Summary
Sıtma parazitlerinin sivrisinek aşamaları üzerinde ayrıntılı araştırmalar, etkili bulaşma engelleme stratejileri tasarlamak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, enfeksiyöz gametositlerin etkili bir şekilde nasıl kültüreılacağını ve daha sonra bu gametositlerin sivrisineklere nasıl beslendiğini gösterir P. falciparumsivrisinek aşamaları .
Abstract
Sıtma, önemli morbidite ve mortaliteye neden olan en önemli halk sağlığı sorunlarından biri olmaya devam etmektedir. Sıtma, dişi Anopheles sivrisineklerinden bulaşıcı bir ısırık yoluyla bulaşan sivrisinek kaynaklı bir hastalıktır. Sıtma kontrolü sonunda sivrisineklere, sivrisineklere ve sivrisineklerden bulaşmayı engellemenin yollarını içeren çok sayıda yaklaşıma dayanacaktır. Laboratuvarda sıtma parazitlerinin sivrisinek aşamalarını incelemek için, insan konakçıdan sivrisinek vektörüne bulaşmak için gerekli bir parazit aşaması olan son derece bulaşıcı Plasmodium falciparum gametositlerini kültüre etmek için bir protokol optimize ettik. P. falciparum gametositleri yaklaşık 1-2 hafta süren morfolojik olarak farklı beş adımla olgunlaşır. Bu protokolde açıklanan gametosit kültürü 15 günde tamamlanır ve 15-18. günlerden itibaren sivrisineklere bulaşıcıdır. Bu protokoller, sürekli bir enfeksiyon yetkin gametosit döngüsünü sürdürmek ve parazitin sivrisinek aşamalarının kesintisiz tedarikini sağlamak için geliştirilmiştir. Burada, gametosit kültürünün metodolojisini ve cam membran besleyiciler kullanarak sivrisineklerin bu parazitlerle nasıl enfekte olduğunu açıklıyoruz.
Introduction
Sıtma Plazmodium parazitlerinden kaynaklanır ve omurgalı konaklarına dişi Anopheles sivrisineklerinin bulaşıcı ısırması yoluyla bulaşır. Dünya Sağlık Örgütü'nün (WHO) 2019 raporuna göre, toplam 228 milyon sıtma vakasından tahmini 405.000 ölümoldu 1. Sıtmaya bağlı ölümlerin çoğu, özellikle beş yaşın altındaki çocuklar arasında Afrika bölgesinde yoğunlaşmıştır. Sıtmanın genel görülme oranı 2010 yılından itibaren küresel olarak azalırken, son yıllarda düşüş platolanmıştır ve hastalığı ortadan kaldırmak için acilen ek kontrol stratejilerine ihtiyaç vardır.
Sıtma parazitlerinin döngüsel aseksüel kan evreleri hastalık patogenezine neden olur ve bunların küçük bir alt kümesi kadın ve erkek gametositlerine ayrılır. Plazmodium falciparum gametositler, morfolojik olarak farklı beş aşamadan geçerek 7-10 gün sürdükleri için doğada benzersizdir. Aşama I'den IV'e olgunlaşmamış gametositler kemik iliği parankiminde inzdidadır ve büyük ölçüde periferik dolaşımda yoktur2,3,4,5. Olgun evre V gametositlerle enfekte olmuş eritrositler kan dolaşımında serbest bırakılır ve sivrisinekler tarafından alınmak üzere serbestçe dolaşır. Sivrisinek midgut içine girdikten sonra, gametositler, sıcaklıktaki bir değişiklik ve midgut ortamına maruz kalma yoluyla aktive edilir, dişi ve erkek gametlere dönüşür ve sivrisinek tükürük bezlerindeki sporozoitlerin enfektif aşamaları ile sonuçlanan sivrisinek aşamalarının geliştirilmesine başlar6,7.
Trager ve Jenson8 P. falciparumkültürü için standartlaştırılmış bir yöntem tanımladığından, aseksüel kan aşamaları üzerine çalışmalar büyük ölçüde ilerlemiştir. Bununla birlikte, cinsel aşamalar için güvenilir bir kültür sisteminin olmaması, P. falciparum gametositlerini, iletim biyolojisini ve sivrisinek aşamalarını incelemeyi zorlaştırmıştır. Son yıllarda, gametosit kültürlerinin kurulmasında laboratuvarlara yardımcı olan çeşitli yöntemler yayınlanmıştır9,10,11,12. Bu makale, sıtma araştırma topluluğu için değerli bir kaynağı temsil edebilecek P. falciparum gametositleri kültürü için standartlaştırılmış ve güvenilir protokolü açıklar. Bu yöntem, standartlaştırılmış bir sivrisinek besleme protokolü ile birlikte son derece güvenilir sivrisinek enfeksiyözitesi ile sonuçlanan olgun ve bulaşıcı gametositlerin sağlam üretimini sağlar. Bu yöntemler, gametositlerin ve sivrisinek evresi parazitlerinin kesintisiz tedarikini sağlamak için kurulmuştur. Bu yazıda, kapsamlı bir gametosit kültür protokolü (Şekil 1), cam membran besleyicilerin hazırlanması ve bu membran besleyiciler kullanılarak sivrisineklerin enfeksiyonu (Şekil 2), midgut diseksiyonu (Şekil 3) ve sivrisineklerin tükürük bezi (Şekil 4) ve midgut ve tükürük bezi diseksiyonu sonrası sivrisinekte enfeksiyonun nicelleştirilmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan kan almalar Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. P. falciparum, biyogüvenlik seviye 2 (BSL2) tesisinde steril koşullar altında taze RBC'lerde kültürlenir ve biyolojik malzemelerin işlenmesinde dikkatli olunması gerekir. Kan veya kan ürünlerini içeren her adımdan sonra, her plastik veya cam eşya, uygun imhadan önce kaputun içinde% 10 çamaşır suyu ile durulanır.
1. Reaktifler ve hazırlık
- Parazit izole P. falciparum NF54 (bkz. Malzeme Tablosu)kullanıldı, bu da sürekli kültürdeyken iki aya kadar enfeksiyöz gametosit üretebilir.
NOT: Kültüre uyarlanmış tüm parazit çizgileri gametosit üretmez ve düşük geçişli NF54 izolatları en tutarlı olanıdır. - O+ Eritrositler: Eşit hacimde RPMI 1640 ortam ve santrifüj ekleyerek tüm kanı 500 x g'da oda sıcaklığında 5 dakika boyunca, deaklerasyon 0 olarak ayarlanmış bir rotorda seyreltin. Süpernatant ve buffy paltoyu (plazma ve paketlenmiş eritrositler arasında beyaz bir bant, beyaz kan hücrelerinin ve trombositlerin çoğunu içeren) dikkatlice çıkarın ve eşit hacimde RPMI ekleyin. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın ve son yıkamadan sonra 4 °C'de depolama için% 50 hematokrit elde etmek için bir pelet hacmi RPMI ekleyin.
NOT: Gametositler iki haftalık bir süre içinde olgunlaşır, bu da kültürlere taze eritrositlerle başlamayı kritik hale getirir, genellikle bir hafta içinde çizilen eritrositler iyi çalışır. - O+ İnsan Serumu: Farklı bireylerden serumdaki normal varyasyonun etkisini en aza indirmek için en az 6 ünite serumu bir araya getir. Havuzalanmış insan serumunu 0,2 μm filtrasyon şişeleri kullanarak sterilize edin. aliquot 50 mL veya daha az porsiyonlarda ihtİyada göre ve -20 °C'de saklayın.
NOT: Eritrosit ve serumun P. falciparum kültürleri için uyumlu bir kan grubuna ait olması gerekir. - 500x Hipoksantin (100 mL) çözeltisi: 1 M NaOH'un 100 mL'sinde 0,5 g hipoksantin çözün. Filtre sterilize edin ve depolama için 5-10 mL aliquots yapın. Stoklar -20 °C'de bir yıla kadar ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
- Sodyum bikarbonat (İsteğe bağlı): 7,5 g sodyum bikarbonat'ı 100 mL deiyonize, doku kültürü sınıfı suda çözün ve 0,2 μm filtre ile sterilize edin.
NOT: Bu protokol, P. falciparum in vitro kültürü için mikroaerofilik koşullar sağlamak için mum kavanozu yöntemini kullanır ve sodyum bikarbonat gerektirmez. Bununla birlikte, parazitler bir sıtma gazı karışımı (%5 O 2 ,%5CO2 ve% 90 N2)kullanılarak kültürlenirse, kültür medyasını% 0,2 sodyum bikarbonat ile takviye etmek önemlidir. - Tam medya: 500 mL tam ortam hazırlamak için 500 mL RPMI 1640'a 1 mL hipoksantin çözeltisi ve 50 mL havuzlu insan serumu ekleyin. Sıtma gazı karışımı kullanıyorsanız% 7,5 sodyum bikarbonat 15 mL ekleyin. Tam ortamı 4 °C'de saklayın ve tam ortamın rengi turuncudan pembeye değişirse atın. İsrafı önlemek için, üç gün içinde kullanılacak kadar eksiksiz ortam yapın.
- Eksflagellasyon ortamı (İsteğe bağlı): 200 mg NaHCO 3 ,5mg Hipoksantin ve 100 μL ksanurenik asit (sudaki 100 mM stoktan) 100 mL eksik ortama (glutamin ve HEPES ile RPMI 1640) eriterek eksflagellasyon veya ookinete ortam yapın.
NOT: Eksflagellation, gametositlerle enfekte olmuş kan unu aldıktan birkaç dakika sonra dişi Anopheles sivrisineklerinin ortagutu içinde erkek gamet oluşumu işlemidir. Plasmodium'un erkek gametositleri, bir eksflagellation olayından sonra 8 erkek gametes'e yol açtı. İn vitro, bu işlem kültür sıcaklığı oda sıcaklığına (RT) düşürildiğinde kendiliğinden gerçekleşir ve kültürlü olgun gametositlerde gözlenebilir. - N-Asetilglukozamin (İsteğe bağlı): Su veya eksik ortamda 500 mM stok N-asetilglukozamin çözeltisi yapın, aliquot ve -20 °C'de saklayın.
- NaCl çözümleri: 0.9 g, 1.6 g ve 12 g NaCl'yi 100 mL doku kültürü sınıfı deiyonize suda çözünerek %0.9, %1.6 ve %12 NaCl çözümleri yapın. Filtre 0,22 μm filtre ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
2. P. falciparum aseksüel sahne kültürü
- Parazit kültürüne başlamak için, sıvı azot tankından P. falciparum NF54'ün düşük geçişli donmuş şişesini çıkarın ve 37 ° C'de ayarlanan su banyosunda hızla çözün.
- İçeriği (~1 mL) 50 mL steril santrifüj tüpüne aktarın ve damla yönünde 0,2 hacim önceden ısınmış% 12 NaCl eklerken, eşit karıştırmayı sağlamak için tüpü hafifçe sallayın. Aralıklı hafif titreme ile RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Nazik karıştırmaya devam ederken 9 adet %1,6'lık NaCl damla yönünde ekleyin. İçeriği RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj edin, süpernatantı dikkatlice atın. Parazit peletini sürekli olarak karıştırdığından emin olurken, 9 cilt% 0.9 NaCl damla yönünde ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da tekrar santrifüj.
- İçeriği 6 kuyu doku kültürü plakasının bir kuyusuna aktarın ve 100-200 μL paketlenmiş RBC ekleyin.
- Parazit kültürünü 37 °C'de bir mum kavanozunda veya %5 O2,%5 CO 2 ve %90N2 özel gaz karışımı ile temizlenmiş modüler bir inkübatör odasında kuluçkalayın.
- Her gün medyayı değiştirin ve düzenli medya değişikliği sırasında kültür süpernatantı aspire edildikten sonra yerleşik RBC katmanından birkaç mikrolitre çekerek ince bir kan lekesi yaparak büyümeyi izleyin.
- Çizmek için steril cam Pasteur pipet kullanın ve ardından slayta bir damla kültür aktarmak için cam slaydın ortasına dokunun. Damlanın önüne başka bir cam slayt yerleştirin ve RBC'lere temas etmek için geri çekin, RBC monolayer'ın ince lekesini yapmak için bir hareketle hızla ileri itin.
- Kaydırağı yatay olarak kurutma rafı üzerine yerleştirin ve havanın kurumasına izin verin. Mutlak metanol smear üzerine bırakarak kan lekesini düzeltin. Sabit lekenin tamamen kurumasını bekleyin ve ardından kan lekesi tamamen kaplanana kadar suda taze seyreltilmiş% 10 Geimsa lekesini dikkatlice dökün. Hücrelerin yaklaşık 15 dakika lekelemesine izin verin.
- Kaydırağı temiz musluk suyu altında durulayarak fazla lekeyi yıkayın ve slaytların dikey konumda kurumasını bekleyin.
- Yağ daldırma 100x amacı kullanarak ince kan lekelerini mikroskopta görüntüleyerek parazitmiyi belirleyin. Yüzde parazitmiyi belirlemek için toplam en az 500 RBI arasında enfekte eritrositlerin sayısını sayın.
3. P. falciparum gametocyte kültürü
NOT: Gametosit kültürlerinin sivrisineklere bulaşıcı olgun gametositler üretmesi iki hafta sürer. Gametosit kültürünün adımları Şekil 1'de özetlenmiştir. P. falciparum izoleleri genellikle uzun süreli in vitro kültürden sonra gametosit üretme yeteneğini kaybeder13. Gametositlerin kalitesini sağlamak için, kültür çözülmeden bu yana en fazla 2 aylık olan düşük pasaj besleyici kültüründen başlatılmalıdır. 37 °C'ye kadar önceden ısıtın ve tüm prosedürleri 38 °C'de bir slayt ısıtıcısı üzerinde gerçekleştirin. Sıcaklık dalgalanmalarını en aza indirmek için gametosit kültürlerinin uzun süre inkübatörden çıkmadığından emin olun.
- %4 hematokritte %0,3-1 parazitmide karışık aseksüel sahne besleyici kültürünü kullanarak gametosit kültürünü (gün 0) tohumleyin.
- Altı kuyu gametosit kültürü kurmak için RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da 5 mL besleyici kültürünü santrifüjleyin.
- 1,2 mL paketlenmiş RBC ekleyin, karıştırın ve 6 kuyu plakasının her kuyusuna 5 mL dağıtın ve 37 °C'de bir mum kavanozunda kuluçkaya yatırın.
NOT: Yukarıda açıklanan gametosit kültürü, %5 parazitmide karma aseksüel sahne besleyici kültürüne dayanmaktadır. - Kan hücrelerinin çıkarılmasını önlemek için yaklaşık% 70-80 kültür üstnatantını dikkatlice arzulayarak, taze kan ilavesi olmadan 15-18 gün boyunca her gün medya değiştirin.
- Her kuyuya 5 mL taze komple ortam ekleyin. Ortam değiştirirken, yerleşik RBC tabakasını rahatsız etmemek için kuyunun duvarına serolojik bir pipet kullanarak yavaşça medya ekleyin.
NOT: Medya değişimi sırasında kültür ortamının 1-2 mL'si bırakılacağından, gametosit kültürünün 1. gününden sonra toplam kültür hacmi 6-7 mL arasında olacaktır. Bu protokolü uyarlarken, parazitlerin sağlıklı olduğundan emin olmak için her alternatif günde bir kan lekesi yapılması tavsiye edilir. Kan lekesi yapmak genellikle kültürdeki hücre sayısını alabilir. Bunu önlemek için çok küçük bir hacim çizin. - Olgun gametosemiyi ölçmek için, 15-18 gün arasında kan smear yapın ve toplam hücre sayısı arasında olgun gametositlerin sayısını sayın.
NOT: Olgun gametositler, pürüzsüz yuvarlatılmış uçlu klasik hilal şekilleriyle kolayca tanımlanabilir (Şekil 5B). - En az 1.000 RBI sayın ve olgun gametositlerle enfekte olmuş RBC'lerin yüzdesini hesaplayın.
- Eksflagellation olaylarını ölçmek için, önceden ısıtılmış bir tüpte RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da 200 μL gametosit kültürü ve santrifüj alın. Peleti 20 μL eksflagellation ortama yeniden aktarın ve kapak kayması ile cam bir kaydırağa aktarın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika inkübasyondan sonra, 10x amaç kullanarak faz kontrast modunda eksflagellation merkezlerini saymaya başlayın. Eksflagellation olaylarını hesaplamak için en az dört alandaki eksflagellation merkezlerini sayın.
NOT: Daha önce Delves veark. Alan başına 20'den fazla eksflagellasyon olayı membran besleme tahlilleri için uygun kabul edilir. - Gametosit kültürleri genellikle düşük düzeyde artık aseksüel aşamalara sahiptir. Deney saf gametositler gerektiriyorsa, kültürü 50 mM N-asetilglukozamin ile tedavi edin.
- Kalan aseksüel aşamaları temizlemek için ortamı değiştirirken en az 3 gün boyunca kuyu başına 10x stok çözeltisinden (5 mL) 0,5 mL N-asetilglukozamin ekleyin.
NOT: N-asetilglukozamin cinsel olarak işlenen merozoitelerin istilaını da engelleyebilir, tedavi sadece gametosit kültürünün 7.
4. Standart membran besleme tahlili (SMFA) kullanılarak sivrisinek enfeksiyonu
NOT: Tüp bebek olarak yetiştirilen gametositler cam membran besleyiciler kullanılarak sivrisineklere beslenebilir. Kan besleme cihazının kurulması Şekil 2'de gösterilmiştir. Yukarıda açıklandığı gibi, sivrisinekler tarafından yutlmadan önce aktivasyonu önlemek için gametositleri her zaman 37 ° C'de saklanın. 37 °C'ye kadar gametosit kültürü ile kullanılan ön ısıtmalı plastik eşyalar, reaktifler ve ekipmanlar.
- 3-7 günlük dişi Anopheles sivrisineklerini, membran beslenmeden önce şekerli sularını 6,5 saat veya bir gece boyunca çıkararak aç bırakın.
- Motorlu veya ağızla çalışan aspiratörler kullanarak çift kat ince örgü kumaşla kaplı kağıt bardaklara aktarın. Alternatif olarak, sivrisinekleri kağıt bardaklara aktarmak için soğuk bir odada veya buzdolabında devirin.
NOT: Bir litrelik bardak, 100'e kadar sivrisinek beslemek için kullanılabilir. - Santrifüj, RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da kan yıkadı ve süpernatantı attı. Tüm kanı yeniden inşa etmek için eşit miktarda taze çözülmüş insan serumu ekleyin. Kan ve serum karışımını 30 dakika boyunca 37 °C'de ayarlanan su banyosuna aktarın.
- Gametosit kültürünü önceden ısıtılmış 15 mL plastik tüpe ve santrifüje 600 x g'da 37 °C'de 5 dakika aktarın. Yukarıda açıklandığı gibi olgun gametostemi belirlemek için kültür üstnatantını dikkatlice emiş ve ince kan lekesi yapın.
- Son kan beslemesini yapmak için, gametosit peletini yeniden inşa edilmiş tam kan kullanarak istenen konsantrasyona seyreltin. Sivrisinekler ve cam besleyiciler hazır olana kadar kan yemini 37 °C'de tutun.
NOT: % 0.02 ila 0.3 arasındaki olgun gametosit konsantrasyonları tutarlı sivrisinek enfeksiyözyitesi sağlayacaktır. Bununla birlikte, farklı sivrisinek bardaklarına çeşitli konsantrasyonları besleyerek gametosemiyi optimize etmek tavsiye edilir. - Cam membran besleyicilerin iki açıklığa, enfekte kanı pipetlamak için dar bir üst açıklığa ve membran ataşmanı için bir alt açıklığa sahip olduğundan emin olun. Bir parafin filmini kareler halinde kesin, eşit kalınlığa kadar uzatın ve kan yemine kapalı bölme oluşturmak için besleyicinin açıklığına yapışın.
- Membran besleyicilerin etrafındaki ceketten ılık suyun geçmesine izin vermek için her iki taraftaki boruları bağlayarak membran besleyicileri dolaşım suyu banyosuna takın.
NOT: Birden fazla besleme koşuluna uyum sağlamak için çeşitli cam besleyiciler seri olarak bağlanabilir. - Tüm besleyiciler su banyosuna bağlandıktan sonra açın ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
- Besleyicileri, membran tarafı aşağı ve kelepçe veya bant kullanarak besleyicileri sabitlemiş sivrisinek bardaklarına ağ örme merkezine yerleştirin. Membran besleyicilerin, sivrisineklerin fincanın içinden erişmesine izin vermek için kan yeminin eşit dağılımına ve tüm besleyicinin bardaklardaki ağlarla yakın temasına izin vermek için herhangi bir tarafa eğilmediğinden emin olun.
- Pipet yaklaşık 200-1000 μL kan membran besleyicilere beslenir.
NOT: Kan yeminin hacmi, sivrisinek sayısına ve membran besleyicinin büyüklüğüne bağlı olarak değişecektir. 14 mm cam besleyici ve 50 sivrisinek için 200 μL kan yemi kullanın. - Yüklemenin düzgün yapıldığından ve parafin filmine kan akışının üst üste bindirildik yerinden emin olun.
- Sivrisineklerin aralıklı izleme ile yaklaşık 30 dakika beslenmesine izin verin.
NOT: İyileştirilmiş kan beslemeye neden olacak CO2 sağlamak için sivrisinekleri ağızla hafifçe üfleyin. - Arıtılmamış sivrisinekleri soğuk bir odaya yıkarak çıkarın. Taze kan unu işareti olarak sivrisinekleri karın bölgesinde şişkinlik ve kızarıklık açısından gözle görülür bir şekilde inceleyin. Alternatif olarak, beslenmemiş sivrisinekleri seçici olarak çıkarmak için ağız tarafından işletilen bir aspiratör kullanın.
- Beslenmemiş sivrisinekleri% 70 etanol içine batırdıktan sonra atın ve beslenen sivrisinekleri sivrisinek kabına geri koyun.
- Çift kafesli sivrisinek bardakları ve insan sıtma paraziti P. falciparumile enfekte sivrisinekler için belirtilen yüksek muhafaza inkübatörüne aktarın.
- Şeker unu sağlamak için sivrisinek bardaklarına% 10 sakkaroza batırılmış pamuklu pedler yerleştirin. Sivrisinekler parçalanana kadar pamuklu pedleri her gün değiştirin.
5. Sivrisinek orta bağırsak diseksiyonu ve oosist yük nicelemesi
NOT: Şekil 3'te midgut diseksiyon şeması gösterilmiştir.
- Kan beslemeden 7-8 gün sonra, sivrisinekleri devirmek için sivrisinek bardaklarını 10 dakika boyunca 4 °C'ye aktarın.
- İnce uçlu tokmaklar kullanarak buz üzerinde bir Petri kabına parçalanacak sivrisinekleri aktarın.
- Sivrisinekleri ötenazi yapmak için 1-2 dakika boyunca% 70 etanolde bekletin. Tüm sivrisinekler ötenaziden sonra etanolden temizlemek için Petri kabına PBS ekleyin.
NOT: PBS eklemeden önce tüm sivrisineklerin öldüğünden emin olun. - Merkezde mikroskop ve pipet 100 μL PBS'yi parçalara alan bir cam slayt takın. Bir sivrisineği askıları kullanarak PBS'ye dikkatlice aktarın ve sivrisineklerin geri kalanını Petri kabında buz üzerinde bırakın.
- İnce uçlu tostu kullanarak, dişin üçüncü segmentini sivrisinin arka ucundan tutun ve ikinci tops ile karın arasındaki kavşağı tutun. Midgut tamamen açığa olana kadar karnı hafifçe çekin.
- Sivrisinek dokusunun geri kalanını atın ve midgut'u birkaç damla PBS içeren temiz bir slayda aktarın.
- İstenilen sayıda sivrisinek parçalandığında, PBS'yi bir pipet kullanarak dikkatlice çıkarın ve midgut'u 2-5 dakika boyunca% 0.2 mercurochrome ile lekelendirin.
- Işık mikroskobu altında kolayca görselleştirilebilmeleri için slayttaki fazla cıvakrom ve diziliş midgutlarını çıkarın.
- Bir kapak kayması yerleştirin ve her midgut'a 10x hedefinin altındaki oosistleri sayın. Oosistler pembeyi lekeler ve dairesel şekilli (Şekil 6C).
6. Sivrisinek tükürük bezi diseksiyonu ve sporozoit yük nicelemesi
NOT: Tükürük bezi diseksiyonunun şeması Şekil 4'te gösterilmiştir.
- Kan beslemeden 14-18 gün sonra, 10 dakika boyunca 4 °C'ye sivrisinek bardakları yerleştirin.
NOT: Sivrisinekler hareket etmeyi durdurana kadar beklemek önemlidir. - Sivrisineklerin hareket etmesini beklerken, diseksiyon için araçlar hazırlayın.
- Diseksiyon mikroskop aşamasına bir cam plaka yerleştirin. 1 mL şırıngalar ve 9" Pasteur pipet ve kauçuk ampul üzerinde 2 set 25 G iğne hazırlayın. %70 EtOH ve diseksiyon ortamını (HBSS, L-15 veya PBS) 6 kuyu plakasına yerleştirin.
- Soğuk odada, uyuşturulduğu sivrisinekleri% 70 EtOH içeren 6 kuyu tabağına aktarın. Tüm sivrisineklerin ıslatılmasını sağlamak için sivrisinekleri kümes hayvanlarıyla hafifçe hareket ettirün, ardından sivrisinekleri% 70 EtOH'yi yıkamak için tokalar kullanarak diseksiyon ortamına aktarın.
- Diseksiyon odasına geçin ve sivrisinekleri bir diseksiyon mikroskop aşamasına yerleştirin.
- Sivrisineklerden fazla ortamı çıkarın, diseksiyon sırasında gerektiği gibi yeni ortam ekleyin. Sivrisineklerin kurumasını önle, ancak çok fazla sıvı diseksiyonu daha zor hale getirir.
- 25 G iğneli 2 şırınga kullanarak, sivrisinek toraksını ve başını tutun ve tükürük bezlerini torakstan çekmek için başı hafifçe yukarı çekin.
- Tükürük bezlerini bir iğne ile kafadan ve torakstan ayırın.
- Geçici olarak tükürük bezlerini cam plaka üzerinde ayrı bir orta damlacık içine yerleştirin.
- 15-20 tükürük bezini parçaladıktan sonra Pasteur pipeti kullanarak düşük tutma tüpünde toplayın.
NOT: Tükürük bezleri Pasteur pipetinin geniş kısmına girdikten sonra, cama yapışırlar ve onları çıkarmak zordur. - Pelet tükürük bezleri kısa darbe ile masa üstü santrifüjde döner. Diseksiyon ortamını peletin bozulmasına neden olmadan çıkarın ve 100 μL yeni diseksiyon ortamı ekleyin.
- Sporozoit elde etmek için tükürük bezlerini 1 dakika boyunca küçük bir homojenizatörle öğütün.
- Bir hemositometreye sporozoitler içeren 10 μL diseksiyon ortamı yerleştirin.
NOT: Tükürük bezlerinin sayısına bağlı olarak, sporozoit çözeltisini saymadan önce orta ile 1:10 ila 1:50 arasında seyreltmek gerekebilir. - Dört çeyreğin ikisinde sporozoit sayısını sayın ve sporozoit / sivrisinek sayısını hesaplayın:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, yukarıdaki protokol kullanılarak oluşturulan P. falciparum NF54 gametocyte kültürleri kullanılarak bir dizi membran beslemesinden elde edilen sonuçları sunuyoruz (bkz. Gametosit kültürü, 0. günde yaklaşık %0.5 karışık evre aseksüel kültürle başlatıldı ve bu kültür 4. Bu yüksek parazitmide Şekil 5A'da gösterildiği gibi, parazitler strese girer ve aseksüel sahne kültürü çökür. Bununla birlikte, bu stres birlikte gametositogenez indüksiyonu ile sonuçlanır. Erken gametositler 6. Aseksüel evre parazitlerinin varlığı sivrisinek besleme deneylerini etkilemedi. Bununla birlikte, gametositler ilaç duyarlılığı tahlilleri ve proteomik veya transkriptomik çalışmalar gibi saf kültürler gerektiren deneylerde kullanılacaksa, 50 mM N-asetilglukozamin ile tedavi edilerek artık aseksüel aşamalar çıkarılabilir. Gametositlerin çoğu, sivrisineklere bulaşıcı hale geldiklerinde ve beslenmeye hazır oldukları 15. Gametosit kültürünün başlatılmasından sonra farklı zaman noktalarında Giemsa lekeli kan lekelerinin temsili görüntüleri Şekil 5B'de gösterilmiştir.
Kan beslemeden 8 ila 10 gün sonra, sivrisinekler enfeksiyonun yaygınlığını ve yoğunluğunu belirlemek için diseksiyon edildi. Yaygınlık, her sivrisinekte bulunan oosist sayısı yoğunluk iken, oosistlere sahip beslenen sivrisineklerin yüzdesidir. Her ikisi de yemin başarısının önemli göstergeleridir. 5 bağımsız sivrisinek yeminden elde edilen veriler Şekil 6'da gösterilmiştir. Beslemeler, P. falciparum NF54'ün 16. Oosist yoğunlukları, gametositlerin sivrisinek enfeksiyatifliğini belirlemek için nicel veriler sağlar ve yaygınlık, enfekte olan beslenen sivrisineklerin yüzdesini gösterir. Bu veriler, iletim engelleme ajanlarını değerlendirmek ve bulaşmayı engelleyen aşı ve ilaçlara yönelik hedefleri belirlemek ve karakterize etmek için kullanılabilir. İosistlerin sayısı hem deneyler içinde hem de arasında değişti ve çeşitli deneysel koşulların etkisini belirlemek için kohort başına 25-50 sivrisinek gerekliydi.
Oosist yoğunlukları çoğu iletim engelleme tahlillerinin ve stratejilerinin son noktası olarak kabul edilir, ancak sporozoit sayısı genellikle sporozoit biyolojisi ve karaciğer aşaması çalışmaları için önemlidir. Tablo 1, 12 bağımsız kan yeminden sivrisinek başına elde edilen ortalama sporozoit sayısını göstermektedir. Tabloda gösterildiği gibi, ortalama sporozoit sayısı tutarlıydı, ancak testlerin zaman zaman başarısızlığını temsil eden sıfır sporozoit elde ettiğimiz bir deney vardı.
Şekil 1: P. falciparum gametocyte kültürünün iş akışı ve membran besleme protokolü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sivrisinek kanı besleme kurulumu. (A) Cam besleyici ve dikdörtgen parafin filmi parçası (B) Parafilm membran ataşmanı öncesi ve sonrası görüntülenen iki cam besleyici (C) Sivrisinek kabının üzerine cam besleyici ve sirkülasyon suyu banyosu ile bağlantılı. (D,E) Kan yeminin cam besleyiciye pipetletlanması (F) Kan yeminin homojen dağılımını gösteren cam besleyicinin alt görünümü (G) Parafilm membran yoluyla beslenen birkaç sivrisinek. (H) Beslemeden sonra sivrisinek bardaklarının üst görünümü, besleme sivrisinekleri tarafından atılan kan damlalarını fincanın dibinde gösterir. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sivrisinek midgut diseksiyonunun adımlarını gösteren grafiksel gösterim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Sivrisinek tükürük bezi diseksiyonunun adımlarını gösteren grafiksel gösterim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: P. falciparum gametocyte kültürü ve enfekte sivrisinek midgut üzerinde oosist görselleştirme. (A) 15 günlük gametosit kültürünün zaman seyri, aseksüel aşamaların ilk 4 gün içinde parazitmiyi zirveye çıkarmak için dik çoğalmasını ve ardından zaman içinde gametositogenez ve olgunlaşmayı gösterir. (B) Gametosit kültürünün çeşitli aşamalarını gösteren Geimsa lekeli ince kan lekesi, 1. gün erken aseksüel evre, 4. gün aseksüel parazitmi, yüksek parazit yükü nedeniyle 6. gün stresli kültür, 9 & 12. gün erken gametositler ve olgun erkek ve kadın gametositleri gösteren 15. Morfolojik olarak erken evre gametositler aseksüel aşamalardan ayırt edilemezdi, ancak geç aşama II, sivri uçlu hilal şeklini gösterdi ve parazit evre III ve IV'e geliştikçe uzatıldı. Olgun aşama V gametositler, ancak, yuvarlak uçları ve minimum konak hücre görünürlüğü ile klasik hilal şekli ile karakterize edildi14. Ölçek çubuğu = 10 mm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: P. falciparum oosistler sivrisinek midgut başına sayılır. (A) Grafik yıllar boyunca oosist sayılarını gösterir, her deney için sivrisinekler% 0.3 gametositlerle beslendi ve 8. Her nokta, tek tek midgutlardan gelen oosistlerin sayısını ve yatay çizgi ortanca değeri temsil eder. (B) Tablo ortalama oosist sayısını, enfekte sivrisineklerin yaygınlığını ve enfeksiyon aralığını gösterir. (C) Farklı büyütmelerde iki ayrı kan besleme deneyinden sivrisinek midgut üzerinde oosistleri gösteren resimler. Ölçek çubuğu = 150 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Deney | Diseksiyon günü (kan besleme sonrası) | Ortalama sporozoite/sivrisinek |
| 1 | 14 | 42, 000 |
| 2 | 14 | 40, 000 |
| 3 | 14 | 42, 750 |
| 4 | 15 | 25, 411 |
| 5 | 15 | 33, 750 |
| 6 | 14 | 15, 750 |
| 7 | 16 | 0 |
| 8 | 15 | 33, 200 |
| 9 | 14 | 56, 333 |
| 10 | 14 | 45, 333 |
| 11 | 17 | 43, 750 |
| 12 | 16 | 56, 000 |
Tablo 1: 2 yıllık bir süre boyunca 12 bağımsız döngü için sivrisinek başına ortalama tükürük bezi sporozoit sayısı. A. stephensi sivrisinekleri% 0.3 P. falciparum gametositleri ile beslendi ve 14-17 gün arasında 15-20 sivrisinek kan besleme sonrası parçalandı. Sivrisinek başına ortalama sporozoit sayıları gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntemler Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü'nde 10 yıldan fazla bir süredir başarıyla kullanılmaktadır15,16,17,18,19,20,21,22. Bu protokol kullanılarak üretilen gametositler, yüksek verimli gametositocidal tahliller22, proteomik15ve transkriptomik23 çalışmaları için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemleri geliştirmenin önemli bir nedeni, sivrisinek aşamaları ve sporozoitler23 , 24 , 25,26üzerinde yapılan çalışmalar için sivrisinekleri enfekte etmek için olgun gametositleri kullanmaktır. Bu makale, cam membran besleyiciler kullanarak olgun P. falciparum gametositleri ve sivrisineklerin enfeksiyonunu üretmenin ayrıntılı bir protokolünü açıklar. Bu yöntemler, iletim engelleme stratejileri, sporozoit aşamaları ve P. falciparum'un ön eritrosit karaciğer aşamaları üzerinde çalışan herhangi bir laboratuvar için kritik öneme sahiptir.
Ifediba ve Vanderberg 1981 yılında P. falciparumuzun vadeli kültür tarif , 50 μg / mL hipoksinatin varlığında hangi son derece bulaşıcı olgun gametositler üretti27. O zamandan beri farklı uygulamalar için gametosit üretme yöntemlerini açıklayan çok sayıda yayın olmuştur9,10,11,12. Bu yayınların çoğu, verimi artırmak için daha önce tanımlanmış gametositogenez indükleyici koşulları kullanır. Şartlı medya kullanarak, ani parazitmi artışı ile kültürü vurgulamak, anemiyi taklit etmek için hematokritte düşüş, kırmızı kan hücresi lizisi ve toplu olarak log faz baskısı, gametositogenez indük etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan yöntem basit ve zaman test edilir. Gametosit kültürünü% 4 hematokritte% 0.3-1 aseksüel evre parazitmi ile başlatın ve 15-18. güne kadar her gün ortam değiştirin. Tutarlı sonuçlar elde etmek için, düşük geçişli aseksüel evre parazitleri ile gametosit kültürüne başlamak, taze RBC'ler (<1 hafta) kullanmak ve medya değişikliği sırasında kültür sıcaklığının dalgalanmamasını sağlamak önemlidir. Falciparum gametosit geliştirme süreci kemik iliği4,5'tekiekstravasküler boşlukların statik koşullarında inzdida gerçekleştiğinden, kültür dönemi boyunca yerleşik RBC katmanlarını rahatsız etmemek önemlidir.
P. falciparum gametocytes'i tutarlılıkla kültlemek talep ediyor, ancak sivrisinekleri enfekte etmelerini sağlamak başka bir karmaşıklık seviyesi sunuyor. Membran besleme, sivrisinek yaşı ve zindeliği, midgut mikrobiyotası ve beslenme davranışı28,29gibi gametositler dışında çeşitli değişkenlere tabidir. Genellikle SMFA verileri yüksek derecede değişkenlik gösterir ve farklı deneysel koşulların etkilerini tanımlamak için çok sayıda sivrisinek gerektirir11,28. Gametositler için düşük geçiş kültürü, sağlıklı 3 - 6 günlük sivrisinekler ve optimize edilmiş membran besleme protokolü kullanmak, oosist sayılarındaki farklılıklara yardımcı olabilir.
Burada hem gametosit yetiştiriciliği hem de membran besleme için açıklanan protokol uzun yıllar boyunca optimize edilmiştir. Bu yöntemler, olgun iletim yetkin gametositler, standart membran besleme tahlilleri, sivrisinek midgut diseksiyonu ve oosist nicelemenin yanı sıra tükürük bezi diseksiyonu ve sporozoit nicelemesi elde etmek için ayrıntılı bir açıklama sağlar. Bu protokoller, güvenilir sivrisinek enfeksiyözlüğü ve sağlam oosist sayıları ve sporozoit verimleri sağlamak için gereken gametosit sayısı açısından tutarlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü'ne (JHMRI) finansal destek için Bloomberg Hayırseverlerine teşekkür ediyor. JHMRI böcek ve parazitoloji çekirdek tesisleri tarafından sağlanan uzmanlık olmasaydı bu çalışma mümkün olmazdı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
- World Health Organization.
- Sinden, R. E., Smalley, M. E. Gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro: The cell-cycle. Parasitology. 79 (2), 277-296 (1979).
- Sinden, R. E.
- Joice, R., et al. Plasmodium falciparum transmission stages accumulate in the human bone marrow. Science Translational Medicine. 6 (244), 5 (2014).
- Abdulsalam, A. H., Sabeeh, N., Bain, B. J. Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow. American Journal of Hematology. 85 (12), 943 (2010).
- Ghosh, A. K., Jacobs-Lorena, M. Plasmodium sporozoite invasion of the mosquito salivary gland. Current Opinion in Microbiology. 12 (4), 394-400 (2009).
- Bennink, S., Kiesow, M. J., Pradel, G. The development of malaria parasites in the mosquito midgut. Cellular Microbiology. 18 (7), 905-918 (2016).
- Trager, W., Jenson, J. B.
- Duffy, S., Loganathan, S., Holleran, J. P., Avery, V. M. Large-scale production of Plasmodium falciparum gametocytes for malaria drug discovery. Nature Protocols. 11 (5), 976-992 (2016).
- Delves, M. J., et al. Routine in vitro culture of P. Falciparum gametocytes to evaluate novel transmission-blocking interventions. Nature Protocols. 11 (9), 1668-1680 (2016).
- Habtewold, T., et al. Streamlined SMFA and mosquito dark-feeding regime significantly improve malaria transmission-blocking assay robustness and sensitivity. Malaria Journal. 18 (1), 24 (2019).
- Demanga, C. G., et al. The development of sexual stage malaria gametocytes in a Wave Bioreactor. Parasites and Vectors. 10 (1), 216 (2017).
- Brockelman, C. R. Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum. Journal of Eukaryotic Microbiology. 29, 454-458 (1982).
- Meibalan, E., Marti, M. Biology of malaria transmission. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 7, (2017).
- Essuman, E., et al. A novel gametocyte biomarker for superior molecular detection of the plasmodium falciparum infectious reservoirs. Journal of Infectious Diseases. 216 (10), 1264-1272 (2017).
- Simões, M. L., Mlambo, G., Tripathi, A., Dong, Y., Dimopoulos, G. Immune regulation of plasmodium is anopheles species specific and infection intensity dependent. mBio. 8 (5), 01631 (2017).
- Oakley, M. S., et al. Transcriptome analysis based detection of Plasmodium falciparum development in Anopheles stephensi mosquitoes. Scientific Reports. 8, 11568 (2018).
- Saraiva, R. G., et al. Chromobacterium spp. mediate their anti-Plasmodium activity through secretion of the histone deacetylase inhibitor romidepsin. Scientific Reports. 8, 6176 (2018).
- Tao, D., et al. Sex-partitioning of the Plasmodium falciparum stage V gametocyte proteome provides insight into falciparum-specific cell biology. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (10), 2705-2724 (2014).
- Grabias, B., Zheng, H., Mlambo, G., Tripathi, A. K., Kumar, S. A sensitive enhanced chemiluminescent-ELISA for the detection of Plasmodium falciparum circumsporozoite antigen in midguts of Anopheles stephensi mosquitoes. Journal of Microbiological Methods. 108, 19-24 (2015).
- Ferrer, P., Vega-Rodriguez, J., Tripathi, A. K., Jacobs-Lorena, M., Sullivan, D. J. Antimalarial iron chelator FBS0701 blocks transmission by Plasmodium falciparum gametocyte activation inhibition. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (3), 1418-1426 (2015).
- Sanders, N. G., Sullivan, D. J., Mlambo, G., Dimopoulos, G., Tripathi, A. K. Gametocytocidal screen identifies novel chemical classes with Plasmodium falciparum transmission blocking activity. PLoS One. 9 (8), 105817 (2014).
- Lindner, S. E., et al. Transcriptomics and proteomics reveal two waves of translational repression during the maturation of malaria parasite sporozoites. Nature Communications. 10, 4964 (2019).
- McLean, K. J., et al. Generation of Transmission-Competent Human Malaria Parasites with Chromosomally-Integrated Fluorescent Reporters. Scientific Reports. 9, 13131 (2019).
- Espinosa, D. A., et al. Proteolytic Cleavage of the Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein Is a Target of Protective Antibodies. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1111-1119 (2015).
- Swearingen, K. E., et al. Interrogating the Plasmodium Sporozoite Surface: Identification of Surface-Exposed Proteins and Demonstration of Glycosylation on CSP and TRAP by Mass Spectrometry-Based Proteomics. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005606 (2016).
- Ifediba, T., Vanderberg, J. P. Complete in vitro maturation of Plasmodium falciparum gametocytes. Nature. 294 (5839), 364-366 (1981).
- Miura, K., et al. An inter-laboratory comparison of standard membrane-feeding assays for evaluation of malaria transmission-blocking vaccines. Malaria Journal. 15, 463 (2016).
- Miura, K., et al. Qualification of Standard Membrane-Feeding Assay with Plasmodium falciparum Malaria and Potential Improvements for Future Assays. PLoS One. 8 (3), 57909 (2013).
