Summary
Establecimos las condiciones para cultivar células progenitoras neuronales de la zona subventricular y dennato gyrus del cerebro adulto de las praderas voles, como un estudio in vitro complementario, para analizar las diferencias dependientes del sexo entre nichos neurogénicos que podrían ser parte de los cambios plásticos funcionales asociados con los comportamientos sociales.
Abstract
Las neuroesferas son agregados de células primarias que comprenden células madre neurales y células progenitoras. Estas estructuras 3D son una excelente herramienta para determinar el potencial de diferenciación y proliferación de las células madre neurales, así como para generar líneas celulares que se pueden probar con el tiempo. Además, las neuroesferas pueden crear un nicho (in vitro) que permite el modelado del entorno de cambio dinámico, como factores de crecimiento variables, hormonas, neurotransmisores, entre otros. Microtus ochrogaster (prairie vole) es un modelo único para entender la base neurobiológica de los comportamientos socio-sexuales y la cognición social. Sin embargo, los mecanismos celulares involucrados en estos comportamientos no son bien conocidos. El protocolo tiene como objetivo obtener células progenitoras neuronales de los nichos neurogénicos de la pradera adulta vole, que se cultivan en condiciones no adherentes, para generar neuroesferas. El tamaño y el número de neuroesferas dependen de la región (zona subventricular o giro dentado) y el sexo de la pradera vole. Este método es una herramienta notable para estudiar las diferencias dependientes del sexo en nichos neurogénicos in vitro y los cambios de neuroplasticidad asociados con comportamientos sociales como la unión de pares y la atención biparental. Además, se podrían examinar las condiciones cognitivas que entrañan déficits en las interacciones sociales (trastornos del espectro autista y esquizofrenia).
Introduction
La pradera vole(Microtus ochrogaster), miembro de la familia Cricetidae, es un pequeño mamífero cuya estrategia de vida se desarrolla como una especie socialmente monógama y altamente sociable. Tanto los machos como las hembras establecen un vínculo de pareja duradero después del apareamiento o largos períodos de convivencia caracterizados por compartir el nido, defender su territorio, y mostrar cuidado biparental para su progenie1,2,3,4. Por lo tanto, la pradera vole es un modelo valioso para entender la base neurobiológica de la conducta socio-sexual y las deficiencias en la cognición social5.
La neurogénesis adulta es uno de los procesos más importantes de plasticidad neuronal que conduce a cambios de comportamiento. Por ejemplo, nuestro grupo de investigación informó en voles masculinos que la cohabitación social con el apareamiento aumentó la proliferación celular en la zona subventricular (VZ) y la zona subgranular en el giro dentado (DG) del hipocampo, lo que sugiere que la neurogénesis adulta puede desempeñar un papel en la formación de la unión de pareja inducida por el apareamiento en voles de praderas (datos inéditos). Por otro lado, aunque las regiones cerebrales donde se generan e integran nuevas neuronas son bien conocidas, los mecanismos moleculares y celulares implicados en estos procesos permanecen indeterminados debido a inconvenientes técnicos en todo el modelo cerebral6. Por ejemplo, las vías de señalización que controlan la expresión génica y otras actividades celulares tienen un período de activación relativamente corto (detección de fosfoproteoma)7. Un modelo alternativo son las células madre neurales adultas aisladas y cultivadas o las células progenitoras para dilucidar los componentes moleculares implicados en la neurogénesis adulta.
El primer enfoque para mantener precursores neuronales in vitro del cerebro de mamíferos adultos (ratón) fue el ensayo de neuroesferas, que son agregados celulares que crecen en condiciones no adherentes que preservan su potencial multipotente para generar neuronas, así como astrocitos8,9,10. Durante su desarrollo, existe un proceso de selección donde sólo los precursores responderán a mitógenos como el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y el Factor de Crecimiento fibroblasto 2 (FGF2) para proliferar y generar neuroesferas8,9,10.
Hasta nuestro conocimiento, no se informa de ningún protocolo en la literatura para obtener progenitores neuronales adultos de los voles de las praderas. Aquí, establecimos las condiciones de cultivo para aislar a los progenitores neuronales de nichos neurogénicos y su mantenimiento in vitro a través del ensayo de formación de neurosfera. Por lo tanto, los experimentos pueden ser diseñados para identificar los mecanismos moleculares y celulares involucrados en la proliferación, migración, diferenciación y supervivencia de las células madre neurales y progenitores, procesos que todavía se desconocen en la pradera vole. Además, el esclarecer las diferencias in vitro en las propiedades de las células derivadas de la VZ y la DG podría proporcionar información sobre el papel de los nichos neurogénicos en la plasticidad neuronal asociados con los cambios en el comportamiento socio-sexual y los comportamientos cognitivos, y los déficits en las interacciones sociales (trastorno del espectro autista y esquizofrenia), que también podrían ser sexualmente dependientes.
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Protocol
El estudio fue aprobado por el Comité de ética de la investigación del Instituto de Neurobiología, la Universidad Nacional Autónoma de México, México y el Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). La reproducción, cuidado y punto final humano de los animales se estableció siguiendo la Norma Oficial Mexicana (NOM-062-Z00-1999) basada en la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud.
1. Preparación de soluciones y existencias
- Preparar un medio de cultivo N2 con 485 ml de Dulbecco Modified Eagle Medium-F12 (DMEM-F12), 5 ml de suplemento de N2 (100x), 5 ml de suplemento de glutamina (100x) y 5 ml de antibiótico-antimiótico (100x).
- Preparar un medio de cultivo B27 con 480 ml de medio neurobasal, 10 ml de suplemento B27 (50x), 5 ml de suplemento de glutamina, y 5 ml de antibiótico-antimicótico (100x).
- Reconstituir el polvo de colagenasa en 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato) para obtener alícuotas con una actividad de 100 unidades/L (1000x) y almacenar a -20 oC. Aviso, la actividad de la colagenasa depende del número de lote de las empresas.
- Preparar alícuotas de stock dispase disolviendo 5 mg de polvo dispase en 1x PBS (50 mg/ml). Conservar a -20oC.
- Preparar una solución enzimática con 100 ml de medio DMEM-F12, 50 ml de colagenasa (100 unidades/L) para tener una concentración final de 50 U/ml y 333 l de riesgo de stock (50 mg/ml) para tener una concentración final de 0,33 mg/ml.
- Para preparar una solución de lavado, a 1.000 ml de 1x PBS, añadir 0,4766 g de HEPES (concentración final 2 mM), 3,6 g de D-glucosa (concentración final 20 mM) y 2,1 g de NaHCO3 (concentración final 25 mM).
- Preparar alícuotas de poli-L-ornitina (1 mg/ml) con agua estéril y almacenar a -20 oC.
- Preparar una solución de trabajo de poli-L-ornitina. Diluir una alícuota de stock (1mg/ml) en 49 ml de agua estéril para una concentración final de 20 g/ml.
- Preparar una solución de trabajo de laminin. Diluir 25 l de laminin (1 mg/ml de stock original) en 5 ml de agua estéril para una concentración final de 5 g/ml.
NOTA: Después de la preparación, filtre los medios de cultivo, el trabajo y las soluciones de stock para evitar la contaminación. Utilice una jeringa o filtros de vacío de tapa de botella (membrana de poliéermesulfone con un tamaño de poro de 0,2 m). Los medios de cultivo y las soluciones de trabajo se pueden almacenar durante un máximo de 30 días a 4 oC, mientras que las existencias se pueden almacenar durante un máximo de cuatro meses a -20 oC.
2. Preparación antes de iniciar la microdisección
- Esterilice los instrumentos quirúrgicos mediante autoclaves o con un esterilizador seco con cuentas de vidrio caliente.
- Limpie la superficie de microdisección bajo estrictas condiciones asépticas y antisépticas (por ejemplo, con agua ozonizada).
NOTA: El momento de la microdisección de ambos nichos neurogénicos de cada cerebro vole es de aproximadamente 30 min. Se recomienda trabajar con 1-4 animales durante todo el procedimiento.
3. Extracción de todo el cerebro
- Anestesiar la vole adulta (12-16 semanas) con una sobredosis de pentobarbital (6,3 mg/animal) mediante inyección intraperitoneal. Verifique la profundidad de la anestesia por la ausencia de reflejo del pedal en respuesta a un pellizco firme del dedo.
- Una vez que el vole está completamente anestesiado, inducir la eutanasia por decapitación y recuperar la cabeza.
- Disecciona la piel del cráneo con tijeras, haciendo una incisión caudal-rostral (15 mm de largo) para exponer el cráneo.
- Cortar los huesos occipitales e interparietales y trazar una incisión en el cráneo a lo largo de las suturas sagital y parietal.
- Hacer un agujero en el cráneo en la unión de los huesos frontales y parietales usando tijeras, teniendo mucho cuidado de no dañar el tejido cerebral.
- Para exponer el cerebro, retire los fragmentos de cráneo restantes que cubren ambos hemisferios cerebrales con pinzas puntiagudas.
- Usa una espátula de acero inoxidable para levantar todo el cerebro de la base craneal.
- Recoger el cerebro en un tubo centrífugo (50 ml) con 20 ml de solución de lavado en frío.
- Lave el cerebro dos veces con la solución de lavado en frío.
4. Microdisección del tejido neural
- Coloque un plato de Petri en una superficie rodeada de hielo.
- Depositar el cerebro en el plato y añadir 20 ml de solución de lavado en frío.
- Con un bisturí, en el plano coronal, divide el cerebro en dos bloques de tejido (rostral y caudal). Como referencia neuroanatómica, realice el corte coronal a nivel de Bregma en el eje anterior-posterior11 (Figura 1A, línea sólida).
- Del bloque rostral, extraiga el tejido VZ (Figura 1B), mientras que del bloque caudal retire la DG (Figura 1C).
- Disecciona el VZ bajo un microscopio estéreo.
- Con un fórceps Dumont, sostenga uno de los hemisferios; entonces, inserte, a la altura del ventrículo, las puntas finas de un segundo fórceps Dumont debajo del tejido que recuña el caudate-putamen (Figura 2A).
- Abra los fórceps a lo largo del eje dorsoventral para separar el tejido.
- Recoger el tejido VZ por individuo en un tubo centrífugo con 2 ml de solución de lavado en frío. No acose el tejido de más de dos animales.
- Repita la microdisección en el otro hemisferio.
- Almacene el tubo que contiene el tejido bilateral VZ sobre hielo y continúe diseccionando la DG.
- Diseccionar la DG del bloque caudal bajo un microscopio estéreo.
- Con un bisturí, haz un corte coronal en el bloque para obtener dos rodajas, en las que se observa la formación del hipocampo. Como punto de referencia, el corte se realiza en coordenadas Bregma de -2 mm en el eje anterior-posterior de acuerdo con el atlas cerebral del ratón11 (Figura 1A, línea punteada y Figura 1C).
- Con un fórceps Dumont, sostenga una de las rodajas, y con fórceps Dumont de punto fino realice un corte horizontal entre DG y CA1 y luego realice una incisión vertical entre la DG y CA3 para separar la DG (Figura 2B).
- Repita la disección en la primera porción del otro hemisferio.
- Repita la disección en ambos hemisferios en la segunda rebanada.
- Recoger las cuatro piezas DG de cada vole en un tubo centrífugo. No acomoda el tejido DG de más de dos animales.
NOTA: Si se requiere la disección de más de un animal, almacene los tubos centrífugos con el tejido VZ o DG sobre hielo mientras continúa diseccionando el resto de los cerebros. Retire todos los vasos sanguíneos que cubren el tejido cerebral mientras se disecciona. Si los vasos no se desechan, el cultivo podría mezclarse con un exceso de eritrocitos y perturbar la formación de neurosfera.
5. Aislamiento de las células neurales
- Coloque los tubos centrífugos dentro del gabinete de bioseguridad y espere unos 10 minutos para que los fragmentos de tejido se precipiten por gravedad.
- Retire la solución de lavado y añada 1 ml de la solución enzimática caliente a cada tubo.
- Incubar los tubos a 37oC durante 10 min.
- Desintegrar los fragmentos de tejido; pipeta arriba y abajo con una punta de 1 ml. No pipetee más de 30x.
- Realizar una segunda incubación de 10 min a 37oC.
- Al final de la segunda incubación, pipeta para romper los tejidos. No pipetee más de 30x.
NOTA: Después del pipeteo, los fragmentos de tejido deben desintegrarse por completo; si no se desintegran, incubar durante otros 10 minutos a 37oC y volver a pipetear. El período de digestión no debe exceder de 30 min. - Añadir 9 ml de medio N2 por tubo para diluir el tratamiento enzimático.
- Centrifugar los tubos a 200 x g durante 4 min a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante y lave con 10 ml de N2 medio.
- Centrifugar en las mismas condiciones que el paso 5.8.
- Retire el sobrenadante de cada tubo y resusppend los pellets celulares del VZ y DG en 2 ml y 1 ml del medio B27, respectivamente.
- Para eliminar cualquier tejido no desintegrado, filtre cada suspensión celular con un colador celular (tamaño 40 m).
6. Formación de neuroesferas
- Cultivo de las células pasaron a través del colador en un accesorio ultra bajo, placa de 24 pozos. Utilice dos pozos para el VZ y uno para la DG (1 mL de B27 medio/pozo).
- Añadir 20 ng/ml de FGF2 y 20 ng/mL de EGF a cada pozo (concentración final 1x).
- Incubar a 37oC, 5% CO2 y alta humedad (90-95%). No molestar durante 48 h (día 1 y día 2 de la cultura, D1-D2).
- En el tercer día (D3), retirar la mitad del medio de cultivo y reemplazarlo con un medio B27 fresco (500 ml por pozo) complementado con doble concentración (2x) de factores de crecimiento.
- Repetir cada tercer día, cambiar el medio de cultivo (la mitad de él) y reemplazarlo con un medio B27 fresco complementado con doble concentración (2x) de factores de crecimiento.
- En los días en que no es necesario cambiar el medio de cultivo, añadir factores de crecimiento a una concentración final de 1x.
- Asegúrese de que las neuroesferas se forman alrededor de D8-D10.
- En el D10, cambie el medio de cultivo completo para eliminar todos los desechos.
- Recoger el medio y las neuroesferas individualmente de cada pozo en tubos centrífugos.
- Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Este procedimiento permite a las neuroesferas precipitar por gravedad.
- Retire el sobrenadante y resuspend en 1 ml de medio B27 fresco complementado con factores de crecimiento.
- Colocar las neuroesferas de nuevo en la misma placa de fijación ultrabaja e incubar a 37 oC, 5% CO2.
- De D10 a D15, continúe cambiando la mitad del medio y añadiendo factores de crecimiento.
7. Pasaje de las neuroesferas
- En D15 del cultivo primario, recoger las neuroesferas en tubos de centrífuga utilizando pipeta de 1 ml. Corte la punta de la pipeta para aumentar el tamaño de la abertura para evitar daños a las neuroesferas.
- Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Las neuroesferas se precipitan por gravedad.
- Retire el medio y agregue 1 ml del medio de desprendimiento de la célula por tubo.
- Incubar los tubos durante 7 min a 37oC.
- Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una punta de 1 ml para desmantelar las neuroesferas.
- Diluir el medio de desprendimiento celular con 3 ml de medio B27 por tubo.
- Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 200 x g.
- Deseche el sobrenadante y resusppend cada pellet celular con un medio B27 fresco complementado con factores de crecimiento.
- Resuspender las células derivadas de VZ en 4 ml de células medianas y las células derivadas DG en 2 ml de medio.
- Cultivo de las células (paso 1) en una nueva placa de fijación ultrabajo duplicando el número de pozos que se utilizaron en el cultivo primario (4 y 2 pozos para VZ y DG, respectivamente).
- Cambia la mitad del medio cada tercer día y añade factores de crecimiento diariamente.
- Después de 10 días (D10) en el pasaje 1, cambie a las condiciones adherentes en el siguiente pasaje.
8. El paso en condiciones adherentes
- Antes de llevar a cabo el pasaje 2, preparar las placas recubiertas con poli-L-ornitina y laminina.
- En placas de 24 pocillos, agregue 500 l de 1x de poli-l-ornitina (20 g/ml) por pozo. Incubar a 37oC durante la noche.
- Retire la poli-L-ornitina y lave 4x con 1 pbS (500 l/pozo).
- Añadir 200 l (volumen mínimo para cubrir la superficie de un solo pozo) de 1x laminin (5 g/ml) por pozo e incubar durante 2-3 h a 37 oC antes de cultivar las células.
- Recoger las neuroesferas con 1 mL pipeta con puntas cortadas en un tubo de centrífuga.
- Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente para precipitar las neuroesferas por gravedad.
- Deseche el sobrenadante y resuspender las neuroesferas en medio B27 fresco sin factores de crecimiento.
- Aspirar la laminina de la placa recubierta y depositar las neuroesferas en los pozos utilizando pipetas de 1 ml con puntas cortadas.
NOTA: Evite que los pozos recubiertos se sequen entre la extracción de laminina y las neuroesferas de chapado. - Divida la cultura en dos condiciones:
- Mantener neuroesferas diferenciadas durante 6 días (D6). Cambiar el medio cada tercer día y añadir factores de crecimiento todos los días.
- Observe la diferenciación de las células derivadas de la neurosfera por 12 días (D12). Cambiar el medio cada tercer día sin factores de crecimiento.
NOTA: Al final de D6 para indiferenciadas o D12 para condiciones de diferenciación, las células se pueden utilizar para inmunohistoquímica convencional, análisis de clasificación celular, tinción de 5-Ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU), extracción de ARN, entre otros.
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Representative Results
Las neuroesferas se formaron a partir de células madre neurales aisladas del VZ y DG de los voles de las praderas adultas femeninas y masculinas. Alrededor de 8-10 días después de iniciar el cultivo, las células deben haber formado las neuroesferas. Tenga en cuenta que la placa puede contener residuos en el cultivo primario (Figura 3A). Sin embargo, en el paso 1 el cultivo sólo debe consistir en neuroesferas(Figura 3B).
Se obtuvo un mayor número de neuroesferas de la VZ femenina en comparación con el VZ masculino y la DG de mujeres y machos (Figura 4A). Estos datos sugieren que el número de neuroesferas obtenidas depende de la zona proliferativa y del sexo vole. Una vez que aparecieron las neuroesferas (D8-D10), se mantuvieron durante otros siete días en el cultivo, y su crecimiento fue monitoreado durante este período. El diámetro de las neuroesferas se midió en D8, D11 y D14(Tabla 1 y Figura 4B). El tamaño de la neurosfera (diámetro) aumentó progresivamente según los días de cultivo para los voles masculinos y femeninos en ambas regiones neuronales. Las neuroesferas derivadas de los cerebros masculinos eran más pequeñas en comparación con las neuroesferas derivadas del cerebro femenino en ambas áreas neurogénicas(Figura 4B).
Después de 15 días de cultivo primario en condiciones flotantes, las neuroesferas se expandieron en el paso 1 bajo las mismas condiciones. Para el siguiente pasaje 2, las células crecieron en cultivo adhesivo, aunque fueron capaces de adherirse desde el paso 1. Las neuroesferas adheridas se caracterizaron en el sexto día (D6) en presencia de factores de crecimiento (condición indiferenciada, Figura 5A)o en su lugar hasta el día 15 (D15) sin factores de crecimiento (condición diferenciada, Figura 5B).
En D6 en condiciones de indiferenciación, las células derivadas de la neurosfera expresaron nestina (un marcador para los progenitores neuronales) (Figura 6). Además, fue posible identificar células positivas de doblecortina (DCX) (células de migración) y el marcador de proliferación Ki67, que indican la presencia de precursores neuronales o neuronas inmaduras. Sin embargo, la falta de colocación de Ki67 con DCX sugiere la presencia de neuroblastos postmitoticos(Figura 7). Finalmente, en D15 en condiciones de diferenciación, se encontraron neuronas maduras (células positivas MAP2), así como células con el fenotipo glial (células positivas GFAP), lo que demuestra el potencial de diferenciación de las células aisladas (Figura 8).
Figura 1: Vista dorsal de un cerebro vole adulto y sus regiones neurogénicas. (A) La línea sólida a nivel de Bregma fue la referencia anatómica para separar el cerebro en dos bloques, rostral y caudal. La línea punteada era la referencia para dividir el bloque caudal para obtener dos sectores que contienen la DG. (B) Vista coronal de las regiones neuronales expuestas con la primera incisión, donde se encuentra la VZ. (C) Vista coronal de las regiones anatómicas expuestas con la segunda incisión, donde se encuentra la DG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Referencias anatómicas para la disección de regiones neurogénicas. (A) Esquema y fotografía de la sección coronal del bloque rostral que muestra la ubicación VZ (línea de puntos). (B) Esquema y fotografía de la sección coronal del bloque caudal que muestra la disección de la DG. CPu, putamen caudate; V, ventrículo; VZ, zona ventricular, DG, abollar el giro; CA1 y CA3, regiones del hipocampo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Micrografías representativas del cultivo de neuroesferas derivadas de nichos neurogénicos de la pradera adulta vole. (A) Cultivo primario de neuroesferas aisladas del VZ de voles femeninos en D10. (B) Paso 1 de las neuroesferas derivadas de la VZ de las voles femeninas en D10. Barras de escala de 200 m. no 3 para cada región neurogénica y sexo de la voluntad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El número y el tamaño de las neuroesferas dependían tanto del sexo como de la fuente neurogénica. (A) El número de neuroesferas en el cultivo primario obtenidas de VZ y DG en voles femeninos y masculinos en D10. Los datos fueron analizados con un ANOVA unidireccional seguido de las pruebas post hoc de un Tukey. Se encontraron diferencias significativas entre la VZ femenina y el resto de los grupos, ***p<0.001. (B) El diámetro de las neuroesferas a lo largo de D8-D14 en el cultivo primario dependía del sexo vole. Los datos fueron analizados con un ANOVA bidireccional seguido de las pruebas post hoc de Tukey. Las comparaciones intragrupo (diferencias dentro del mismo grupo) mostraron un aumento en el tamaño de la neurosfera entre D8 frente a D11 y D14, (*p<0.05, ***p<0.001, **p<0.0001); y D11 frente a D14 (+++ p<0.001) en el VZ y DG de voles femeninos y masculinos. La comparación entre grupos (diferencias entre grupos de la misma región) mostró que las neuroesferas femeninas VZ y DG son más grandes que las neuroesferas masculinas en D11 y D14. • p<0.0001. VZ se obtuvo de los voles masculinos y femeninos (n-3, por grupo). Se analizaron 15 neuroesferas femeninas y 10 masculinas. DG se obtuvo de los voles masculinos y femeninos (n-3, por grupo). Se procesaron 8 neuroesferas femeninas y 5 neuroesferas masculinas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes representativas de neuroesferas derivadas de la VZ femenina cultivada en condiciones de adhesión en el paso 2. (A) Neuroesferas adheridas en el pasaje 2 con factores de crecimiento en D2. (B) Células derivadas de la neurosfera adheridas en el paso 2 sin factores de crecimiento en D10. Barra de escala de 200 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Expresión de la nestina en las neuroesferas. Imágenes representativas de la epifluorescencia-microscopía de células nestin-positivas derivadas de la VZ de cerebros adultos hembras y machos en la etapa indiferenciada. Barras de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Expresión de DCX y Ki67 en neuroesferas. Imágenes representativas de epifluorescencia-microscopía de células DCX-, Ki67-positivas y se fusionan derivadas de la VZ de cerebros femeninos y masculinos adultos en la etapa indiferenciada. Barras de escala a 25 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Expresión de MAP2 y GFAP en neuroesferas. Imágenes representativas de la epifluorescencia-microscopía de células positivas MAP2 (neuronas maduras) y GFAP (células gliales) derivadas de la VZ de cerebros femeninos y masculinos adultos en la etapa diferenciada. Barras de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Tamaño de las neuroesferas (m) | |||||
| Vz | Dg | ||||
| Días de cultura | Sexo | Media ± SD | Días de cultura | Sexo | Media ± SD |
| D8 | F | 102.1±18.2 | D8 | F | 55.3±8.5 |
| M | 86.5±15.1 | M | 37.6±6.8 | ||
| D11 | F | 217.3±35.7 | D11 | F | 142.1±15.4 |
| M | 158.9±47.2 | M | 71,8±14,4 | ||
| D14 | F | 306.6±44.4 | D14 | F | 243.8±37.4 |
| M | 210.8±42.3 | M | 120.2±19.1 | ||
Tabla 1: Cuantificación del tamaño medio (diámetro) de las neuroesferas aisladas de nichos neurogénicos en el cultivo primario. Las diferencias significativas se muestran en la Figura 4. VZ se obtuvo de los voles masculinos y femeninos (n-3, por grupo). Se analizaron quince neuroesferas de mujeres y diez de machos. DG se obtuvo de los voles masculinos y femeninos (n-3, por grupo). Se procesaron ocho neuroesferas femeninas y cinco neuroesferas masculinas.
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Discussion
Una etapa para obtener un cultivo de células madre neurales es el período de digestión con la solución enzimática, que no debe exceder más de 30 min porque podría disminuir la viabilidad celular. Las neuroesferas deben emerger a los 8-10 días después del cultivo inicial; si no emergen en el día 12, deseche el cultivo y repita el experimento, reduciendo el período de digestión. Otro problema son los vasos sanguíneos que cubren el tejido cerebral. Deben eliminarse por completo durante la disección porque el exceso de eritrocitos puede interferir con la formación de las neuroesferas.
Este protocolo permite expandir las neuroesferas flotantes hasta el paso 2 y cambiar a condiciones adherentes para evaluar las células derivadas de la neurosfera. Sin embargo, tiene limitaciones como una disminución del potencial neurogénico, que cambia a la diferenciación gliogénica en pasajes sucesivos como respuesta de adaptación a las condiciones in vitro12. Por esta razón, recomendamos caracterizar las neuroesferas en el cultivo primario y el pasaje 1, y continuar con el siguiente pasaje sólo si es necesario expandir las células para experimentos que no impliquen diferencias aclarantes debido al origen.
Curiosamente, las diferencias intrínsecas se pueden encontrar en el cultivo primario de las neuroesferas como resultado de la fuente neuroanatómica (VZ o DG) o dependiente del sexo (mujeres o machos). Por lo tanto, el número y el diámetro de las neuroesferas derivadas de ambas regiones neurogénicas de las hembras son más altos en comparación con los machos. Esto podría ser una diferencia funcional en el nicho cerebral femenino en comparación con el de los machos, que los mecanismos moleculares se pueden estudiar in vitro con este ensayo.
El cultivo celular de las neuroesferas derivadas del vole cerebral adulto es una herramienta valiosa que podría ayudar a resolver las discrepancias entre los estudios in vivo. Por ejemplo, Fowler y sus compañeros de trabajo informaron que el aislamiento social durante 48 h induce un aumento de las células 5-Bromo-2'-desoxiuridina (BrdU)-positivas en la VZ, sin afectar a la DG6. Por el contrario, Lieberwirth et al.; de la DG13ha demostrado una disminución de la proliferación celular. Además, el cultivo in vitro puede ser un modelo para evaluar los mecanismos moleculares en regiones neurogénicas que podrían estar asociados con cambios de comportamiento en un modelo social como la pradera vole. Por ejemplo, se ha sugerido que la exposición a los recién nacidos induce, tanto en los voles no parentales como en los de los padres, un aumento de las células positivas de BrdU en la DG14. Los resultados de este estudio se pueden confirmar utilizando nuestro protocolo de cultivo celular con etiquetado BrdU. Sin embargo, aunque la mayoría de los estudios sobre voles y otros mamíferos utilizan el etiquetado BrdU para identificar nuevas células, una desventaja es que el labbeling podría cambiar dependiendo de las dosis inyectadas15. EdU, otro análogo de timidina, es una alternativa ideal para identificar células bajo la fase del ciclo celular cultivos in vitro. En el mismo experimento, es posible tener varios períodos para la incorporación de EdU, y a diferencia de BrdU, desnaturalización del ADN o incubación con anticuerpos no es necesario para su detección. Además, las células EdU positivas se pueden evaluar para la co-localización con marcadores para identificar el ciclo de división celular (Ki67) y determinar su fenotipo utilizando marcadores de células madre neurales o progenitores (Nestin, Sox2 y Pax6).
El cultivo de neuroesferas se puede establecer como un modelo para estudiar el efecto de las hormonas, moléculas pequeñas o fármacos en la tasa de proliferación, neurogénesis y modificaciones epigenéticas en las células madre neurales y progenitores de los voles de la pradera. Por ejemplo, estudios anteriores han sugerido el papel de las hormonas del estrés (como la corticosterona) y los estrógenos en la regulación de la neurogénesis adulta en los voles de las praderas, pero los mecanismos reguladores subyacentes son desconocidos6.
Por último, los trastornos del espectro autista (TEA) y la esquizofrenia (SZ) están relacionados con deficiencias en la cognición social16,17. Curiosamente, la oxitocina y la arginina-vasopresina tienen un papel fundamental en el comportamiento social y emocional, y las variaciones de expresión génica en sus receptores (OXTR y vasopressina 1a (V1AR), respectivamente) se asocian con ASD y SZ18,19,20,21. Además, la alteración de la neurogénesis y la migración neuronal durante el neurodesarrollo están implicadas en la fisiopatología de estos trastornos conductuales22,23,24. Así, proponemos analizar los mecanismos moleculares mediados por estas hormonas sobre neurogénesis, migración neuronal y otros eventos celulares cuyas alteraciones están relacionadas con trastornos neurológicos utilizando el cultivo celular de la pradera vole in vitro modelo debido a los receptores OXTR y V1AR se encuentran en la pradera vole hipocampo25,26.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por las subvenciones CONACYT 252756 y 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 e IN203518; INPER 2018-1-163 y NIH P51OD11132. Agradecemos a Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernández, Jessica Norris y Susana Castro por su excelente asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
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