Summary
말라리아 기생충의 모기 단계에 대한 상세한 조사는 효과적인 전송 차단 전략을 설계하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 전염성 있는 게임토세포를 효과적으로 배양한 다음 이러한 게임토세포에 먹이를 주어 P. falciparum의모기 단계를 생성하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
말라리아는 중요한 이환율과 사망을 일으키는 원인이 되는 가장 중요한 공중 위생 문제 의 한개 남아 있습니다. 말라리아는 여성 Anopheles 모기에서 전염되는 바이트를 통해 전염되는 모기 매개 질병입니다. 말라리아 통제는 결국 모기를 통해 그리고 투과를 막는 쪽을 포함하는 접근의 다수에 의지할 것입니다. 실험실에서 말라리아 기생충의 모기 단계를 연구하기 위하여는, 우리는 모기 벡터에 인간 호스트에서 전송을 위해 요구되는 기생충 단계인 전염성이 높은 Plasmodium falciparum 게임토사이클을 배양하기 위하여 프로토콜을 최적화했습니다. P. falciparum 게임토세포는 약 1-2주가 걸리는 5개의 형태학적으로 뚜렷한 단계를 통해 성숙합니다. 이 프로토콜에 기재된 게임토세포 배양은 15일 이내에 완료되며 15-18일부터 모기에 감염된다. 이러한 프로토콜은 감염 유능한 게임토세포의 지속적인 주기를 유지하고 기생충의 모기 단계의 중단없는 공급을 유지하기 위해 개발되었다. 여기에서는 게임토세포 배양의 방법론과 유리 막 피더를 사용하여 이러한 기생충으로 모기를 감염시키는 방법을 설명합니다.
Introduction
말라리아는 플라스모듐 기생충에 기인하고 여성 아노페Les 모기의 전염성 바이트를 통해 그들의 척추 동물 호스트에게 전달됩니다. 2019년 세계보건기구(WHO) 보고서에 따르면 총 2억 2,800만 건의 말라리아1건에서약 405,000명의 사망자가 발생했다. 말라리아 관련 죽음의 대부분은 아프리카 지역에 집중되었습니다, 특히 5 세 이하의 아이들 중. 말라리아의 전반적인 부각 비율은 2010년부터 전 세계적으로 감소하는 동안, 최근 몇 년 동안 쇠퇴는 고원하고 추가 통제 전략은 질병을 제거하기 위하여 긴급하게 필요합니다.
말라리아 기생충의 순환 무성 혈액 단계는 질병 병인을 일으키는 원인이 되고 이들의 작은 부분 집합은 여성과 남성 게임토세포로 분화합니다. 플라스모듐 falciparum 게임 토세포는 5 개의 형태학적으로 뚜렷한 단계를 통해 개발하는 데 7-10 일이 걸리기 때문에 자연에서 독특합니다. 단계 I에서 IV까지미성숙한 게임토세포는 골수 parenchyma에서 격리되고 주로 말초 순환2,3,4,5에서결석남아 있습니다. 성숙한 단계 V 게임토세포에 감염된 적혈구는 혈류량에 방출되고 모기에 의해 채택되기 위하여 자유롭게 순환합니다. 일단 모기 미드구트 안에, 게임토세포는 미드구트 환경에 온도 및 노출의 변화를 통해 활성화되고, 여성과 남성 게임으로 변환하고 모기 단계의 발달을 시작, 이는 모기 타액선지6에서 산발성 의 감염 단계로절정6,7.
트레이거와 젠슨8이 P. falciparum배양에 표준화된 방법을 설명했기 때문에 무성혈액 단계에 대한 연구가 크게 진행되었습니다. 그러나, 성적 단계에 대한 신뢰할 수있는 문화 시스템의 부족은 P. falciparum 게임 토세포, 전염 생물학 및 모기 단계를 연구하기 어렵게 만들었습니다. 최근에는 게임토사이클 문화 9,10,11,12를설정하는실험실을도왔던 여러 가지 방법이 발표되었습니다. 이 원고는 말라리아 연구 커뮤니티에 귀중한 자원을 나타낼 수있는 문화 P. falciparum 게임 토세포에 표준화되고 신뢰할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 표준화 된 모기 먹이 프로토콜과 함께 매우 신뢰할 수있는 모기 감염성을 초래하는 성숙하고 전염성 있는 게임토세포의 견고한 생산을 가능하게합니다. 이러한 방법은 게임토세포와 모기 단계 기생충의 끊임없는 공급을 유지하기 위해 설립되었다. 본 원고에서는 철저한 게임토세포 배양프로토콜(도 1),유리막 피더의 준비 및 모기의 감염(도2),미드구트의해부(도 3)및 모기의 타액선(도 4)및 중구 및 타액 선해부 후 모기감염의 정량화를 설명한다.
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Protocol
아래에 설명된 혈액 수집은 존스 홉킨스 대학의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다. P. falciparum은 생물 안전 수준 2 (BSL2) 시설에서 멸균 조건하에서 신선한 RBC에서 배양되며 생물학적 물질을 처리하는 데주의를 기울입니다. 혈액 또는 혈액 제품을 포함하는 각 단계 후에, 모든 플라스틱 제품 또는 유리 제품은 적당한 처분의 앞에 후드 안에 10% 표백제로 헹구됩니다.
1. 시약 및 준비
- 기생충 분리 P. falciparum NF54 (재료의 표참조) 사용 되었다, 지속적인 문화 동안 최대 2 개월 동안 전염성 게임 토 세포를 생산할 수 있는.
참고: 모든 문화 적응 기생충 라인이 게임토세포를 생성하는 것은 아니며, 낮은 통로 NF54 분리가 가장 일관성이 있습니다. - O+ 적혈구: RPMI 1640 미디어와 원심분리기의 동일한 볼륨을 500 x g에서 500 x g로 추가하여 전혈을 희석시켜 0에서 가속이 설정된 스윙 아웃 로터에서 실온에서 5 분 동안 희석하십시오. 상체 및 버피 코트 (혈장과 포장 된 적혈구 사이의 흰색 밴드, 백혈구와 혈소판의 대부분을 포함하는) 조심스럽게 제거하고 RPMI의 동일한 볼륨을 추가합니다. 세척 단계를 두 번 반복하고 최종 세척 후 RPMI의 펠릿 부피 1개를 추가하여 4°C에서 보관할 수 있는 50% 헤마토크릿을 얻습니다.
참고: Gametocytes는 2주 동안 성숙하여 신선한 적혈구로 문화를 시작하는 것이 중요하며, 일반적으로 1주일 이내에 그려진 적혈구는 잘 작동합니다. - O+ 휴먼 세럼: 다른 개인의 혈청의 정상적인 변화의 효과를 최소화하기 위해 함께 혈청의 적어도 6 단위를 풀. 0.2 μm 여과 플라스크를 사용하여 풀이 된 인간 세럼을 살균합니다. 필요에 따라 50mL 이하의 부분에서 알리쿼트및 저장 -20°C.
참고: 적혈구와 혈청은 P. falciparum 문화에 대 한 호환 되는 혈액 형에서 될 필요가. - 500x 저산소산틴(100mL) 용액: 1M NaOH의 100mL에서 저산소산틴 0.5g을 용해한다. 필터 살균 및 저장을위한 5-10 mL 알리코를 합니다. 주식은 -20 °C에서 1 년까지 저장하고 4 ° C에서 최대 2 주까지 보관 할 수 있습니다.
- 중탄산나트륨(선택 사항): 100mL의 탈이온화, 조직 배양 등급의 물과 필터를 0.2 μm 필터로 살균하여 7.5g의 중탄산나트륨을 녹입니다.
참고: 이 프로토콜은 초들 항아리 방법을 사용하여 시험관 내 배양에서 P. falciparum에 대한 미세 에어로필 조건을 제공하고 중탄산 나트륨을 필요로하지 않습니다. 그러나, 기생충이 말라리아 가스 혼합(5% O2,5% CO2 및 90%N2)을사용하여 배양되는 경우, 0.2%의 중탄산나트륨으로 배양 매체를 보완하는 것이 중요하다. - 전체 미디어: 500mL의 완전한 미디어를 준비하려면 1mL의 저산소산틴 용액과 50mL의 풀이 있는 인간 혈청을 RPMI 1640의 500mL에 추가합니다. 말라리아 가스 혼합물을 사용하는 경우 중탄산 나트륨 7.5 %의 15 mL을 추가하십시오. 전체 미디어를 4°C로 저장하고 전체 미디어의 색상이 주황색에서 분홍색으로 변경되면 폐기하십시오. 폐기물을 방지하려면 3일 이내에 충분히 완전한 미디어를 사용할 수 있도록 합니다.
- Exflagellation 미디어 (선택 사항): 200 mg NaHCO3,5 mg Hypoxanthine 및 xanthurenic 산의 100 μL (물 100 mM 재고)에서 100 mL의 불완전한 미디어 (RPMI 1640 글루타민 및 HEPES)를 용해하여 소멸 또는 ookinete 미디어를 만듭니다.
참고 : Exflagellation은 여성 Anopheles 모기의 미드 구트 내부 의 남성 gamete 형성 과정은 게임 토 세포에 감염된 혈액 식사를 취한 후 몇 분 후. 플라스모듐의 남성 게임 토세포는 폭발 이벤트 후 8 남성 게임에 상승을 제공합니다. 시험관내에서, 이 과정은 배양 온도가 실온(RT)으로 낮아지고 배양된 성숙한 게임토사이클에서 관찰될 때 자발적으로 발생합니다. - N-Acetylglucosamine (선택 사항): 물 또는 불완전한 매체에 N-acetylglucosamine의 500 mM 재고 용액을 확인, 알리 쿼트 및 저장 -20 °C.
- NaCl 용액: 조직 배양 등급 의 100mL에 0.9g, 1.6 g 및 12 g NaCl을 용해하여 0.9%, 1.6%, NaCl 용액을 12% 만듭니다. 필터는 0.22 μm 필터로 살균하고 4 °C에 보관하십시오.
2. P. 팔시파룸 무성무대 문화
- 기생충 문화를 시작하려면, 액체 질소 탱크에서 P. falciparum NF54의 낮은 통로 냉동 유리병을 제거하고 37 °C에서 설정 된 수조에서 신속하게 해동하십시오.
- 내용물(~1mL)을 50mL 멸균 원심분리기 튜브로 옮기고, 튜브를 부드럽게 흔들면서 0.2부피를 12% NaCl로 첨가하여 튜브를 부드럽게 흔들어 믹싱을 보장합니다. 간헐적으로 부드러운 흔들림으로 RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 부드러운 믹싱을 계속하면서 1.6 % NaCl 드롭 와이즈의 9 볼륨을 추가합니다. RT에서 5 분 동안 500 x g의 내용기를 원심 분리하고 상퍼를 조심스럽게 폐기하십시오. 추가 9 볼륨의 0.9% NaCl 드롭 와이즈, 지속적으로 기생충 펠릿을 혼합 하는 동안. RT에서 5 분 동안 500 x g에서 다시 원심 분리기를 제거하고 기생충을 완전한 미디어의 5 mL로 다시 일시 중단합니다.
- 내용물 6개 잘 구성된 우물로 옮기고 100-200 μL의 포장된 RPC를 추가합니다.
- 촛불 항아리 또는 모듈형 인큐베이터 챔버에서 37°C에서 기생충 배양을 배양하여 5% O2,5% CO2 및 90%N2의특수 가스 혼합으로 제거하였다.
- 매일 미디어를 교체하고 정례적인 미디어 변화 중에 문화 상체가 흡인된 후 정착된 RBC 층에서 마이크로리터 몇 개를 그려 얇은 혈액 얼룩을 만들어 성장을 모니터링합니다.
- 멸균 유리 파스퇴 파이펫을 사용하여 유리 슬라이드 의 중앙을 탭하여 문화 방울을 슬라이드로 옮습니다. 드롭 앞에 또 다른 유리 슬라이드를 놓고 다시 RBC에 연락하여 한 모션으로 밀어 RBC 단층의 얇은 얼룩을 만듭니다.
- 슬라이드를 건조 랙에 수평으로 놓고 공기를 건조시키십시오. 얼룩에 절대 메탄올을 떨어뜨려 혈액 얼룩을 수정합니다. 고정 얼룩이 완전히 건조한 다음 혈액 얼룩이 완전히 덮일 때까지 물에 갓 희석된 10%의 Geimsa-얼룩을 조심스럽게 붓습니다. 세포가 약 15분 동안 얼룩지게 합니다.
- 깨끗한 수돗물 아래에서 슬라이드를 헹구고 슬라이드가 수직 위치에서 건조되도록하여 과도한 얼룩을 씻어 내십시오.
- 오일 침지 100x 목표를 사용하여 현미경에 얇은 혈액 얼룩을 보고 기생충증을 결정합니다. 감염된 적혈구의 수를 계산적어도 500 RBC의 총 중 % 기생충을 결정.
3. P. 팔시파룸 게임토세포 문화
참고 : Gametocyte 문화는 모기에 전염 성숙한 게임 토세포를 생산하는 데 2 주가 걸릴. 게임토세포 문화의 단계는 그림 1에설명되어 있습니다. P. falciparum 분리는 일반적으로 시험관 내 문화13에서장기 후 게임 토세포를 생성하는 능력을 잃게됩니다. 게임토세포의 품질을 보장하기 위해 해동 이후 2개월이 넘지 않은 낮은 통로 피더 문화에서 문화를 시작해야 합니다. 37°C에 미리 웜 된 매체와 38 °C에서 슬라이드 워머 세트에 모든 절차를 수행합니다. 게임토세포 문화권이 온도 변동을 최소화하기 위해 장기간 인큐베이터에서 벗어나지 않도록 하십시오.
- 0.3~1%의 기생충혈을 4%로 혼합무성 단계 피더 배양증으로 활용한 게임토세포 배양(0일)을 시드한다.
- 6개의 웰 게임토세포 문화를 설정하려면 RT에서 5분 동안 500 x g의 피더 배양 원심분리기 5mL을 설정합니다.
- 포장 된 RbC의 1.2 mL을 추가하고, 혼합하고, 6 웰 플레이트의 각 웰에 5 mL을 분배하고 37 ° C에서 촛불 항아리에 인큐베이션하십시오.
참고: 위에서 설명한 게임토세포 배양은 5%의 기생충에서 혼합무성 단계 피더 문화를 기반으로 합니다. - 매일 15-18일 동안 신선한 혈액을 첨가하지 않고, 혈액 세포를 제거하는 것을 피하기 위해 약 70-80%의 배양 상복부를 조심스럽게 흡입하여 미디어를 변경합니다.
- 각 웰에 5mL의 신선한 완성 매체를 추가합니다. 미디어를 변경하는 동안, 천천히 정착 된 RBC 층을 방해하지 않도록 우물의 벽에 세로지 학적 파이펫을 사용하여 미디어를 추가합니다.
참고: 문화매체의 1~2mL는 미디어 변경 시 남게 되기 때문에, 게임토세포 문화의 1일 이후 총 문화권은 6~7mL 사이입니다. 이 프로토콜을 조정 하는 동안, 기생충건강 있는지 확인 하기 위해 매일 혈액 얼룩을 만드는 것이 좋습니다. 혈액 얼룩을 만드는 것은 종종 배양에 있는 세포의 수를 고갈할 수 있습니다. 이를 방지하려면 매우 작은 볼륨을 그립니다. - 성숙한 게임토세포혈을 정량화하기 위해, 15-18일 사이에 혈액 얼룩을 만들고 총 세포 수 중 성숙한 게임토세포 수를 계산합니다.
참고 : 성숙한 게임 토세포는 부드러운 둥근 끝(그림 5B)과자신의 고전적인 초승달 모양으로 쉽게 식별 할 수 있습니다. - 최소 1,000개의 RPC를 계산하고 성숙한 게임토사이클에 감염된 RBC의 비율을 계산합니다.
- exflagellation 이벤트를 정량화하려면 사전 따뜻하게 된 튜브에서 RT에서 5 분 동안 500 x g에서 게임토세포 문화와 원심분리기 200 μL을 복용하십시오. 20 μL의 폐열 매체에서 펠릿을 다시 중단하고 덮개 슬립이 있는 유리 슬라이드로 옮겨 놓습니다.
- 실온에서 15분 동안 잠복한 후 10배 의 목표를 사용하여 위상 대비 모드에서 발굴 센터를 세기 시작합니다. 발굴 이벤트를 계산하기 위해 최소 4개 필드에 발굴 센터를 계산합니다.
참고 : exflagellation 분석의 상세한 방법론은 Delves 외10에의해 이전에 설명되었습니다 . 필드당 20개 이상의 exflagellation 이벤트는 멤브레인 수유 분석에 적합한 것으로 간주됩니다. - Gametocyte 문화는 일반적으로 잔류 무성 단계의 낮은 수준을 가지고있다. 실험에 순수한 게임토세포가 필요한 경우 50mM N-아세틸글루코사민으로 문화를 치료하십시오.
- 잔류 무성기 단계를 지우기 위해 미디어를 변경하면서 최소 3일 동안 웰당 10배 스톡 솔루션(5mL)에서 N-아세틸글루소사민0.5mL를 추가합니다.
참고 : N-아세틸글루소산민도 성적으로 헌신적 인 메로조이트의 침입을 차단 할 수 있습니다, 치료는 게임 토세포 문화의 7 일 후에 만 시작되어야한다.
4. 표준 멤브레인 수유 분석 (SMFA)을 사용하여 모기 감염
참고: 체외에서 자란 게임토세포는 유리 막 피더를 사용하여 모기에 공급될 수 있습니다. 혈액 공급 장치의 설정은 도 2에도시된다. 위에서 설명한 바와 같이, 모기에 의해 섭취되기 전에 활성화를 피하기 위해 항상 37 °C에서 게임 토세포를 유지합니다. 37 °C에 게임 토세포 문화와 함께 사용되는 사전 웜 플라스틱 제품, 시약 및 장비.
- 굶주리게 3-7 일 된 여성 Anopheles 모기6.5 시간 또는 멤브레인 먹이 전에 하룻밤 동안 설탕 물을 제거하 여 모기를 굶어.
- 전동 또는 입조작 된 아스피레이터를 사용하여 미세 메쉬 직물의 이중 층으로 덮인 종이 컵으로 옮기습니다. 또는 차가운 방이나 냉장고에 모기를 쓰러뜨려 종이 컵으로 옮기세요.
참고: 1파인트 크기의 컵은 최대 100마리의 모기를 먹이는 데 사용할 수 있습니다. - 원심분리기는 RT에서 5분 동안 500 x g로 혈액을 씻고 상류제를 폐기합니다. 전혈을 재구성하기 위해 갓 해동된 인간 혈청의 동일한 양을 추가합니다. 혈액과 혈청 믹스를 37°C로 30분 동안 세팅된 수조로 옮기습니다.
- 게임토세포 배양식을 37°C에서 5분 동안 600 x g에서 미리 데워진 15mL 플라스틱 튜브 및 원심분리기로 전송합니다. 신중하게 문화 상체를 흡인하고 위에서 설명한 대로 성숙한 게임 토세포증을 결정하기 위해 얇은 혈액 얼룩을 만듭니다.
- 최종 혈액 사료를 만들기 위해, 재구성 된 전혈을 사용하여 원하는 농도로 게임 토세포 펠릿을 희석. 모기와 유리 피더가 준비될 때까지 혈액 사료를 37°C로 유지하십시오.
참고: 0.02~0.3% 사이의 성숙한 게임토세포 농도는 일관된 모기 감염성을 제공합니다. 그러나 다양한 모기 컵에 다양한 농도를 공급하여 게임 토세포혈을 최적화하는 것이 좋습니다. - 유리 막 피더는 두 개의 개구부, 감염된 혈액파이펫에 좁은 상단 개구부 및 멤브레인 부착을 위한 바닥 개구부를 가지고 있는지 확인합니다. 파라핀 필름을 사각형으로 자르고 균일한 두께로 스트레칭하고 피더의 개구부에 충실하여 혈액 공급에 밀봉 된 구획을 만듭니다.
- 멤브레인 피더 주위에 재킷을 통해 따뜻한 물의 통행을 허용하기 위해 각 면에 튜브를 연결하여 순환 수조에 멤브레인 피더를 부착합니다.
참고: 여러 개의 공급 조건에 맞게 여러 유리 피더를 연재하여 연결할 수 있습니다. - 모든 피더가 수조에 연결된 후 켜서 누출을 검사합니다.
- 멤브레인 사이드 다운과 클램프 또는 테이프를 사용하여 피더를 고정하는 모기 컵에 그물의 중앙에 피더를 배치합니다. 멤브레인 피더가 컵 내부에서 모기가 접근할 수 있도록 혈액 공급과 컵에 그물을 가진 전체 피더의 근접 접촉조차 허용하기 위해 어느 쪽으로도 기울어지지 않도록 하십시오.
- 파이펫 약 200-1000 μL의 혈액 공급이 막 피더로 공급됩니다.
참고: 혈액 공급의 양은 모기의 수와 막 피더의 크기에 따라 달라집니다. 14mm 유리 피더와 50마리의 모기는 200μL의 혈액 사료를 사용합니다. - 적재가 제대로 이루어졌는지 확인하고 파라핀 필름에 혈액 사료가 겹쳐졌는지 확인하십시오.
- 간헐적 인 모니터링으로 모기가 약 30 분 동안 먹이를 줄 수 있습니다.
참고: 입으로 모기를 부드럽게 날려 서CO2를 제공하여 혈액 공급이 개선됩니다. - 차가운 방에서 모기를 쓰러뜨려 먹이지 않은 모기를 제거하십시오. 신선한 혈액 식사의 표시로 복부에 있는 부푼 및 발적을 위한 모기를 눈에 띄게 검사합니다. 또는, 선택적으로 공급되지 않은 모기를 제거하기 위해 구강 수술 흡인기를 사용합니다.
- 70%에 탄올에 담근 후, 먹이지 않은 모기를 모기컵에 다시 넣으세요.
- 이중 케이지 모기 컵과 인간 말라리아 기생충 P. falciparum에감염된 모기에 지정된 높은 봉쇄 인큐베이터로 이송합니다.
- 모기컵에 10% 자당에 담근 면 패드를 놓아 설탕 을 드실 수 있습니다. 모기가 해부될 때까지 매일 면 패드를 교체하십시오.
5. 모기 중간 창자 해부 및 난모제 부하 정량화
참고: 미드구트 해부의 회로도가 도 3에표시됩니다.
- 7-8 일 후 혈액 먹이, 모기 컵을 4 °C로 전송 10 분 모기를 노크.
- 미세 한 포셉을 사용하여 얼음에 페트리 접시에 해부 모기를 전송합니다.
- 모기를 70% 에탄올에 담그고 1-2분 간 재탄화하십시오. 모든 모기가 안락사 된 후 에탄올을 씻어 페트리 접시에 PBS를 추가합니다.
참고 : PBS를 추가하기 전에 모든 모기가 죽었는지 확인하십시오. - 중앙에 해부 현미경 및 파이펫 100 μL에 유리 슬라이드를 마운트합니다. 조심스럽게 PBS에 집게를 사용하여 하나의 모기를 전송하고 얼음에 페트리 접시에 모기의 나머지부분을 둡니다.
- 미세 한 포셉을 사용하여, 모기의 후방 끝에서 복부의 세 번째 세그먼트를 잡고 두 번째 집게와 흉부와 복부 사이의 접합을 보유. 중간구트가 완전히 드러날 때까지 복부를 부드럽게 당깁니다.
- 모기 조직의 나머지 부분을 버리고 PBS의 몇 방울을 포함하는 깨끗한 슬라이드에 미드구트를 전송합니다.
- 원하는 모기 수가 해부되면 파이펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 제거하고 2-5 분 동안 0.2 % 머쿠로크롬으로 미드구트를 얼룩지게하십시오.
- 가벼운 현미경으로 쉽게 시각화 할 수 있도록 슬라이드에 과도한 머쿠로크롬과 라인업 미드구트를 제거합니다.
- 커버 슬립을 놓고 10배 목표 하에서 각 미드구트에 스푸사이클을 계산합니다. 오키스트 얼룩 핑크와 모양의 원형(그림 6C).
6. 모기 침선 해부 및 스포로조이트 하중 정량화
참고: 타액 선 절제술의 회로도는 그림 4에표시됩니다.
- 14-18 일 후 혈액 공급, 10 분 동안 4 °C에 모기 컵을 배치합니다.
참고: 모기가 움직이지 않을 때까지 기다리는 것이 중요합니다. - 모기가 움직이지 않을 때까지 기다리는 동안 해부를 위한 도구를 준비하십시오.
- 해부 현미경 단계에 유리 판을 놓습니다. 1mL 주사기와 9인치 파스퇴 피펫및 고무 전구에 25G 바늘 2세트를 준비합니다. 70% EtOH 및 해부 매체(HBSS, L-15 또는 PBS)를 6웰 플레이트에 놓습니다.
- 차가운 방에서, 70 %의 EtOH를 포함하는 6 웰 플레이트에 마취 모기를 전송합니다. 모든 모기가 흠뻑 젖었는지 확인하기 위해 모기를 부드럽게 움직인 다음 집게를 사용하여 모기를 해부 매체로 옮기고 70% EtOH를 씻어냅니다.
- 해부실로 이동하여 해부 현미경 단계에 모기를 배치합니다.
- 모기에서 초과 배지를 제거하고 해부 중에 필요에 따라 새로운 배지를 추가하십시오. 모기가 건조되는 것을 피하면서도 너무 많은 액체로 인해 해부는 더 어려워집니다.
- 25G 바늘이 달린 주사기 2개를 사용하여 모기 흉부와 머리를 잡고 머리를 부드럽게 위로 당겨 흉부에서 타액 샘을 당깁니다.
- 바늘로 머리와 흉부에서 타액 땀샘을 분리합니다.
- 일시적으로 타액땀샘을 유리판에 있는 별도의 배지 방울에 놓습니다.
- 15-20 타액 땀샘을 해부한 후 파스퇴르 파이펫을 사용하여 낮은 보존 튜브에서 수집합니다.
참고 : 타액 땀샘이 파스퇴르 파이펫의 넓은 부분에 들어가면 유리에 달라 붙어 꺼내기가 어렵습니다. - 테이블 상단 원심분리기에서 짧은 펄스 스핀으로 펠릿 타액선. 펠릿을 방해하지 않고 해부 매체를 제거하고 새로운 해부 배지의 100 μL을 추가합니다.
- 타액땀샘을 작은 균질화제로 1분 간 갈아서 산포로요이트(sporozoites)를 얻습니다.
- 스포로자이트를 함유한 해부 배지 10μL을 혈류계에 놓습니다.
참고: 타액선 수에 따라 산포로조이트 용액을 계산하기 전에 배지로 1:10~1:50으로 희석해야 할 수 있습니다. - 네 사분면 중 2개에서 스포로조이트 수를 계산하고 스포로조이트/모기 수를 계산합니다.
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Representative Results
여기서 우리는 위의 프로토콜을 사용하여 생성된 P. falciparum NF54 게임토세포 배양체 배양체를 사용하여 일련의 멤브레인 피드의 결과를 제시한다(그림5참조). 게임토세포 문화는 0일째에 약 0.5%의 혼합단계 무성문화로 시작되었으며, 4일째와 5일째에는 약 15%의 충수 기생충증으로 성장했습니다. 이 높은 기생충에서 그림 5A에 나타난 바와 같이, 기생충은 스트레스와 무성 단계 문화 충돌. 그러나, 이 스트레스는 수반되는 게임 세포 발생의 유도결과. 6일과 7일 이후 조기 게임토세포가 나타났고, 무성 기생충은 서서히 감소했지만 낮은 수준에 머물렀다. 무성 단계 기생충의 존재는 모기 먹이 실험에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 게임토세포가 약물 감수성 및 프로테오믹 또는 전사연구와 같은 순수한 배양을 필요로 하는 실험에서 사용될 경우, 잔류 무성단계는 50mM N-아세틸글루코사민으로 치료하여 제거될 수 있다. 대부분의 게임토세포는 15일까지 V단계로 성숙하여 모기에 감염되어 먹이를 받을 준비가 되었습니다. 게임토세포 배양 개시 후 다른 시점에서 지름사 염색 혈액 얼룩의 대표적인 이미지가 도 5B에표시됩니다.
혈액 공급 후에 8에서 10 일 사이에서, 모기는 감염의 보급 그리고 강렬을 결정하기 위하여 해부되었습니다. 보급은 강렬이 각 모기에서 찾아낸 난모의 수 인 동안 난모가 있는 먹이 모기의 백분율입니다. 둘 다 피드의 성공에 대한 중요한 지표입니다. 5개의 독립적인 모기 사료로부터의 데이터는 도 6에도시된다. 사료는 P. falciparum NF54의 16 일 문화에서 0.3 %의 성숙한 게임 토세포로 공급 한 후 감염성 수준의 정상적인 변화를 보여주기 위해 선택되었습니다. 난소증은 게임토세포와 유병률의 모기 감염률을 결정하기 위해 정량적 데이터를 제공하여 감염된 먹이 모기의 비율을 보여줍니다. 이러한 데이터는 전송 차단제를 평가하고 전염 차단 백신 및 약물에 대한 표적을 식별하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 난모세포의 수는 실험 내와 사이에 다양하고 다양한 실험 조건의 효과를 결정하기 위해 코호트 당 25-50 모기가 필요했습니다.
난소성 강도는 대부분의 전송 차단 assays 및 전략의 끝점으로 간주됩니다, 그러나 스포로조이트의 수는 일반적으로 산포로조이트 생물학과 간 단계 연구를 위해 중요합니다. 표 1은 12개의 독립적인 혈액 공급에서 모기 당 얻은 평균 수 sporozoites를 보여줍니다. 표에 나타난 바와 같이, 스포로조이트의 평균 수는 일관적이었다, 그러나, 우리가 제로 스포로조이트를 얻은 하나의 실험이 있었다, 분석의 가끔 실패를 나타내는.
그림 1: P. falciparum 게임토세포 배양 및 멤브레인 공급 프로토콜의 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 모기 혈액 공급 설정. (A)유리 피더와 파라핀필름(B) 파라필름 막 부착전과후에 두 개의 유리 피더가 모기컵 위에 유리 피더를 표시하고 순환 수조와 연결한다. (D,E) 유리 피더(F) 혈액 공급의 균일분포를 보여주는 유리 피더의 바닥뷰(F) 파라필름 멤브레인을 통해 먹이를 주는 여러 모기를 배관한다. (H)모유 수유 후 모기컵의 최고 보기, 컵 의 바닥에 먹이 모기에 의해 배설 된 혈액 방울을 보여주는. 스케일 바 = 10mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 모기 미드구트 해부의 단계를 보여주는 그래픽 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 모기 침샘 해부의 단계를 보여주는 그래픽 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: P. falciparum 게임토세포 문화와 감염된 모기 미드구트에 난모성 시각화. (A)15일 게임토세포 문화의 시간 과정, 처음 4일 이내에 기생충을 피크로 하는 무성단계의 가파른 곱셈을 보여주고, 시간이 지남에 따라 게임세포 발생과 성숙이 뒤따릅니다. (B)게임세포 문화의 다양한 단계를 보여주는 건사 염색 얇은 혈액 얼룩, 1일 초 무성단계, 4일째 성무성 기생충, 6일째 는 기생충 부하, 9일과 12일 조기 게임토세포, 성숙한 남녀 게임토세포로 인한 문화가 강조된다. 형태학적으로 초기 단계 의 게임토세포는 무성 단계와 구별할 수 없었지만, 후기 단계 II는 뾰족한 끝으로 초승달 모양을 보였고 기생충이 단계 III 및 IV로 발전함에 따라 길어졌다. 성숙한 단계 V 게임토사이클은, 그러나, 둥근 끝과 최소한의 숙주 셀가시성14와고전적인 초승달 모양이 특징입니다. 스케일 바 = 10mm이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: P. falciparum 난모세포는 모기 midgut당 계산됩니다. (A)그래프는 수년에 걸쳐 난모성 수를 나타내며, 각 실험마다 모기가 0.3%의 게임토세포로 공급되었고, 8일째에는 혈류 후 사료가 해부되었다. 각 점은 개별 미드구트의 난모성 수를 나타내며 가로 선은 중앙값입니다. (B)표는 감염한 모기의 평균 난모세포 수, 보급 및 감염 범위를 나타낸다. (C)다른 배율에서 두 개의 별도 혈액 공급 실험에서 모기 미드구트에 난모를 보여주는 사진. 스케일 바 = 150 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 실험 | 해부의 날 (후 혈액 공급) | 평균 스포로조이트/모기 |
| 1 | 14 | 42, 000 |
| 2 | 14 | 40, 000 |
| 3 | 14 | 42, 750 |
| 4 | 15 | 25, 411 |
| 5 | 15 | 33, 750 |
| 6 | 14 | 15, 750 |
| 7 | 16 | 0 |
| 8 | 15 | 33, 200 |
| 9 | 14 | 56, 333 |
| 10 | 14 | 45, 333 |
| 11 | 17 | 43, 750 |
| 12 | 16 | 56, 000 |
표 1: 2년 동안 12개의 독립적인 주기동안 모기당 타액샘 스포로조이트의 평균 수. A. stephensi 모기는 0.3% P. falciparum 게임토세포와 15-20 모기가 14-17일 사이에 해부되었다. 모기 당 평균 스포로조이트 수가 표시됩니다.
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Discussion
여기에 설명된 방법은 10년 이상 존스 홉킨스 말라리아 연구소에서 10년 이상15년,16년,17년,18년,19,20,21,22이상에성공적으로 사용되어 왔다. 이 프로토콜을 사용하여 생산된 게임토세포는 높은 처리량 게임토시토시달분석서(22)에사용되어 왔으며, 프로테오믹15뿐만아니라 전사23연구에도 사용되었습니다. 그러나, 이러한 방법을 개발하는 주된 이유는 성숙한 게임토세포를 사용하여 모기 단계및스포로조이트(23,24,25,26)에대한 연구를 위해 모기를 감염시키는 것이다. 이 원고는 유리 막 피더를 사용하여 성숙한 P. falciparum 게임 토세포 및 모기의 감염을 생성하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 전송 차단 전략, sporozoite 단계 및 P. falciparum의 전 적혈구 간 단계에 일하는 모든 실험실에 대 한 중요 한.
1981년 Ifediba와 Vanderberg는 P. falciparum의장기 문화를 설명했으며, 50 μg/mL 저산소산틴이 존재하여 전염성이 높은 성숙한 게임토세포27을생산했습니다. 그 이후로 다른 응용 프로그램에 대한 게임 토세포를 생산하는 방법을설명하는 수많은 간행물이 있었다9,10,11,12. 이러한 간행물의 대부분은 이전에 설명 된 게임 세포 발생 유도 조건을 활용하여 수율을 증가시합니다. 조건부 미디어를 사용하여, 갑작스런 기생충증 증가에 의해 문화를 강조하고, 빈혈을 모방하기 위해 혈통에 있는 강하, 적혈구 용해 및 로그 상 억압을 대량으로, 게임 세포 발생을 유도하는 데 사용될 수 있다. 여기에 설명된 방법은 간단하고 테스트된 시간입니다. 0.3~1% 무성단계 기생충혈을 통해 게임토세포 문화를 개시하여 4%의 혈종염으로 매일 미디어를 변경하여 15-18일까지 미디어를 변경합니다. 일관된 결과를 얻으려면 낮은 통로 무성기 기생충으로 게임토세포 문화를 시작하고, 신선한 RBC(<1주)를 사용하고, 미디어 변화 시 배양 온도가 변동하지 않도록 하는 것이 중요합니다. falciparum 게임토세포 개발 과정은 골수4,5에서사치공간의 정적 조건에서 격리되기 때문에 문화 기간 동안 정착된 RBC 층을 방해하지 않는 것이 중요합니다.
P. falciparum 게임토세포를 일관성있게 배양하는 것은 까다롭지만 모기를 감염시키는 것은 또 다른 수준의 복잡성을 제시합니다. 멤브레인 수유는 모기의 나이 및 적합성, midgut microbiota 및 먹이 행동28,29와같은 게임토세포 이외의 여러 변수의 대상이 됩니다. 일반적으로 SMFA 데이터는 높은 수준의 가변성을 나타내며 다른 실험조건(11,28)의효과를 확인하기 위해 많은 수의 모기가 필요합니다. 게임토세포에 대한 낮은 통로 문화를 사용하여 건강한 3 - 6 일 된 모기와 최적화 된 멤브레인 공급 프로토콜은 난모 세포 수의 변화에 도움이 될 수 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 게임토세포 재배와 멤브레인 수유를 위해 수년 동안 최적화되어 왔습니다. 이러한 방법은 성숙한 전송 유능한 게임토세포, 표준 멤브레인 수유 분석, 모기 미드구트 해부 및 난소제 정량화뿐만 아니라 타액 선 해부 및 스포로조이트 정량화를 얻기위한 자세한 설명을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 신뢰할 수 있는 모기 감염및 강력한 난모세포 수와 스포로조이트 수율을 제공하는 데 필요한 게임토세포 수측면에서 일관되습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 존스 홉킨스 말라리아 연구소 (JHMRI)에 재정 지원을 블룸버그 자선 사업가에게 감사드립니다. 이 작품은 JHMRI 곤충 및 기생충학 핵심 시설에서 제공하는 전문 지식없이는 가능하지 않았을 것입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Sugar solution | |||
| 10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
| 1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
| 25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
| 37°C Incubator | |||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
| 6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
| 70% Ethanol | |||
| 9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
| Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
| cell counter | |||
| Circulating water bath | |||
| fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
| Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
| Glass desiccator | |||
| Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
| Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
| Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
| Micro Pipette | |||
| Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
| Mosquito cups | Neptune cups | ||
| N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
| Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
| Parafilm | |||
| PBS | |||
| Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
| Pipet tips | |||
| Pipetman | |||
| Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
| RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
| Slide warmer | |||
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
| water bath | |||
| Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |
References
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