse.
Denne protokol gør det muligt at udvide de flydende neurosfærer indtil passage 2 og skifte til overholdelse betingelser for at evaluere neurosphere-afledte celler. Men, Det har begrænsninger såsom et fald i neurogene potentiale, som skifter til gliogen differentiering på successive passager som en tilpasning reaktion på in vitro betingelser12. Af denne grund anbefalede vi at karakterisere neurosfærer i den primære kultur og passage 1, og fortsætte med den næste passage, hvis det er nødvendigt at udvide cellerne til eksperimenter, der ikke indebærer belyse forskelle på grund af oprindelsen.
Interessant, iboende forskelle kan findes i den primære kultur neurosfærer som følge af neuroanatomiske (VZ eller DG) eller sex-afhængige (kvinder eller mænd) kilde. Således, antallet og diameteren af neurosfærer stammer fra begge neurogene regioner af kvinder er højere i forhold til mænd. Dette kunne være en funktionel forskel i den kvindelige hjerne niche i forhold til mænd, som molekylære mekanismer kan studeres in vitro med denne analyse.
Cellekultur af neurosfærer afledt af den voksne hjernevole er et værdifuldt værktøj, der kan hjælpe med at løse uoverensstemmelser mellem undersøgelser in vivo. F.eks. rapporterede Fowler og kolleger, at social isolation i 48 timer medfører en stigning i 5-Bromo-2'-deoxyuridin (BrdU)-positive celler i VZ, uden at det påvirker GD6. I modsætning hertil Lieberwirth et al.; viste et fald i cellespredningen i GD13. Desuden kan in vitro kultur være en model for evaluering af de molekylære mekanismer i neurogene regioner, der kunne være forbundet med adfærdsmæssige ændringer i en social model som prærien vole. F.eks. er det blevet foreslået, at eksponering for nyfødte i både ikke-forældre- og forældre-voles medfører en stigning i BrdU- positive celler i GD14. Resultaterne af denne undersøgelse kan bekræftes ved hjælp af vores cellekultur protokol med BrdU mærkning. Men selv om de fleste undersøgelser af voles og andre pattedyr bruger BrdU mærkning til at identificere nye celler, en ulempe er, at labbeling kan ændre sig afhængigt af de injicerede doser15. EdU, en anden thymidin analog, er et ideelt alternativ til at identificere celler under cellecyklus fase in vitro kulturer. I samme eksperiment er det muligt at have flere perioder til inkorporering af EdU, og i modsætning til BrdU, DNA-denaturering eller inkubation med antistoffer er det ikke nødvendigt for dets påvisning. Også, EdU-positive celler kan vurderes for co-lokalisering med markører til at identificere celle-division cyklus (Ki67) og bestemme deres fænotype ved hjælp af markører for neurale stamceller eller stamfader (Nestin, Sox2 og Pax6).
Den neurosfærer kultur kan etableres som en model til at studere effekten af hormoner, små molekyler eller narkotika i spredning sats, neurogenese og epigenetiske modifikationer i neurale stamceller og forfædre prærien voles. For eksempel, tidligere undersøgelser har foreslået den rolle, stresshormoner (som kortikosteron) og østrogener i reguleringen af voksne neurogenese i prærievoles, men de underliggende regulerende mekanismer erukendte 6.
Endelig autisme spektrum forstyrrelser (ASD) og skizofreni (SZ) er relateret til funktionsnedsættelser i social kognition16,17. Interessant, oxytocin og arginin-vasopressin har en grundlæggende rolle i social og følelsesmæssig adfærd, og genekspression variationer i deres receptorer (OXTR og vasopressin 1a (V1AR), henholdsvis) er forbundet med både ASD og SZ18,19,20,21. Desuden er ændring i neurogenese og neural migration under neuroudvikling impliceret i fysiopatologi af disse adfærdsmæssige lidelser22,23,24. Således foreslår vi at analysere de molekylære mekanismer medieret af disse hormoner på neurogenese, neural migration og andre cellulære begivenheder, hvis ændringer er relateret til neurologiske lidelser ved hjælp af prærievole cellekultur in vitro model på grund OXTR og V1AR receptorer findes i prærien vole hippocampus25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud CONACYT 252756 og 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 og IN203518; INPER 2018-1-163 og NIH P51OD11132. Vi takker Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris og Susana Castro for deres fremragende tekniske bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, Pt 1 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
