Summary
Investigações detalhadas sobre os estágios dos mosquitos dos parasitas da malária são fundamentais para projetar estratégias eficazes de bloqueio de transmissão. Este protocolo demonstra como efetivamente cultivar gametocitos infecciosos e, em seguida, alimentar esses gametocitos para mosquitos para gerar estágios de mosquitos de P. falciparum.
Abstract
A malária continua sendo um dos mais importantes problemas de saúde pública, causando morbidade e mortalidade significativas. A malária é uma doença transmitida por mosquitos transmitida através de uma picada infecciosa do mosquito Anopheles fêmea. O controle da malária eventualmente dependerá de uma infinidade de abordagens, o que inclui maneiras de bloquear a transmissão para, através e de mosquitos. Para estudar os estágios dos mosquitos dos parasitas da malária em laboratório, otimizamos um protocolo para cultivar gametocitos plasmodium falciparum altamente infecciosos, um estágio parasita necessário para a transmissão do hospedeiro humano para o mosquito vetor. P. falciparum gametocitos amadurecem através de cinco passos morfologicamente distintos, que leva aproximadamente 1-2 semanas. A cultura gametócica descrita neste protocolo é concluída em 15 dias e são infecciosas para mosquitos dos dias 15 a 18. Esses protocolos foram desenvolvidos para manter um ciclo contínuo de gametocitos competentes para infecção e para manter o fornecimento ininterrupto de estágios do mosquito do parasita. Aqui, descrevemos a metodologia da cultura gametocito e como infectar mosquitos com esses parasitas usando alimentadores de membrana de vidro.
Introduction
A malária é causada por parasitas de Plasmodium e é transmitida aos seus hospedeiros vertebrados através de picadas infecciosas de mosquitos Anopheles fêmeas. De acordo com o relatório da Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2019, foram estimadas 405 mil mortes, de um total de 228 milhões de casos de malária1. A maioria dos óbitos relacionados à malária estava concentrada na região africana, especialmente entre crianças menores de cinco anos de idade. Embora a taxa global de incidência de malária tenha diminuído globalmente a partir de 2010, nos últimos anos o declínio aumentou e estratégias adicionais de controle são urgentemente necessárias para eliminar a doença.
Os estágios sanguíneos assexuados cíclicos de parasitas da malária causam patogênese da doença e um pequeno subconjunto destes diferenciam-se em gametocitos femininos e masculinos. Os gametocitos plasmodium falciparum são únicos na natureza, pois levam de 7 a 10 dias para se desenvolverem através de cinco estágios morfologicamente distintos. Gametócitos imaturos da fase I a IV são sequestrados em parenchyma de medula óssea e permanecem em grande parte ausentes da circulação periférica2,3,4,5. Os eritrócitos infectados com gametócitos maduros do estágio V são liberados na corrente sanguínea e circulam livremente para serem tomados por mosquitos. Uma vez dentro do mosquito midgut, os gametócitos são ativados, através de uma mudança de temperatura e exposição ao ambiente midgut, transformam-se em gametas femininos e masculinos e iniciam o desenvolvimento dos estágios do mosquito, que culmina com os estágios infecciosos dos esporozoitas nas glândulas salivares do mosquito6,7.
Desde que Trager e Jenson8 descreveram um método padronizado para cultivar P. falciparum,os estudos sobre os estágios sanguíneos assexuados têm avançado muito. No entanto, a falta de um sistema de cultura confiável para estágios sexuais tem dificultado o estudo de gametocitos de P. falciparum, biologia de transmissão e estágios de mosquitos. Nos últimos anos, foram publicados diversos métodos que têm auxiliado laboratórios no estabelecimento de culturas gametócitos9,10,11,12. Este manuscrito descreve um protocolo padronizado e confiável para cultivar gametocitos P. falciparum que podem representar um recurso valioso para a comunidade de pesquisa da malária. Este método permite a produção robusta de gametocitos maduros e infecciosos que, juntamente com um protocolo padronizado de alimentação de mosquitos, resulta em infectividade de mosquitos altamente confiável. Esses métodos foram estabelecidos para manter o fornecimento ininterrupto de gametócitos e parasitas em estágio de mosquitos. Neste manuscrito, descrevemos um protocolo de cultura gametocito completo(Figura 1),preparação de alimentadores de membrana de vidro e infecção de mosquitos utilizando esses alimentadores de membrana(Figura 2),dissecção de midgut(Figura 3) e glândula salivar de mosquitos(Figura 4), e quantificação de infecção em mosquito após dissecação de glândulas médias e salivares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
As coleções de sangue descritas abaixo foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Johns Hopkins. P. falciparum é cultivado em RBCs frescos em condições estéreis em uma instalação de biossegurança nível 2 (BSL2) e a cautela é usada para lidar com materiais biológicos. Após cada passo envolvendo sangue ou produtos sanguíneos, cada plástico ou vidro é enxaguado com alvejante 10% dentro do capô antes do descarte adequado.
1. Reagentes e preparação
- Foi utilizado o isolador de parasitas P. falciparum NF54 (ver Tabela de Materiais),que pode produzir gametócitos infecciosos por até dois meses enquanto estiver em cultura contínua.
NOTA: Nem todas as linhas de parasitas adaptadas à cultura produzem gametócitos, e isolados NF54 de baixa passagem são mais consistentes. - O+ Eritrócitos: Diluir o sangue inteiro adicionando igual volume de RPMI 1640 de mídia e centrífuga a 500 x g por 5 min em temperatura ambiente em um rotor swing out com desaceleração definida em 0. Remova cuidadosamente o casaco supernacante e buffy (uma faixa branca entre plasma e eritrócitos embalados, que contém a maioria dos glóbulos brancos e plaquetas) e adicione o mesmo volume de RPMI. Repita a etapa de lavagem duas vezes e após a lavagem final adicione um volume de pelotas de RPMI para obter 50% de hematócrito para armazenamento a 4 °C.
NOTA: Os gametócitos amadurecem durante um período de duas semanas, o que torna fundamental começar culturas com eritrócitos frescos, tipicamente eritrócitos desenhados dentro de uma semana funciona bem. - O+ Soro Humano: Acumule pelo menos 6 unidades de soro juntas para minimizar o efeito da variação normal do soro de diferentes indivíduos. Esterilizar o soro humano agrupado usando frascos de filtragem de 0,2 μm. Alíquota em porções de 50 mL ou menos com base na necessidade e armazenar a -20 °C.
NOTA: Os eritrócitos e o soro precisam ser de um tipo sanguíneo compatível para culturas P. falciparum. - Solução de hipoxantina de 500x (100 mL): Dissolver 0,5 g de hipoxantina em 100 mL de 1 M NaOH. Filtrar esterilizar e fazer alíquotas de 5 a 10 mL para armazenamento. Os estoques podem ser armazenados até um ano a -20 °C e até 2 semanas a 4 °C.
- Bicarbonato de sódio (Opcional): Dissolver 7,5 g de bicarbonato de sódio em 100 mL de água desionizada, grau de cultura tecidual e esterilizar filtro com filtro de 0,2 μm.
NOTA: Este protocolo utiliza o método do frasco de velas para fornecer condições microaerófilas para P. falciparum na cultura vitro e não requer bicarbonato de sódio. No entanto, se os parasitas são cultivados usando uma mistura de gás malária (5% O2, 5% CO2 e 90% N2), é importante complementar a mídia cultural com 0,2% de bicarbonato de sódio. - Mídia completa: Para preparar 500 mL de mídia completa, adicione 1 mL de solução de hipoxantina e 50 mL de soro humano agrupado a 500 mL de RPMI 1640. Adicione 15 mL de bicarbonato de sódio de 7,5% se usar uma mistura de gás malária. Armazene a mídia completa a 4 °C e descarte se a cor da mídia completa mudar de laranja para rosa. Para evitar desperdícios, faça mídia completa suficiente para ser usada dentro de três dias.
- Mídia de exflagellação (Opcional): Faça exflagellação ou mídia ookinete dissolvendo 200 mg NaHCO3, 5 mg de hipoxantina e 100 μL de ácido xanthurenic (de 100 mM de estoque em água) para 100 mL de mídia incompleta (RPMI 1640 com glutamina e HEPES).
NOTA: Exflagellation é o processo de formação de gametas masculinos dentro do midgut do mosquito Anopheles fêmea poucos minutos depois de tomar farinha de sangue infectada com gametócitos. Gametocitos masculinos de Plasmodium dão origem a 8 gametas masculinos após um evento de exflagellação. In vitro, esse processo ocorre espontaneamente quando a temperatura da cultura é reduzida à temperatura ambiente (TR) e pode ser observada em gametócitos maduros cultivados. - N-Acetilglucosamina (Opcional): Faça uma solução de estoque de 500 mM de N-acetilglucosamina em água ou mídia incompleta, alíquota e armazenamento a -20 °C.
- Soluções NaCl: Dissolver 0,9 g, 1,6 g e 12 g NaCl em 100 mL de cultura de tecido grau de água desionizada para fazer 0,9%, 1,6% e 12% nacl soluções. O filtro esterilizar com filtro de 0,22 μm e armazenar a 4 °C.
2. P. falciparum cultura de palco assexual
- Para iniciar a cultura dos parasitas, remova um frasco congelado de baixa passagem de P. falciparum NF54, do tanque de nitrogênio líquido e descongele rapidamente no banho de água a 37 °C.
- Transfira o conteúdo (~1 mL) para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL e adicione 0,2 volume de NaCl pré-armado de 12%, enquanto agita suavemente o tubo para garantir uma mistura uniforme. Incubar por 5 min no RT com agitação suave intermitente.
- Adicione 9 volumes de 1,6% naCl dropwise, enquanto continua a mistura suave. Centrifugar o conteúdo a 500 x g por 5 min no RT, descarte cuidadosamente o supernaspe. Adicione 9 volumes de 0,9% NaCl dropwise, ao mesmo tempo em que certifique-se de misturar consistentemente a pelota parasita. Centrifugar novamente a 500 x g por 5 min no RT. Remova os parasitas supernaspentes e resuspend em 5 mL de mídia completa.
- Transfira o conteúdo para um poço de uma placa de cultura de tecido de 6 poços e adicione 100-200 μL de RBCs embalados.
- Incubar cultura de parasitas a 37 °C em um frasco de vela ou em uma câmara de incubadora modular expurgada com mistura de gás especial de 5% O2, 5% CO2 e 90% N2.
- Substitua a mídia todos os dias e monitore o crescimento fazendo uma mancha de sangue fina, desenhando alguns microliters da camada RBC estabelecida depois que a cultura supernascer foi aspirada durante a mudança regular da mídia.
- Use pipeta pasteur de vidro estéril para desenhar e, em seguida, toque no centro do slide de vidro para transferir uma gota de cultura para o slide. Coloque outro deslizamento de vidro na frente da gota e desenhe-o de volta para entrar em contato com os RBCs, empurrando-o rapidamente para a frente em um movimento para fazer uma mancha fina de monocamadoR.
- Coloque o slide horizontalmente em um rack de secagem e deixe-o secar. Conserte a mancha de sangue jogando metanol absoluto na mancha. Deixe a mancha fixa secar completamente e, em seguida, despeje cuidadosamente 10% de mancha de Geimsa recém-diluída em água, até que a mancha de sangue esteja completamente coberta. Deixe as células mancharem por aproximadamente 15 minutos.
- Lave a mancha em excesso enxaguando o escorregador sob água limpa da torneira e deixe as lâminas secarem na posição vertical.
- Determine a parasitamia visualizando uma mancha de sangue fina em um microscópio usando a imersão de óleo 100x objetivo. Conte o número de eritrócitos infectados entre um total de pelo menos 500 RBCs para determinar por cento de parasitamia.
3. P. falciparum gametocyte cultura
NOTA: As culturas gametocitos levam duas semanas para produzir gametocitos maduros infecciosos para mosquitos. Os passos da cultura gametócito estão descritos na Figura 1. P. falciparum isolados geralmente perdem a capacidade de produzir gametocito após cultura in vitro de longo prazo13. Para garantir a qualidade dos gametocitos, a cultura deve ser iniciada a partir da cultura alimentador de baixa passagem, não mais de 2 meses desde o descongelamento. Pré-aqueça a mídia a 37 °C e realize todos os procedimentos em um conjunto mais quente de slides a 38 °C. Certifique-se de que as culturas gametócitas não fiquem fora da incubadora por um período prolongado para minimizar as flutuações de temperatura.
- Semente a cultura gametocito (dia 0) usando cultura alimentador de palco assexuado misto em 0,3-1% de parasitamia a 4% hematócrito.
- Para configurar uma cultura de seis bem gametocito, centrífugue 5 mL de cultura alimentadora a 500 x g por 5 min na RT. Descarte o supernatante e resuspense a pelota em 30 mL de mídia completa.
- Adicione 1,2 mL de RBCs embalados, misture e dispense 5 mL a cada poço da placa de 6 poços e incuba em um frasco de vela a 37 °C.
NOTA: A cultura gametocito criada acima é baseada em uma cultura alimentar de palco assexuado mista com 5% de parasitamia. - Mude a mídia diariamente por 15-18 dias, sem a adição de sangue fresco, aspirando cuidadosamente cerca de 70-80% de supernasce de cultura para evitar a remoção de células sanguíneas.
- Adicione 5 mL de mídia completa fresca a cada poço. Enquanto muda de mídia, adicione lentamente a mídia usando uma pipeta sorológica contra a parede do poço para evitar perturbar a camada RBC assentada.
NOTA: Como 1-2 mL do meio de cultura será deixado durante a mudança de mídia, o volume total de cultura será entre 6-7 mL, após o primeiro dia de cultura gametócica. Ao adaptar este protocolo, é aconselhável fazer manchas de sangue todos os dias alternados para garantir que os parasitas estejam saudáveis. Fazer uma mancha de sangue pode muitas vezes esgotar o número de células na cultura. Para evitar isso, desenhe um volume muito pequeno. - Para quantificar a gametocittemia madura, faça manchas de sangue entre os dias 15-18 e conte o número de gametocitos maduros entre o número total de células.
NOTA: Os gametócitos maduros podem ser facilmente identificados com sua forma crescente clássica com extremidades arredondadas lisas(Figura 5B). - Conte um mínimo de 1.000 RBCs e calcule a porcentagem de RBCs infectados com gametocitos maduros.
- Para quantificar os eventos de exflagellação, tome 200 μL de cultura gametocite e centrífuga a 500 x g por 5 min em RT em um tubo pré-aquecido. Resuspenque a pelota em 20 μL de mídia de exflagellação e transfira para um slide de vidro com deslizamento de tampa.
- Após 15 minutos de incubação à temperatura ambiente, comece a contar centros de exflagellação no modo de contraste de fase usando objetivo de 10x. Conte centros de exflagellação em pelo menos quatro campos para calcular eventos de exflagellação.
NOTA: Uma metodologia detalhada do ensaio de exflagellação foi descrita anteriormente por Delves et al10. Mais de 20 eventos de exflagellação por campo são considerados adequados para ensaio de alimentação de membrana. - Culturas gametócitas normalmente têm baixos níveis de estágios assexuados residuais. Se o experimento requer gametócitos puros, trate a cultura com 50 mM N-acetilglucosamina.
- Adicione 0,5 mL de N-acetilglucosamina a partir de 10x solução de estoque por poço (5 mL) por um mínimo de 3 dias enquanto muda a mídia para limpar estágios assexuados residuais.
NOTA: N-acetilglucosamina pode bloquear invasão de merozoitas sexualmente cometidos também, o tratamento só deve ser iniciado após o 7º dia da cultura gametocito.
4. Infecção por mosquitos usando ensaio de alimentação de membrana padrão (SMFA)
NOTA: Os gametócitos cultivados in vitro podem ser alimentados com mosquitos usando alimentadores de membrana de vidro. A configuração do aparelho de alimentação sanguínea é mostrada na Figura 2. Como descrito acima, mantenha sempre os gametocitos a 37 °C para evitar a ativação antes de serem ingeridos por mosquitos. Plásticos pré-inaques, reagentes e equipamentos são usados com cultura gametocitte a 37 °C.
- Esfole mosquitos Anopheles fêmeas de 3-7 dias de idade removendo sua água de açúcar por 6,5 h ou durante a noite antes da alimentação da membrana.
- Transfira-os usando aspiradores motorizados ou operados pela boca para copos de papel cobertos com camada dupla de tecido de malha fina. Alternativamente, derrubar mosquitos em uma sala fria ou geladeira para transferi-los para os copos de papel.
NOTA: O copo de um litro pode ser usado para alimentar até 100 mosquitos. - Centrífuga lavou sangue a 500 x g por 5 min no RT e descarta supernanato. Adicione um volume igual de soro humano recém-descongelado para reconstituir todo o sangue. Transfira a mistura de sangue e soro para o banho de água a 37 °C por 30 min.
- Transfira a cultura gametócita para tubo plástico pré-aquecido de 15 mL e centrífuga a 600 x g por 5 min a 37 °C. Aspire cuidadosamente a cultura supernascida e faça manchas de sangue finas para determinar a gametocittemia madura como descrito acima.
- Para fazer a alimentação sanguínea final, diluir a pelota gametocitada para uma concentração desejada usando sangue inteiro reconstituído. Mantenha a alimentação sanguínea a 37 °C até que mosquitos e alimentadores de vidro estejam prontos.
NOTA: Concentrações maduras de gametocito entre 0,02 e 0,3% proporcionarão infectividade consistente do mosquito. No entanto, é aconselhável otimizar a gametocytemia alimentando várias concentrações para diferentes xícaras de mosquitos. - Certifique-se de que os alimentadores de membrana de vidro tenham duas aberturas, uma abertura superior estreita para pipeta do sangue infectado e uma abertura inferior para fixação da membrana. Corte um filme de parafina em quadrados, estique até mesmo a espessura e grude na abertura do alimentador para criar compartimento selado para a alimentação sanguínea.
- Conecte os alimentadores de membrana a um banho de água circulatório conectando tubos de cada lado para permitir a passagem de água morna através da jaqueta em torno dos alimentadores de membrana.
NOTA: Vários alimentadores de vidro podem ser conectados em série para acomodar múltiplas condições de alimentação. - Depois que todos os alimentadores estiverem conectados ao banho de água, ligue-o e inspecione se houver vazamentos.
- Coloque os alimentadores no centro da rede em copos de mosquitos com membrana lateral para baixo e proteja os alimentadores usando grampos ou fita. Certifique-se de que os alimentadores de membrana não estão inclinados para nenhum lado para permitir a distribuição uniforme da ração sanguínea e o contato próximo de todo o alimentador com a rede em copos, para permitir o acesso dos mosquitos de dentro do copo.
- Pipeta cerca de 200-1000 μL de alimentação sanguínea em alimentadores de membrana.
NOTA: O volume da alimentação sanguínea varia de acordo com o número de mosquitos e o tamanho do alimentador de membrana. Para alimentador de vidro de 14 mm e 50 mosquitos, utilize 200 μL de ração sanguínea. - Certifique-se de que o carregamento foi feito corretamente e a ração de sangue foi sobreposta no filme de parafina.
- Permita que os mosquitos se alimentem por cerca de 30 minutos com monitoramento intermitente.
NOTA: Sopre suavemente mosquitos com a boca para fornecer CO2 que induzirá uma melhor alimentação sanguínea. - Remova mosquitos não-comidos derrubando-os em uma sala fria. Inspecione visivelmente os mosquitos para protuberância e vermelhidão no abdômen como sinal de farinha de sangue fresco. Alternativamente, use um aspirador operado pela boca para remover seletivamente mosquitos não-medicamentos.
- Descarte mosquitos não alimentados, depois de encharcá-los em 70% de etanol e colocar mosquitos alimentados de volta no copo de mosquitos.
- Copos de mosquitos de gaiola dupla e transferi-los para incubadora de alta contenção especificada para mosquitos infectados com parasita da malária humana P. falciparum.
- Coloque almofadas de algodão embebidas em 10% de sacarose nos copos de mosquito para fornecer-lhes a farinha de açúcar. Substitua as almofadas de algodão a cada dois dias, até que os mosquitos sejam dissecados.
5. Dissecção de mosquiteira de mosquito e quantificação da carga oocisto
NOTA: Um esquema de dissecção midgut é mostrado na Figura 3.
- 7-8 dias após a alimentação sanguínea, transfira copos de mosquitos para 4 °C por 10 minutos para derrubar mosquitos.
- Transfira mosquitos para serem dissecados para uma placa de Petri no gelo usando fórceps finos.
- Mergulhe mosquitos em 70% de etanol por 1-2 min para eutanásia. Adicione PBS à placa de Petri para lavar o etanol depois que todos os mosquitos forem eutanizados.
NOTA: Antes de adicionar PBS certifique-se de que todos os mosquitos estão mortos. - Monte um slide de vidro no microscópio de dissecação e pipeta 100 μL de PBS no centro. Transfira cuidadosamente um mosquito usando fórceps para a PBS e deixe o resto dos mosquitos na placa de Petri no gelo.
- Utilizando fórceps finos, segure o terceiro segmento do abdômen a partir da extremidade posterior do mosquito e com o segundo fórceps segure a junção entre o tórax e o abdômen. Puxe suavemente o abdômen até que o midgut esteja totalmente exposto.
- Descarte o resto do tecido do mosquito e transfira o midgut para um slide limpo contendo algumas gotas de PBS.
- Quando o número desejado de mosquitos for dissecado, remova cuidadosamente o PBS usando uma pipeta e manche o midgut com 0,2% de mercurocromo por 2-5 min.
- Remova o excesso de mercurocromo e os meio-pesados de linha no slide para que possam ser facilmente visualizados sob o microscópio de luz.
- Coloque um deslizamento de cobertura e conte oocistos em cada midgut abaixo do objetivo de 10x. Oocistos mancham rosa e têm formato circular(Figura 6C).
6. Dissecção da glândula salivar de mosquitos e quantificação da carga de sporozoite
NOTA: Um esquema de dissecção da glândula salivar é mostrado na Figura 4.
- 14-18 dias após a alimentação sanguínea, coloque copos de mosquito a 4 °C por 10 minutos.
NOTA: É importante esperar até que os mosquitos parem de se mover. - Enquanto espera que os mosquitos parem de se mover, prepare ferramentas para dissecção.
- Coloque uma placa de vidro em um estágio de microscópio de dissecção. Prepare 2 conjuntos de agulhas de 25 G em seringas de 1 mL e uma pipeta Pasteur de 9" e lâmpada de borracha. Coloque 70% EtOH e meio de dissecção (HBSS, L-15 ou PBS) em uma placa de 6 poços.
- Na sala fria, transfira mosquitos anestesiados em uma placa de 6 poços contendo 70% de EtOH. Mova suavemente mosquitos com fórceps para garantir que todos os mosquitos estejam encharcados, em seguida, transfira mosquitos para o meio de dissecção usando fórceps para lavar 70% de EtOH.
- Mova-se para a sala de dissecção e coloque mosquitos em um estágio de microscópio de dissecção.
- Remova o excesso de meio dos mosquitos, adicione um novo meio conforme necessário durante a dissecção. Evitar que os mosquitos sequem, mas muito líquido dificulta a dissecção.
- Usando 2 seringas com agulhas de 25 G, segure o tórax e a cabeça do mosquito, e puxe suavemente a cabeça para cima para puxar as glândulas salivares do tórax.
- Desconecte as glândulas salivares da cabeça e do tórax com uma agulha.
- Coloque as glândulas salivares temporárias em uma gota separada de meio na placa de vidro.
- Depois de dissecar 15-20 glândulas salivares, colete-as em um tubo de baixa retenção usando a pipeta Pasteur.
NOTA: Uma vez que as glândulas salivares entrem na parte larga da pipeta Pasteur, elas grudam no vidro e é difícil tirá-las de lá. - Glândulas salivares de pelotas por curto pulso giram em uma centrífuga de mesa. Remova o meio de dissecção sem interromper a pelota e Adicione 100 μL de novo meio de dissecção.
- Triture glândulas salivares com um pequeno homogeneizador por 1 min para obter esporozoitas.
- Coloque 10 μL de meio de dissecção contendo esorozoitas em um hemócito.
NOTA: Dependendo do número de glândulas salivares, pode-se precisar diluir a solução de sporozoita para 1:10 às 1:50 com meio antes de contar. - Conte o número de esorozoitas em dois dos quatro quadrantes e calcule o número de esporozoites/mosquito:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aqui apresentamos resultados de uma série de rações de membrana utilizando culturas de gametocitte P. falciparum NF54 geradas usando o protocolo acima (ver (Figura 5). A cultura gametocito foi iniciada com aproximadamente 0,5% de cultura assexuada de palco misto no dia 0, que cresceu para um pico de parasitamia de aproximadamente 15% no dia 4 e dia 5. Como mostrado na Figura 5A nesta alta parasitamia, os parasitas estão estressados e a cultura de estágio assexuado falha. No entanto, esse estresse concomitantemente resulta na indução do gametocitogênese. Os primeiros gametócitos apareceram após o dia 6 e o dia 7 e a parasitamia assexual lentamente diminuiu, mas permaneceu em um nível baixo. A presença de parasitas em estágio assexuado não afetou experimentos de alimentação de mosquitos. No entanto, se os gametócitos devem ser usados em experimentos que requerem culturas puras, como ensaios de sensibilidade a medicamentos e estudos proteômicos ou transcriômicos, estágios assexuados residuais podem ser removidos por tratamento com 50 mM N-acetylglucosamina. A maioria dos gametócitos amadurecem para o estágio V até o dia 15, quando se tornam infecciosos para mosquitos e estavam prontos para serem alimentados. Imagens representativas de manchas de sangue manchadas de Giemsa em diferentes pontos de tempo após o início da cultura gametocito são mostradas na Figura 5B.
Entre 8 a 10 dias após a alimentação sanguínea, os mosquitos foram dissecados para determinar a prevalência e intensidade da infecção. Prevalência é o percentual de mosquitos alimentados que têm oocistos enquanto a intensidade é o número de oocistos encontrados em cada mosquito. Ambos são indicadores importantes do sucesso da alimentação. Dados de 5 rações independentes de mosquitos são mostrados na Figura 6. Os feeds foram escolhidos para mostrar a variação normal nos níveis de infectividade após a alimentação com gametócitos maduros de 0,3% do dia 16 da cultura P. falciparum NF54. As intensidades do oocyst fornecem dados quantitativos para determinar a infectividade do mosquito dos gametócitos e a prevalência mostra a porcentagem de mosquitos alimentados que foram infectados. Esses dados podem ser utilizados para avaliar agentes bloqueados de transmissão e identificar e caracterizar alvos para o bloqueio de transmissão de vacinas e medicamentos. O número de oocistos variou dentro e entre experimentos e exigiu 25-50 mosquitos por coorte para determinar o efeito de várias condições experimentais.
As intensidades oocistas são consideradas como ponto final da maioria dos ensaios e estratégias de bloqueio de transmissão, porém o número de esorozoitas são geralmente importantes para a biologia sporozoita e para estudos de estágio hepático. A Tabela 1 mostra o número médio de sporozoitas obtidos por mosquito de 12 rações sanguíneas independentes. Como mostrado na tabela, o número médio de esporozoitas foi consistente, no entanto, houve um experimento onde obtivemos zero sporozoites, representando falha ocasional do ensaio.
Figura 1: Fluxo de trabalho da cultura gametocito de P. falciparum e protocolo de alimentação de membrana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração de alimentação de sangue de mosquitos. (A) Alimentador de vidro e peça retangular de filme de parafina(B) Dois alimentadores de vidro exibidos antes e depois do acessório de membrana parafilm(C) Alimentador de vidro em cima do copo de mosquito e conectado com banho de água de circulação. (D,E) Pipetação de ração sanguínea no alimentador de vidro(F) Vista inferior do alimentador de vidro mostrando distribuição homogênea de ração sanguínea (G) Vários mosquitos se alimentando através da membrana parafilm. (H) Vista superior das xícaras de mosquito após a alimentação, mostrando gotas de sangue excretadas pelos mosquitos alimentados no fundo do copo. Barra de escala = 10 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representação gráfica mostrando passos de dissecção de mosquitos midgut. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Representação gráfica mostrando passos de dissecção da glândula salivar de mosquitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: P. falciparum cultura gametocyte e visualização oocisto em mosquitos infectados midgut. (A) Curso de tempo de 15 dias de cultura gametocito, mostrando multiplicação íngreme de estágios assexuados para pico de parasitamia nos primeiros 4 dias, seguido por gametocitogênese e maturação ao longo do tempo. (B) Mancha de sangue fina manchada de Geimsa mostrando vários estágios da cultura gametocito, dia 1 estágio assexuado precoce, dia 4 pico de parasitas assexuados, dia 6 de cultura estressada devido à alta carga de parasitas, dias 9 e 12 gametocitos precoces e dia 15 mostrando gametocitos masculinos e femininos maduros. Os gametócitos morfologicamente em estágio inicial eram indistinguíveis dos estágios assexuados, mas o estágio II mostrou a forma crescente com extremidades pontiagudas e alongadas à medida que o parasita se desenvolveu no estágio III e IV. Os gametócitos de estágio V maduros, no entanto, caracterizaram-se pela forma crescente clássica com extremidades arredondadas e visibilidade mínima da célula hospedeira14. Barra de escala = 10 mm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: P. falciparum oocistos conta por mosquito midgut. (A) Gráfico mostra que o oocisto conta ao longo dos anos, para cada experimento, os mosquitos foram alimentados com 0,3% de gametócitos e os meio-médios foram dissecados no dia 8 pós alimentação sanguínea. Cada ponto representa o número de oocistos de médias individuais e a linha horizontal representa valor mediano. (B) Tabela mostra contagem média de oocisto, prevalência de mosquitos infectados e faixa de infecção. (C) Imagens mostrando oocistos em mosquitos midgut de dois experimentos separados de alimentação sanguínea em diferentes ampliações. Barra de escala = 150 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Experimentar | Dia de dissecção (pós alimentação sanguínea) | Esporozoite/mosquito médio |
| 1 | 14 | 42, 000 |
| 2 | 14 | 40, 000 |
| 3 | 14 | 42, 750 |
| 4 | 15 | 25, 411 |
| 5 | 15 | 33, 750 |
| 6 | 14 | 15, 750 |
| 7 | 16 | 0 |
| 8 | 15 | 33, 200 |
| 9 | 14 | 56, 333 |
| 10 | 14 | 45, 333 |
| 11 | 17 | 43, 750 |
| 12 | 16 | 56, 000 |
Tabela 1: Número médio de glândulas salivares esporozoitas por mosquito por mosquito durante 12 ciclos independentes durante um período de 2 anos. A. os mosquitos Stephensi foram alimentados com gametocitos de A. stephensi e 15-20 mosquitos foram dissecados entre os dias 14-17 pós-alimentação sanguínea. São mostradas contagens médias de esporozoita por mosquito.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os métodos aqui descritos têm sido utilizados com sucesso no Johns Hopkins Malaria Research Institute por mais de 10 anos15,16,17,18,19,20,21,22. Os gametócitos produzidos usando este protocolo têm sido usados para ensaios gametocitopecidas de alto rendimento22, para proteómicas15, bem como para estudos transcriômicos23. No entanto, uma das principais razões para o desenvolvimento desses métodos é o uso dos gametócitos maduros para infectar mosquitos para estudos sobre os estágios do mosquito e esporozoitas23,24,25,26. Este manuscrito descreve um protocolo detalhado de geração de gametócitos P. falciparum maduros e infecção de mosquitos usando alimentadores de membrana de vidro. Esses métodos são fundamentais para qualquer laboratório que trabalhe em estratégias de bloqueio de transmissão, estágios de sporozoita e estágios pré-eritrócitos do fígado de P. falciparum.
Ifediba e Vanderberg descreveram em 1981 a cultura de longo prazo de P. falciparum, na presença de 50 μg/mL hipoxantina que produziu gametócitos maduros altamente infecciosos27. Desde então, existem inúmeras publicações descrevendo métodos para produzir gametócitos para diferentes aplicações9,10,11,12. A maioria dessas publicações utiliza condições indutoras de gametocitogênese previamente descritas para aumentar os rendimentos. Usando mídia condicionada, enfatizando a cultura pelo aumento repentino da parasitamia, queda no hematócrito para imitar anemia, lise de glóbulos vermelhos e repressão da fase de troncos em massa, pode ser usado para induzir gametocitose. O método descrito aqui é simples e o tempo testado. Inicie a cultura gametocito com parasitamia de estágio assexual de 0,3-1% a 4% hematócrito e mude a mídia todos os dias até o dia 15-18. Para alcançar resultados consistentes, é fundamental iniciar a cultura gametocito com parasitas de estágio assexuado de baixa passagem, usar RBCs frescos (<1 semana) e garantir que a temperatura da cultura não flutue durante a mudança da mídia. Uma vez que o processo de desenvolvimento de gametocito falciparum ocorre sequestrado em condições estáticas de espaços extravasculares na medula óssea4,5, é importante não perturbar camadas de RBC assentadas durante todo o período de cultura.
Culturing P. falciparum gametocytes com consistência é exigente, mas fazê-los infectar mosquitos apresenta outro nível de complexidade. A alimentação por membranas está sujeita a várias variáveis que não os gametócitos, como idade e aptidão do mosquito, microbiota midgut e comportamento alimentar28,29. Normalmente, os dados da SMFA mostram um alto grau de variabilidade e requerem um grande número de mosquitos para identificar efeitos de diferentes condições experimentais11,28. Usando cultura de baixa passagem para gametocitos, mosquitos saudáveis de 3 a 6 dias de idade e protocolo de alimentação otimizada de membrana podem ajudar com variações na contagem de oócitos.
O protocolo descrito aqui para o cultivo de gametócitos e alimentação de membranas, foi otimizado ao longo de muitos anos. Estes métodos fornecem uma descrição detalhada para a obtenção de gametócitos competentes de transmissão madura, ensaio padrão de alimentação de membrana, dissecção de mosquitos midgut e quantificação oótica, bem como dissecção da glândula salivar e quantificação de esorozoita. Esses protocolos são consistentes em termos do número de gametocitos necessários para fornecer infectividade confiável de mosquitos e contagens robustas de oócitos e rendimentos de sporozoitas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os Autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Bloomberg Philanthropies pelo apoio financeiro ao Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Este trabalho não teria sido possível sem a expertise fornecida pelas instalações do núcleo de insetos e parasitologia da JHMRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
- World Health Organization.
- Sinden, R. E., Smalley, M. E. Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle. Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).
- Sinden, R. E.
- Joice, R., et al. Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow. Science Translational Medicine. 6 (244), 5 (2014).
- Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow. American Journal of Hematology. 85 (12), 943 (2010).
- Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland. Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).
- Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. The development of malaria parasites in the mosquito midgut. Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).
- Trager, W., Jenson, J. B.
- Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery. Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).
- Delves, M. J., et al. Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions. Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).
- Habtewold, T., et al. Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity. Malaria Journal. 18 (1), 24 (2019).
- Demanga, C. G., et al. The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor. Parasites and Vectors. 10 (1), 216 (2017).
- Brockelman, C. R. Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum. Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).
- Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 7, (2017).
- Essuman, E., et al. A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs. Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).
- Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent. mBio. 8 (5), 01631 (2017).
- Oakley, M. S., et al. Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes. Scientific Reports. 8, 11568 (2018).
- Saraiva, R. G., et al. Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin. Scientific Reports. 8, 6176 (2018).
- Tao, D., et al. Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).
- Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes. Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).
- Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).
- Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity. PLoS One. 9 (8), 105817 (2014).
- Lindner, S. E., et al. Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites. Nature Communications. 10, 4964 (2019).
- McLean, K. J., et al. Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters. Scientific Reports. 9, 13131 (2019).
- Espinosa, D. A., et al. Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).
- Swearingen, K. E., et al. Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606 (2016).
- Ifediba, T., Vanderberg, J. P. Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes. Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).
- Miura, K., et al. An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines. Malaria Journal. 15, 463 (2016).
- Miura, K., et al. Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays. PLoS One. 8 (3), 57909 (2013).
