Summary
Estabelecemos as condições para cultivar células progenitoras neurais da zona subventricular e do giro dento do cérebro adulto de voles de pradaria, como um estudo in vitro complementar, para analisar as diferenças sex-dependentes entre nichos neurogênicos que poderiam fazer parte de mudanças plásticas funcionais associadas aos comportamentos sociais.
Abstract
Neurosferas são agregados de células primárias que compreendem células-tronco neurais e células progenitoras. Essas estruturas 3D são uma excelente ferramenta para determinar o potencial de diferenciação e proliferação de células-tronco neurais, bem como para gerar linhas celulares do que pode ser avaliado ao longo do tempo. Além disso, as neurosferas podem criar um nicho (in vitro) que permite a modelagem do ambiente de mudança dinâmica, como diferentes fatores de crescimento, hormônios, neurotransmissores, entre outros. Microtus ochrogaster (pradaria vole) é um modelo único para compreender a base neurobiológica dos comportamentos sociosexual e da cognição social. No entanto, os mecanismos celulares envolvidos nesses comportamentos não são bem conhecidos. O protocolo visa obter células progenitoras neurais dos nichos neurogênicos do vole da pradaria adulta, que são cultivadas sob condições não aderentes, para gerar neurosferas. O tamanho e o número de neurosferas dependem da região (zona subventricular ou giro dento) e sexo do vole da pradaria. Este método é uma ferramenta notável para estudar diferenças dependentes do sexo em nichos neurogênicos in vitro e as mudanças de neuroplasticidade associadas a comportamentos sociais como a união de pares e cuidados biparentais. Além disso, poderiam ser examinadas condições cognitivas que acarretam déficits nas interações sociais (transtornos do espectro autista e esquizofrenia).
Introduction
O vole da pradaria (Microtus ochrogaster), um membro da família Cricetidae, é um pequeno mamífero cuja estratégia de vida se desenvolve como uma espécie socialmente monogâmous e altamente sociável. Tanto os machos quanto as fêmeas estabelecem um vínculo de par duradouro após o acasalamento ou longos períodos de convivência caracterizados pela partilha do ninho, pela defesa de seu território e pela exibição de cuidados biparentais para sua prole1,2,3,4. Assim, o vole pradaria é um modelo valioso para a compreensão da base neurobiológica do comportamento sociosexual e das deficiências na cognição social5.
Neurogênese adulta é um dos processos mais primordiais da plasticidade neural que leva a mudanças comportamentais. Por exemplo, nosso grupo de pesquisa relatou em voles masculinos que a coabitação social com o acasalamento aumentou a proliferação celular na zona subventricular (VZ) e na zona subgranular no giro dentado (DG) do hipocampo, sugerindo que a neurogênese adulta pode desempenhar um papel na formação de laços induzidos pelo acasalamento em voles de pradaria (dados inéditos). Por outro lado, embora as regiões cerebrais onde novos neurônios são gerados e integrados sejam bem conhecidas, os mecanismos moleculares e celulares envolvidos nesses processos permanecem indeterminados devido a desvantagens técnicas em todo o modelo cerebral6. Por exemplo, as vias de sinalização que controlam a expressão genética e outras atividades celulares têm um período de ativação relativamente curto (detecção de fosfoproteome)7. Um modelo alternativo são células-tronco neurais adultas isoladas e cultivadas ou células progenitoras para elucidar componentes moleculares envolvidos na neurogênese adulta.
A primeira abordagem para manter precursores neurais in vitro do cérebro de mamíferos adultos (camundongos) foi o ensaio das neurosferas, que são agregados celulares crescendo sob condições não aderentes que preservam seu potencial multipotente para gerar neurônios, bem como astrócitos8,9,10. Durante seu desenvolvimento, há um processo seletivo onde apenas os precursores responderão a mitogênios como o Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) e o Fator de Crescimento do Fibroblasto 2 (FGF2) para proliferar e gerar neuroesferas8,9,10.
Pelo que sabemos, nenhum protocolo é relatado na literatura para obter progenitores neurais adultos de voles pradarias. Aqui, estabelecemos as condições de cultura para isolar progenitores neuronais de nichos neurogênicos e sua manutenção in vitro através do ensaio de formação da neurosfera. Assim, os experimentos podem ser projetados para identificar os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na proliferação, migração, diferenciação e sobrevivência das células-tronco neurais e progenitores, processos que ainda são desconhecidos na pradaria. Além disso, a elucidação de diferenças in vitro nas propriedades das células derivadas do VZ e DG poderia fornecer informações sobre o papel dos nichos neurogênicos na plasticidade neural associados a mudanças no comportamento sociosexual e comportamentos cognitivos, e déficits nas interações sociais (transtorno do espectro autista e esquizofrenia), que também poderiam ser dependentes do sexo.
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Protocol
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, México e Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). A reprodução, o cuidado e os pontos finais humanos dos animais foram estabelecidos seguindo a Norma Oficial Mexicana (NOM-062-Z00-1999) com base no "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (Lei Geral de Saúde para Pesquisa em Saúde) da Secretaria de Saúde mexicana.
1. Preparação de soluções e ações
- Prepare um meio de cultura N2 com 485 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium-F12 (DMEM-F12), 5 mL de suplemento N2 (100x), 5 mL de suplemento de glutamina (100x) e 5 mL de antibiótico-antimicomicotico (100x).
- Prepare um meio de cultura B27 com 480 mL de neurobásico médio, 10 mL de suplemento B27 (50x), 5 mL de suplemento de glutamina e 5 mL de antibiótico-antimíctico (100x).
- Reconstituir pó de colagenase em 1x PBS (salina tamponada com fosfato) para obter alíquotas com uma atividade de 100 unidades/μL (1000x) e armazenar a -20 °C. Observe que a atividade de colagem depende do número de lotes das empresas.
- Prepare as alíquotas de estoque desaparo dissolvendo 5 mg de pó despase em 1x PBS (50 mg/mL). Armazenar a -20 °C.
- Prepare uma solução enzimática com 100 mL de média DMEM-F12, 50 μL de colagem de estoque (100 unidades/μL) para ter uma concentração final de 50 U/mL e 333 μL de dispase de estoque (50 mg/mL) para ter uma concentração final de 0,33 mg/mL.
- Para preparar uma solução de lavagem, a 1.000 mL de 1x PBS, adicione 0,4766 g de HEPES (concentração final de 2 mM), 3,6 g de D-glicose (concentração final de 20 mM) e 2,1 g de NaHCO3 (concentração final de 25 mM).
- Prepare alíquotas de estoque poli-L-ornithine (1 mg/mL) usando água estéril e armazene a -20 °C.
- Prepare uma solução de trabalho de poli-L-ornithine. Diluir uma alíquota de estoque (1mg/mL) em 49 mL de água estéril para uma concentração final de 20 μg/mL.
- Prepare uma solução de trabalho de laminina. Diluir 25 μL de laminina (1 mg/mL de estoque original) em 5 mL de água estéril para uma concentração final de 5 μg/mL.
NOTA: Após a preparação, filtre as soluções de mídia de cultura, trabalho e estoque para evitar contaminação. Use uma seringa ou filtros de vácuo de tampa de garrafa (membrana polietroésulfone com um tamanho de poro de 0,2 μm). Os meios de cultura e as soluções de trabalho podem ser armazenados por até 30 dias a 4 °C, enquanto os estoques podem ser armazenados por até quatro meses a -20 °C.
2. Preparação antes de iniciar a microdisseção
- Esterilize os instrumentos cirúrgicos por autoclaving ou com um esterilizador seco de contas de vidro quente.
- Limpe a área da superfície de microdisseção sob rigorosas condições assépticas e antissépticas (por exemplo, com água ozonizada).
NOTA: O tempo de microdisseção de ambos os nichos neurogênicos de cada cérebro de vole é de aproximadamente 30 minutos. Recomenda-se trabalhar com 1-4 animais para todo o procedimento.
3. Extração de todo o cérebro
- Anestesiar o vole adulto (12-16 semanas) com uma overdose de pentobarbital (6,3 mg/animal) através de injeção intraperitoneal. Verifique a profundidade da anestesia pela ausência de reflexo do pedal em resposta a uma pitada firme do dedo do pé.
- Uma vez que o vole é inteiramente anestesiado, induzir eutanásia por decapitação e recuperar a cabeça.
- Dissecar a pele do crânio com uma tesoura, fazendo uma incisão caudal-rostral (15 mm de comprimento) para expor o crânio.
- Corte os ossos occipital e interparietal e trace uma incisão no crânio ao longo das suturas sagital e parietal.
- Faça um buraco no crânio na junção de ossos frontais e parietal usando uma tesoura, tendo muito cuidado para não danificar o tecido cerebral.
- Para expor o cérebro, remova os fragmentos de crânio restantes que cobrem ambos os hemisférios cerebrais com pinças afiadas.
- Use uma espátula de aço inoxidável para levantar todo o cérebro da base craniana.
- Colete o cérebro em um tubo de centrífuga (50 mL) com 20 mL de solução de lavagem a frio.
- Lave o cérebro duas vezes com a solução de lavagem a frio.
4. Microdisseção do tecido neural
- Coloque uma placa de Petri em uma superfície cercada de gelo.
- Deposite o cérebro no prato e adicione 20 mL de solução de lavagem a frio.
- Com um bisturi, no plano coronal, divida o cérebro em dois blocos de tecido (rostral e caudal). Como referência neuroanatomética, realize o corte coronal no nível de Bregma no eixo anterior-posterior11 (Figura 1A, linha sólida).
- Do bloco rostral, extraia o tecido VZ(Figura 1B),enquanto do bloco caudal remover o DG(Figura 1C).
- Dissecar o VZ sob um microscópio estéreo.
- Com um fórceps Dumont, segure um dos hemisférios; em seguida, insira, na altura do ventrículo, as pontas finas de um segundo fórceps Dumont sob o tecido que reveste o caudate-putamen(Figura 2A).
- Abra os fórceps ao longo do eixo dorsoventral para separar o tecido.
- Colete o tecido VZ por indivíduo em um tubo de centrífuga com 2 mL de solução de lavagem a frio. Não acumule o tecido de mais de dois animais.
- Repita a microdisseção no outro hemisfério.
- Armazene o tubo contendo o tecido VZ bilateral no gelo e continue dissecando o DG.
- Dissecar o DG do bloco caudal sob um microscópio estéreo.
- Com um bisturi, faça um corte coronal no bloco para obter duas fatias, nas quais a formação hipocampal é observada. Como marco, o corte é feito a coordenadas de -2 mm Bregma no eixo anterior-posterior de acordo com o cérebro do camundongo atlas11 (Figura 1A, linha pontilhada e Figura 1C).
- Com um fórceps Dumont, segure uma das fatias, e com fórceps Dumont de ponta fina fazem um corte horizontal entre DG e CA1 e, em seguida, realizam uma incisão vertical entre o DG e o CA3 para separar o DG (Figura 2B).
- Repita a dissecção na primeira fatia do outro hemisfério.
- Repita a dissecção em ambos os hemisférios na segunda fatia.
- Colete os quatro pedaços de DG de cada vole em um tubo de centrífuga. Não acumule o tecido DG de mais de dois animais.
NOTA: Se for necessária dissecção de mais de um animal, armazene os tubos de centrífugas com o tecido VZ ou DG no gelo enquanto continua a dissecar o resto do cérebro. Remova todos os vasos sanguíneos que cobrem o tecido cerebral enquanto dissecam. Se os vasos não forem descartados, a cultura pode ser misturada com um excesso de eritrócitos e perturbar a formação da neurosfera.
5. Isolamento de células neurais
- Coloque os tubos de centrífugas dentro do armário de biossegurança e espere cerca de 10 minutos para que os fragmentos de tecido precipitam pela gravidade.
- Remova a solução de lavagem e adicione 1 mL da solução enzimática quente a cada tubo.
- Incubar os tubos a 37 °C por 10 min.
- Desintegrar os fragmentos teciduais; pipeta para cima e para baixo com uma ponta de 1 mL. Não pipeta mais de 30x.
- Realizar uma segunda incubação de 10 min a 37 °C.
- No final da segunda incubação, pipeta para quebrar os tecidos. Não pipeta mais de 30x.
NOTA: Após a pipetação, os fragmentos de tecido devem ser completamente desintegrados; se eles não forem desintegrados, incubar por mais 10 min a 37 °C e re-pipeta. O período de digestão não deve exceder 30 minutos. - Adicione 9 mL de N2 médio por tubo para diluir o tratamento enzimático.
- Centrifugar os tubos a 200 x g por 4 min a temperatura ambiente.
- Descarte o supernaspe e lave com 10 mL de meio N2.
- Centrífuga sob as mesmas condições do passo 5.8.
- Remova o supernascedor de cada tubo e resuspenja as pelotas celulares do VZ e DG em 2 mL e 1 mL do meio B27, respectivamente.
- Para remover qualquer tecido não desintegrado, filtre cada suspensão celular usando um coador celular (tamanho 40 μm).
6. Formação de neuroesferas
- Cultura as células passaram através do coador em um acessório ultra-baixo, placa de 24 poços. Use dois poços para o VZ e um bem para o DG (1 mL de B27 médio/bem).
- Adicione 20 ng/mL de FGF2 e 20 ng/mL de EGF a cada poço (concentração final 1x).
- Incubar a 37 °C, 5% de CO2 e alta umidade (90-95%). Não perturbe por 48 h (dia 1 e dia 2 de cultura, D1-D2).
- No terceiro dia (D3), remova metade do meio de cultura e substitua-o por meio B27 fresco (500 μL por poço) complementado com dupla concentração (2x) de fatores de crescimento.
- Repita a cada três dias, mude o meio de cultura (metade dele) e substitua-o por um novo meio B27 complementado com dupla concentração (2x) de fatores de crescimento.
- Nos dias em que não é necessário mudar o meio cultural, adicione fatores de crescimento a uma concentração final de 1x.
- Certifique-se de que as neurosferas são formadas em torno de D8-D10.
- Na D10, mude o meio de cultura completo para remover todos os detritos.
- Colete os meios e neuroesferas individualmente de cada poço em tubos de centrífuga.
- Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Este procedimento permite a precipitação das neurosferas pela gravidade.
- Remova o supernasal e resuspende em 1 mL de médio B27 fresco complementado com fatores de crescimento.
- Coloque as neuroferas de volta na mesma placa de fixação ultra-baixa e incubar a 37 °C, 5% DE CO2.
- De D10 para D15, continue mudando metade do meio e adicionando fatores de crescimento.
7. Passagem das neurosferas
- Na D15 da cultura primária, colete as neurosferas em tubos de centrífuga usando pipeta de 1 mL. Corte a ponta da pipeta para aumentar o tamanho da abertura para evitar danos às neurosferas.
- Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Neuroferas precipitam pela gravidade.
- Retire o meio e adicione 1 mL do meio de descolamento celular por tubo.
- Incubar os tubos por 7 min a 37 °C.
- Pipeta para cima e para baixo com uma ponta de 1 mL para desmontar as neurosferas.
- Diluir o meio de descolamento celular com 3 mL de meio B27 por tubo.
- Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 200 x g.
- Descarte o supernasce e resuspenque cada pelota celular com um meio B27 fresco complementado com fatores de crescimento.
- Resuspend as células derivadas de VZ em 4 mL de células médias e derivadas de DG em 2 mL de médio.
- Cultura as células (passagem 1) em uma nova placa de fixação ultra-baixa, dobrando o número de poços que foram utilizados na cultura primária (4 e 2 poços para VZ e DG, respectivamente).
- Troque metade do meio a cada três dias e adicione fatores de crescimento diariamente.
- Após 10 dias (D10) na passagem 1, mude para condições aderentes na próxima passagem.
8. A passagem em condições aderentes
- Antes de realizar a passagem 2, prepare placas revestidas com poli-L-ornithine e laminina.
- Em placas de 24 poços, adicione 500 μL de 1x poli-L-ornithine (20 μg/mL) por poço. Incubar a 37 °C durante a noite.
- Remova o poli-L-ornithine e lave 4x com 1x PBS (500 μL/well).
- Adicione 200 μL (volume mínimo para cobrir a superfície de um único poço) de 1x laminina (5 μg/mL) por poço e incubar por 2-3 h a 37 °C antes de cultivar as células.
- Colete as neuroesferas com pipeta de 1 mL com pontas cortadas em um tubo de centrífuga.
- Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente para precipitar as neurosferas pela gravidade.
- Descarte o supernasce e resuspenque as neurosferas em um novo meio B27 sem fatores de crescimento.
- Aspire a laminina da placa revestida e deposite as neurosferas nos poços usando pipetas de 1 mL com pontas cortadas.
NOTA: Evite que os poços revestidos sequem entre a remoção de laminina e as neuroesferas de revestimento. - Divida a cultura em duas condições:
- Manter neuroesferas diferenciadas por 6 dias (D6). Mude o meio a cada três dias e adicione fatores de crescimento diariamente.
- Observe a diferenciação das células derivadas da neurosfera em 12 dias (D12). Mude o meio a cada três dias sem fatores de crescimento.
NOTA: No final do D6 para condições indiferenciadas ou D12 para condições de diferenciação, as células podem ser usadas para imunohistoquímica convencional, análise de classificação celular, coloração 5-Ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU), extração de RNA, entre outras.
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Representative Results
As neurosferas foram formadas a partir de células-tronco neurais isoladas do VZ e DG de voles de pradarias adultas femininas e masculinas. Cerca de 8-10 dias após o início da cultura, as células deveriam ter formado as neuroesferas. Note que a placa pode conter detritos na cultura primária(Figura 3A). No entanto, na passagem 1 a cultura deve consistir apenas de neuroesferas (Figura 3B).
Maior número de neurosferas foram obtidas a partir da VZ feminina em comparação com o VZ masculino e DG de ambos os sexos femininos e machos(Figura 4A). Esses dados sugerem que o número de neurosferas obtidas depende da zona proliferativa e do sexo de vole. Uma vez que as neuroesferas apareceram (D8-D10), elas foram mantidas por mais sete dias na cultura, e seu crescimento foi monitorado durante esse período. O diâmetro das neurosferas foi medido em D8, D11 e D14 (Tabela 1 e Figura 4B). O tamanho da neurosfera (diâmetro) aumentou progressivamente de acordo com os dias de cultura para os voles masculinos e femininos em ambas as regiões neuronais. As neurosferas derivadas dos cérebros masculinos foram menores em comparação com as neurosferas derivadas do cérebro feminino em ambas as áreas neurogênicas(Figura 4B).
Após 15 dias de cultura primária em condições flutuantes, as neurosferas foram expandidas na passagem 1 sob as mesmas condições. Para a passagem subsequente 2, as células cresceram na cultura adesiva, embora pudessem aderir desde a passagem 1. As neuroesferas aderidas foram caracterizadas no sexto dia (D6) na presença de fatores de crescimento (condição indiferenciada, Figura 5A) ou, em vez disso, até o dia 15 (D15) sem fatores de crescimento (condição diferenciada, Figura 5B).
Em D6 sob condições de não-serentição, as células derivadas da neurosfera expressavam nestin (um marcador para progenitores neurais)(Figura 6). Além disso, foi possível identificar células positivas de doublecortina (DCX) (células migratórias) e o marcador de proliferação Ki67, que indicam a presença de precursores neuronais ou neurônios imaturos. No entanto, a falta de colocalização do Ki67 com DCX sugere a presença de neuroblastos pós-amóticos(Figura 7). Finalmente, em D15 em condições de diferenciação, foram encontrados neurônios maduros (células MAP2 positivos), bem como células com o fenótipo glial (células GFAP-positivas), o que demonstra potencial de diferenciação das células isoladas(Figura 8).
Figura 1: Visão dorsal de um cérebro de vole adulto e suas regiões neurogênicas. ALinha sólida ao nível de Bregma foi a referência anatômica para separar o cérebro em dois blocos, rostral e caudal. A linha pontilhada foi a referência para dividir o bloco caudal para obter duas fatias contendo o DG. (B) Visão coronal das regiões neuronais expostas com a primeira incisão, onde está localizado o VZ. (C) Vista coronal das regiões anatômicas expostas com a segunda incisão, onde está localizado o DG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Referências anatômicas para dissecção de regiões neurogênicas. (A) Esquema e fotografia da seção coronal do bloco rostral mostrando a localização VZ (linha pontilhada). (B) Esquema e fotografia da seção coronal do bloco caudal mostrando a dissecação DG. CPu, caudate putamen; V, ventrículo; VZ, zona ventricular, DG, giro dentado; CA1 e CA3, regiões do hipocampo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Micrografos representativos da cultura das neurosferas derivadas de nichos neurogênicos do vole da pradaria adulta. (A) Cultura primária das neurosferas isoladas do VZ de voles fêmeas em D10. (B) Passagem 1 das neurosferas derivadas do VZ de voles fêmeas em D10. Barras de escala = 200 μm. n= 3 para cada região neurogênica e sexo do vole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: O número e o tamanho das neurosferas dependiam tanto do sexo quanto da fonte neurogênica. (A) O número de neuroesferas na cultura primária obtidas de VZ e DG em voles femininos e masculinos em D10. Os dados foram analisados com um ANOVA unidirecional seguido de testes pós-hoc de um Tukey. Diferenças significativas foram encontradas entre o VZ feminino e o resto dos grupos, ***p<0,001. (B) O diâmetro das neurosferas ao longo do D8-D14 na cultura primária dependia do sexo vole. Os dados foram analisados com um ANOVA bidirecional seguido dos testes pós-hoc de Tukey. As comparações intra-grupos (diferenças dentro do mesmo grupo) mostraram um aumento no tamanho da neurosfera entre D8 vs. D11 e D14, (*p<0,05, ***p<0.001, ****p<0.0001); e D11 vs. D14 (+++ p<0,001) no VZ e DG de voles femininos e masculinos. A comparação entre grupos (diferenças entre grupos na mesma região) mostrou que as neurosferas femininas de VZ e DG são maiores que as neurosferas masculinas em D11 e D14. ### p<0,0001. VZ foi obtido de machos e fêmeas voles (n=3, por grupo). Foram analisadas 15 neurosferas femininas e 10 masculinas. DG foi obtido de machos e fêmeas (n=3, por grupo). Foram processadas 8 neurosferas femininas e 5 neurosferas masculinas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens representativas de neurosferas derivadas da VZ feminina cultivadas em condições de adesão na passagem 2. (A) Neuroesferas aderiram na passagem 2 com fatores de crescimento na D2. (B) Células derivadas da neurosfera aderiram na passagem 2 sem fatores de crescimento em D10. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Expressão de nestin em neurosferas. Representativas, imagens de epifluorescência-microscopia de células nestin-positivas derivadas do VZ de cérebros adultos femininos e masculinos no estágio indiferenciado. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Expressão de DCX e Ki67 em neurosferas. Imagens representativas de epifluorescência-microscopia de DCX-, células ki67 positivas e fusão derivada do VZ de cérebros adultos femininos e masculinos no estágio indiferenciado. Barras de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Expressão de MAP2 e GFAP em neurosferas. Representativas, imagens de epifluorescência-microscopia de células positivas MAP2 (neurônios maduros) e GFAP (células gliais) derivadas do VZ tanto do cérebro feminino adulto quanto do masculino no estágio diferenciado. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tamanho das neuroesferas (μm) | |||||
| Vz | Dg | ||||
| Dias de cultura | Sexo | SD de ± média | Dias de cultura | Sexo | SD de ± média |
| D8 | F | 102.1±18.2 | D8 | F | 55.3±8.5 |
| M | 86,5±15.1 | M | 37,6±6,8 | ||
| D11 | F | 217,3±35,7 | D11 | F | 142.1±15.4 |
| M | 158,9±47,2 | M | 71,8±14.4 | ||
| D14 | F | 306,6±44,4 | D14 | F | 243,8±37,4 |
| M | 210,8±42,3 | M | 120.2±19.1 | ||
Tabela 1: Quantificação do tamanho médio (diâmetro) das neurosferas isoladas de nichos neurogênicos na cultura primária. Diferenças significativas são mostradas na Figura 4. VZ foi obtido de machos e fêmeas voles (n=3, por grupo). Foram analisadas quinze neuroesferas de fêmeas e dez de machos. DG foi obtido de machos e fêmeas (n=3, por grupo). Oito neuroesferas femininas e cinco neurosferas masculinas foram processadas.
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Discussion
Um estágio para obter uma cultura de células-tronco neurais é o período de digestão com a solução enzimática, que não deve exceder mais de 30 minutos porque pode diminuir a viabilidade celular. As neurosferas devem surgir entre 8 e 10 dias após a cultura inicial; se eles não emergirem até o dia 12, descartem a cultura e repitam o experimento, reduzindo o período de digestão. Outra questão são os vasos sanguíneos que cobrem o tecido cerebral. Eles devem ser completamente removidos durante a dissecção porque o excesso de eritrócitos pode interferir na formação das neurosferas.
Este protocolo permite expandir as neurosferas flutuantes até a passagem 2 e mudar para condições aderentes para avaliar as células derivadas da neurosfera. No entanto, tem limitações como a diminuição do potencial neurogênico, que muda para diferenciação gliogênica em passagens sucessivas como resposta de adaptação às condições in vitro12. Por essa razão, recomendamos caracterizar as neurosferas na cultura primária e na passagem 1, e continuar com a próxima passagem apenas se for necessário expandir as células para experimentos que não envolvam diferenças elucidadoras devido à origem.
Curiosamente, diferenças intrínsecas podem ser encontradas na cultura primária das neurosferas como resultado da fonte neuroanatomical (VZ ou DG) ou dependente do sexo (fêmeas ou machos). Assim, o número e o diâmetro das neurosferas derivadas de ambas as regiões neurogênicas das fêmeas são maiores em comparação com os machos. Isso pode ser uma diferença funcional no nicho cerebral feminino em comparação com o dos machos, que mecanismos moleculares podem ser estudados in vitro com este ensaio.
A cultura celular das neurosferas derivadas do cérebro adulto é uma ferramenta valiosa que poderia ajudar a resolver discrepâncias entre estudos in vivo. Por exemplo, Fowler e colegas de trabalho relataram que o isolamento social por 48 h induz um aumento em células positivas de 5-Bromo-2'-desoxyuridina (BrdU) no VZ, sem afetar o DG6. Em contraste, Lieberwirth et al.; demonstrou uma diminuição da proliferação celular no DG13. Além disso, a cultura in vitro pode ser um modelo para avaliar os mecanismos moleculares em regiões neurogênicas que poderiam estar associados a mudanças comportamentais em um modelo social como o vole da pradaria. Por exemplo, tem sido sugerido que a exposição a recém-nascidos induz, tanto em voles não-parentais quanto nos pais, um aumento de células R$14. Os achados deste estudo podem ser confirmados usando nosso protocolo de cultura celular com rotulagem brdU. No entanto, embora a maioria dos estudos sobre voles e outros mamíferos usem rotulagem de BrdU para identificar novas células, uma desvantagem é que o labbeling pode mudar dependendo das doses injetadas15. EdU, outro analógico de timmidina, é uma alternativa ideal para identificar células sob a fase de ciclo celular em culturas in vitro. No mesmo experimento, é possível ter vários períodos para a incorporação da EdU, e ao contrário de BrdU, desnaturação de DNA ou incubação com anticorpos não é necessário para sua detecção. Além disso, as células EdU-positivas podem ser avaliadas para co-localização com marcadores para identificar o ciclo de divisão celular (Ki67) e determinar seu fenótipo usando marcadores de células-tronco neurais ou progenitores (Nestin, Sox2 e Pax6).
A cultura das neurosferas pode ser estabelecida como modelo para estudar o efeito de hormônios, pequenas moléculas ou drogas na taxa de proliferação, neurogênese e modificações epigenéticas nas células-tronco neurais e progenitores de voles de pradaria. Por exemplo, estudos anteriores sugeriram o papel dos hormônios do estresse (como corticosterona) e estrogênios na regulação da neurogênese adulta em voles de pradaria, mas os mecanismos regulatórios subjacentes são desconhecidos6.
Finalmente, os transtornos do espectro autista (TEA) e a esquizofrenia (SZ) estão relacionados a prejuízos na cognição social16,17. Curiosamente, a ocitocina e a arginina-vasopressina têm um papel fundamental no comportamento social e emocional, e as variações de expressão genética em seus receptores (OXTR e vasopressina 1a (V1AR), respectivamente) estão associadas tanto ao TEA quanto à SZ18,19,20,21. Além disso, a alteração da neurogênese e migração neural durante o neurodesenvolvimento estão implicadas na fisiopatologia desses distúrbios comportamentais22,23,24. Assim, propomos analisar os mecanismos moleculares mediados por esses hormônios sobre neurogênese, migração neural e outros eventos celulares cujas alterações estão relacionadas a distúrbios neurológicos utilizando a cultura celular de pradaria no modelo vitro devido aos receptores OXTR e V1AR são encontrados no hipocampo25,26.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelas bolsas CONACYT 252756 e 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT EM 202818 e IN203518; INPER 2018-1-163, e NIH P51OD11132. Agradecemos a Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris e Susana Castro por sua excelente assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
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