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Biology

प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम कृत्रिम झिल्ली खिला के माध्यम से गेमटोसाइट संस्कृति और मच्छर संक्रमण

Published: July 3, 2020 doi: 10.3791/61426
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Johns Hopkins Malaria Research Institute, W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University

Summary

मलेरिया परजीवी के मच्छर चरणों पर विस्तृत जांच प्रभावी संचरण अवरुद्ध रणनीतियों को डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि संक्रामक गेमटोसाइट्स को प्रभावी ढंग से कैसे संस्कृति में लाने के लिए और फिर इन गेमोसाइट्स को मच्छरों को खिलाने के लिए पी फाल्सीपेरमके मच्छर चरण उत्पन्न करते हैं।

Abstract

मलेरिया सबसे महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्याओं में से एक बना हुआ है, जिससे महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु दर होती है । मलेरिया एक मच्छर जनित रोग है जो मादा एनोफेल्स मच्छर से संक्रामक काटने के माध्यम से फैलता है। मलेरिया नियंत्रण अंततः दृष्टिकोण की एक भीड़ पर निर्भर करेगा, जिसमें मच्छरों के माध्यम से और से संचरण को अवरुद्ध करने के तरीके शामिल हैं । प्रयोगशाला में मलेरिया परजीवी के मच्छर चरणों का अध्ययन करने के लिए, हमने अत्यधिक संक्रामक प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम गेमटोसाइट्स को संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलित किया है, जो मानव मेजबान से मच्छर वेक्टर तक संचरण के लिए आवश्यक परजीवी चरण है। पी फाल्सीपेरम गेमटोसाइट्स पांच रूपात्मक रूप से अलग-अलग चरणों के माध्यम से परिपक्व होते हैं, जिसमें लगभग 1-2 सप्ताह लगते हैं। इस प्रोटोकॉल में वर्णित गेमटोसाइट संस्कृति 15 दिनों में पूरी हो जाती है और 15-18 दिनों से मच्छरों के लिए संक्रामक होती है। इन प्रोटोकॉल को संक्रमण सक्षम गेमटोसाइट्स के निरंतर चक्र को बनाए रखने और परजीवी के मच्छर चरणों की निर्बाध आपूर्ति बनाए रखने के लिए विकसित किया गया था। यहां, हम गेमटोसाइट संस्कृति की पद्धति का वर्णन करते हैं और कांच झिल्ली फीडर का उपयोग करके इन परजीवीओं के साथ मच्छरों को कैसे संक्रमित करते हैं।

Introduction

मलेरिया प्लाज्मोडियम परजीवी के कारण होता है और मादा एनोफेल्स मच्छरों के संक्रामक काटने के माध्यम से उनके कशेरुकी मेजबानों में फैलता है। 2019 विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) की रिपोर्ट के अनुसार, मलेरिया1के कुल 228 मिलियन मामलों में से अनुमानित 405,000 मौतें हुईं। मलेरिया से संबंधित अधिकांश मौतें अफ्रीकी क्षेत्र में केंद्रित थीं, खासकर पांच साल से कम उम्र के बच्चों के बीच । जबकि मलेरिया की समग्र घटना दर २०१० से विश्व स्तर पर गिरावट आई है, हाल के वर्षों में गिरावट स्थिर है और अतिरिक्त नियंत्रण रणनीतियों की तत्काल जरूरत है रोग को खत्म करने के लिए ।

मलेरिया परजीवी के चक्रीय अलैंगिक रक्त चरणों के कारण रोग रोगजनकता होती है और इनमें से एक छोटा सा सबसेट महिला और पुरुष गेमोसाइट्स में होता है। प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम गेमोसाइट्स प्रकृति में अद्वितीय हैं क्योंकि उन्हें पांच रूपात्मक रूप से अलग चरणों के माध्यम से विकसित होने में 7-10 दिन लगते हैं। चरण - 1 से 4 तक अपरिपक्व खेल बोन मैरो परेंचिमा में तनहा होते हैं और परिधीय परिसंचरण 2 ,3,4,5से काफी हद तक अनुपस्थित रहते हैं । परिपक्व चरण वी गेमटोसाइट्स से संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स खून में जारी किए जाते हैं और मच्छरों द्वारा स्वतंत्र रूप से प्रसारित होते हैं। एक बार मच्छर मिडगुट के अंदर, गेमटोसाइट्स को सक्रिय किया जाता है, तापमान में परिवर्तन और मिडगुट पर्यावरण के संपर्क में आने के माध्यम से, मादा और पुरुष गेमेट में बदलना और मच्छर चरणों का विकास शुरू करना, जो मच्छर लार ग्रंथियों6,7में स्पोरोजोइट्स के संक्रमित चरणों के साथ खत्म होता है।

चूंकि ट्रैगर और जेनसन8 ने संस्कृति पी फाल्सीपेरमके लिए एक मानकीकृत विधि का वर्णन किया है, इसलिए अलैंगिक रक्त चरणों पर अध्ययन बहुत उन्नत हो गए हैं। हालांकि, यौन चरणों के लिए एक विश्वसनीय संस्कृति प्रणाली की कमी ने पी फाल्सीपेरम गेमटोसाइट्स, ट्रांसमिशन बायोलॉजी और मच्छर चरणों का अध्ययन करना मुश्किल बना दिया है। हाल के वर्षों में, कई तरीके प्रकाशित किए गए हैं जिन्होंने गेमटोसाइट संस्कृतियों9,10, 11,12की स्थापना में प्रयोगशालाओं की सहायता की है। यह पांडुलिपि संस्कृति के लिए मानकीकृत और विश्वसनीय प्रोटोकॉल का वर्णन करती है पी फाल्सीपेरम गेमोसाइट्स जो मलेरिया अनुसंधान समुदाय के लिए एक मूल्यवान संसाधन का प्रतिनिधित्व कर सकती है। यह विधि परिपक्व और संक्रामक गेमटोसाइट्स के मजबूत उत्पादन को सक्षम बनाती है जो एक मानकीकृत मच्छर खिलाने प्रोटोकॉल के साथ, अत्यधिक विश्वसनीय मच्छर संक्रमित होती है। इन तरीकों को गेमटोसाइट्स और मच्छर चरण परजीवी की निर्बाध आपूर्ति बनाए रखने के लिए स्थापित किया गया था। इस पांडुलिपि में, हम एक पूरी तरह से गेमटोसाइट कल्चर प्रोटोकॉल(चित्रा 1),ग्लास झिल्ली फीडर की तैयारी और इन झिल्ली फीडरों(चित्रा 2)का विच्छेदन , मिडगुट(चित्र 3)का विच्छेदन और मच्छरों की लार ग्रंथि(चित्रा 4)का वर्णन करते हैं, और मिडगिट और लार ग्रंथि विच्छेदन के बाद मच्छरों में संक्रमण की मात्रा का वर्णन करते हैं।

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Protocol

जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा नीचे वर्णित रक्त संग्रह को मंजूरी दी गई है । पी फाल्सीपेरम को बायोसेफ्टी स्तर 2 (बीएसएल 2) सुविधा में बाँझ परिस्थितियों में ताजा आरबीसी में सुसंस्कृत किया जाता है और जैविक सामग्रियों को संभालने के लिए सावधानी का उपयोग किया जाता है। रक्त या रक्त उत्पादों से जुड़े प्रत्येक चरण के बाद, उचित निपटान से पहले हुड के भीतर 10% ब्लीच के साथ हर प्लास्टिकवेयर या ग्लासवेयर को धोया जाता है।

1. रिएजेंट्स और तैयारी

  1. परजीवी पी फाल्सीपेरम एनएफ 54 (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग किया गया था, जो निरंतर संस्कृति में दो महीने तक संक्रामक गेमटोसाइट्स का उत्पादन कर सकता है।
    नोट: सभी संस्कृति अनुकूलित परजीवी लाइनें गेमटोसाइट्स का उत्पादन नहीं करती हैं, और कम मार्ग एनएफ 54 आइसोलेट्स सबसे सुसंगत हैं।
  2. O+ Erythrocytes: 0 पर सेट deacceleration के साथ एक स्विंग आउट रोटर में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर RPMI 1640 मीडिया और अपकेंद्रित्र की बराबर मात्रा जोड़कर पूरे रक्त को पतला करें। सुपरनेटेंट और बफी कोट (प्लाज्मा और पैक एरिथ्रोसाइट्स के बीच एक सफेद बैंड, जिसमें अधिकांश सफेद रक्त कोशिकाएं और प्लेटलेट्स होते हैं) को ध्यान से हटा दें और आरपीएमआई की बराबर मात्रा जोड़ें। धोने के चरण को दो बार दोहराएं और अंतिम धोने के बाद आरपीएमआई की एक गोली मात्रा जोड़ें ताकि 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए 50% हेमेटोक्रिट प्राप्त किया जा सके।
    नोट: Gametocytes दो सप्ताह की अवधि में परिपक्व जो यह महत्वपूर्ण ताजा erythrocytes के साथ संस्कृतियों शुरू करने के लिए बनाता है, आम तौर पर एक सप्ताह के भीतर तैयार erythrocytes अच्छी तरह से काम करता है ।
  3. O+ मानव सीरम: विभिन्न व्यक्तियों से सीरम में सामान्य भिन्नता के प्रभाव को कम करने के लिए सीरम की कम से कम 6 इकाइयों को एक साथ पूल करें। 0.2 माइक्रोनल्ट्रेशन फ्लास्क का उपयोग करके मानव सीरम को स्टरलाइज करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर आवश्यकता और स्टोर के आधार पर 50 एमएल या उससे कम के भागों में अलीकोट।
    नोट: एरिथ्रोसाइट्स और सीरम को पी फाल्सीपेरम संस्कृतियों के लिए एक संगत रक्त प्रकार से होना चाहिए।
  4. 500x हाइपोक्सेंथिन (100 एमएल) समाधान: 1 एम नाओएच के 100 एमएल में 0.5 ग्राम हाइपोक्सैंथिन को भंग करें। स्टोरेज के लिए 5-10 एमएल एलिकोट्स को फिल्टर करें और बनाएं। स्टॉक को एक साल तक -20 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. सोडियम बाइकार्बोनेट (वैकल्पिक): डियॉनाइज्ड, टिश्यू कल्चर ग्रेड वॉटर और फिल्टर 0.2 माइक्रोन फिल्टर के साथ स्टरलाइज के 100 एमएल में 7.5 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट घोलें।
    नोट: यह प्रोटोकॉल वाय्रो संस्कृति में पी फाल्सीपेरम के लिए माइक्रोएयरोफिलिक स्थितियां प्रदान करने के लिए मोमबत्ती जार विधि का उपयोग करता है और सोडियम बाइकार्बोनेट की आवश्यकता नहीं होती है। हालांकि, यदि परजीवी मलेरिया गैस मिश्रण (5% O2, 5%सीओ 2 और 90%एन2) का उपयोग करके सुसंस्कृत हैं, तो 0.2% सोडियम बाइकार्बोनेट के साथ संस्कृति मीडिया को पूरक करना महत्वपूर्ण है।
  6. पूर्ण मीडिया: पूर्ण मीडिया के 500 एमएल तैयार करने के लिए, 1 मिलियन हाइपोक्सेंथिन समाधान का 1 मिलियन और पूल किए गए मानव सीरम के 500 एमएल को आरपीएमआई 1640 में जोड़ें। मलेरिया गैस मिश्रण का उपयोग करते हुए 7.5% सोडियम बाइकार्बोनेट के 15 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरा मीडिया स्टोर करें और अगर पूर्ण मीडिया का रंग नारंगी से गुलाबी में बदलता है तो त्यागें। कचरे से बचने के लिए, पर्याप्त पूरा मीडिया बनाने के लिए तीन दिनों के भीतर इस्तेमाल किया जाएगा ।
  7. एक्स्लैगेलेशन मीडिया (वैकल्पिक): 200 मिलीग्राम नाएचसीओ3,5 मिलीग्राम हाइपोक्सेंथिन और 100 माइक्रोन एक्सनथुरिक एसिड (पानी में 100 mM स्टॉक से) को भंग करके एक्स्लैगेलेशन या ookinete मीडिया बनाएं अधूरा मीडिया के 100 मिलियन एलएल (ग्लूटामाइन और एचईपी के साथ आरपीएमआई 1640)।
    नोट: एक्स्लैगेलेशन मादा एनोफेल्स मच्छर के मिडगुट के अंदर पुरुष गेम्टे गठन की प्रक्रिया है, कुछ मिनट बाद यह गेमटोसाइट्स से संक्रमित रक्त भोजन लेता है। प्लाज्मोडियम के पुरुष गेमटोसाइट्स एक एक्स्लैगेलेशन घटना के बाद 8 पुरुष गेमेट्स को जन्म देते हैं। इन विट्रो में, यह प्रक्रिया अनायास होती है जब संस्कृति का तापमान कमरे के तापमान (आरटी) में कम हो जाता है और सुसंस्कृत परिपक्व गेमटोसाइट्स में देखा जा सकता है।
  8. एन-एसिटिलग्लूकोसामाइन (वैकल्पिक): पानी या अपूर्ण मीडिया, एलिकोट और स्टोर में एन-एसिटिलग्लूकोसामाइन का 500 mm स्टॉक समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर बनाएं।
  9. एनएसीएल समाधान: 0.9%, 1.6% और 12% एनएसीएल समाधान बनाने के लिए ऊतक संस्कृति ग्रेड के 100 मिलील में 0.9 ग्राम, 1.6 ग्राम और 12 ग्राम एनएसीएल को भंग करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. पी फाल्सीपेरम अलैंगिक चरण संस्कृति

  1. परजीवी संस्कृति शुरू करने के लिए, तरल नाइट्रोजन टैंक से पी फाल्सीपेरम एनएफ 54 की कम मार्ग जमे हुए शीशी को हटा दें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी स्नान में जल्दी से गल जाएं।
  2. सामग्री (~ 1 एमएल) को 50 एमएल बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और ड्रॉपवाइज 12% एनएसीएल की 0.2 मात्रा जोड़ें, जबकि धीरे-धीरे मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब को हिलाते हैं। रुक-रुक कर कोमल मिलाते हुए के साथ आर टी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  3. कोमल मिश्रण जारी रखते हुए, 1.6% एनएसीएल ड्रॉपवाइज के 9 वॉल्यूम जोड़ें। आरटी में 5 मिनट के लिए 500 x g पर सामग्री को सेंट्रलाइज करें, ध्यान से सुपरनेट को त्यागें। परजीवी गोली को लगातार मिलाना सुनिश्चित करते हुए 0.9% एनएसीएल ड्रॉपवाइज के 9 वॉल्यूम जोड़ें। आर टी में 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर फिर से सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट और रिसिपेंड परजीवी को पूर्ण मीडिया के 5 एमएल में हटा दें।
  4. सामग्री को 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें और पैक किए गए आरबीसी के 100-200 माइक्रोन जोड़ें।
  5. मोमबत्ती के जार में 37 डिग्री सेल्सियस पर या मॉड्यूलर इनक्यूबेटर कक्ष में 5% O2, 5%सीओ 2 और 90% एन2 के विशेष गैस मिश्रण के साथ शुद्ध परजीवी संस्कृति।
  6. हर दिन मीडिया की जगह और नियमित रूप से मीडिया परिवर्तन के दौरान संस्कृति supernatant किया गया है के बाद बसे आरबीसी परत से कुछ microliters ड्राइंग द्वारा एक पतली रक्त धब्बा बनाकर विकास की निगरानी ।
  7. स्लाइड में संस्कृति की एक बूंद स्थानांतरित करने के लिए ग्लास स्लाइड के केंद्र में स्लाइड करने और फिर टैप करने के लिए बाँझ ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। ड्रॉप के सामने एक और ग्लास स्लाइड रखें और आरबीसी से संपर्क करने के लिए इसे वापस आकर्षित करें, आरबीसी मोनोलेयर के पतले धब्बा बनाने के लिए इसे एक प्रस्ताव में आगे बढ़ा रहे हैं।
  8. स्लाइड को एक सुखाने वाले रैक पर क्षैतिज रूप से रखें और इसे सूखने दें। धब्बा पर पूर्ण मेथनॉल छोड़ने के द्वारा रक्त धब्बा ठीक करें। निश्चित धब्बा को पूरी तरह से सूखने दें और फिर ध्यान से पानी में 10% गेमा-दाग हौसले से पतला डालें, जब तक कि रक्त धब्बा पूरी तरह से ढका न हो जाए। कोशिकाओं को लगभग 15 मिनट के लिए दाग की अनुमति दें।
  9. साफ नल के पानी के नीचे स्लाइड को धोकर अतिरिक्त दाग को धोएं और स्लाइड को ऊर्ध्वाधर स्थिति में सूखने दें।
  10. तेल विसर्जन 100x उद्देश्य का उपयोग करके माइक्रोस्कोप पर पतले रक्त धब्बा को देखकर परजीवी का निर्धारण करें। प्रतिशत परजीवी का निर्धारण करने के लिए कुल कम से कम 500 आरबीसी के बीच संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स की संख्या की गणना करें।

3. P. फाल्सीपेरम गेमटोसाइट संस्कृति

नोट: गेमटोसाइट संस्कृतियों को मच्छरों के लिए परिपक्व गेमटोसाइट्स संक्रामक का उत्पादन करने में दो सप्ताह का समय मिलता है। गेमटोसाइट संस्कृति के चरणों को चित्र 1में रेखांकित किया गया है । पी फाल्सीपेरम आमतौर पर विट्रो संस्कृति13में लंबी अवधि के बाद गेमटोसाइट का उत्पादन करने की क्षमता खो देता है। गेमटोसाइट्स की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, संस्कृति को कम मार्ग फीडर संस्कृति से शुरू किया जाना चाहिए, न कि 2 महीने से अधिक पुराना है। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म मीडिया और 38 डिग्री सेल्सियस पर एक स्लाइड गर्म सेट पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन करते हैं। सुनिश्चित करें कि तापमान में उतार-चढ़ाव को कम करने के लिए विस्तारित अवधि के लिए गेमटोसाइट संस्कृतियां इनक्यूबेटर से बाहर नहीं हैं।

  1. 4% हेमेटोक्रिट पर 0.3-1% परजीवी पर मिश्रित अलैंगिक चरण फीडर संस्कृति का उपयोग करके गेमटोसाइट संस्कृति (दिन 0) बीज।
  2. एक छह अच्छी तरह से gametocyte संस्कृति स्थापित करने के लिए, सेंट्रलाइज 5 मीटर फीडर संस्कृति के 500 x g पर आरटी में 5 मिनट के लिए । सुपरनॉट को त्यागें और पूर्ण मीडिया के 30 एमएल में गोली को फिर से खर्च करें ।
  3. पैक किए गए आरबीसी के 1.2 मिलील जोड़ें, मिश्रण करें, और 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में 5 एमएल वितरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर मोमबत्ती जार में इनक्यूबेट करें।
    नोट: ऊपर वर्णित गेमटोसाइट संस्कृति 5% परजीवी पर मिश्रित अलैंगिक चरण फीडर संस्कृति पर आधारित है।
  4. रक्त कोशिकाओं को हटाने से बचने के लिए लगभग 70-80% संस्कृति सुपरनाटेंट को ध्यान से एस्पिरेशन करके, ताजा रक्त के अलावा के बिना, 15-18 दिनों के लिए दैनिक मीडिया बदलें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा पूर्ण मीडिया के 5 एमएल जोड़ें। मीडिया बदलते समय, धीरे-धीरे मीडिया को कुएं की दीवार के खिलाफ एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके जोड़ता है ताकि बसे आरबीसी परत को परेशान करने से बचा जा सके।
    नोट: क्योंकि संस्कृति माध्यम के 1-2 mL मीडिया परिवर्तन के दौरान छोड़ दिया जाएगा, संस्कृति की कुल मात्रा 6-7 मिलील के बीच होगा, gametocyte संस्कृति के दिन 1 के बाद । इस प्रोटोकॉल को अनुकूल बनाते समय, यह सुनिश्चित करने के लिए हर वैकल्पिक दिन रक्त स्मीयर बनाने की सलाह दी जाती है कि परजीवी स्वस्थ हैं। रक्त धब्बा बनाने से अक्सर संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या कम हो सकती है। इससे बचने के लिए, बहुत कम मात्रा में आकर्षित करें।
  6. परिपक्व गेमटोसाइटिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 15-18 दिनों के बीच रक्त धब्बा बनाएं और कोशिकाओं की कुल संख्या के बीच परिपक्व गेमटोसाइट्स की संख्या गिनें।
    नोट: परिपक्व गेमटोसाइट्स को आसानी से चिकनी गोल सिरों(चित्रा 5B)के साथ उनके क्लासिक वर्धमान आकार के साथ पहचाना जा सकता है।
  7. कम से कम 1,000 आरबीसी की गणना करें और परिपक्व गेमटोसाइट्स से संक्रमित आरबीसी के प्रतिशत की गणना करें।
  8. एक्स्लैग की घटनाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पूर्व-गर्म ट्यूब में आरटी में 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर गेमटोसाइट संस्कृति और अपकेंद्रित्र के 200 माइक्रोन लें। एक्स्लैगेलेशन मीडिया के 20 माइक्रोन में गोली को फिर से खर्च करें और कवर स्लिप के साथ ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें।
  9. कमरे के तापमान पर 15 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, 10x उद्देश्य का उपयोग कर चरण विपरीत मोड में एक्सफ्लैगेशन केंद्रों की गिनती शुरू करें। एक्सफ्लैगेशन की घटनाओं की गणना करने के लिए कम से कम चार क्षेत्रों में एक्स्लैगेलेशन केंद्रों की गणना करें।
    नोट: एक्सफ्लैगेशन परख की एक विस्तृत पद्धति पहले विशद जानकारी एट अल10द्वारा वर्णित किया गया है । प्रति क्षेत्र 20 से अधिक एक्स्लैगेशन घटनाओं को झिल्ली खिलाने की परख के लिए उपयुक्त माना जाता है।
  10. गेमटोसाइट संस्कृतियों में आमतौर पर अवशिष्ट अलैंगिक चरणों का स्तर कम होता है। यदि प्रयोग के लिए शुद्ध गेमटोसाइट्स की आवश्यकता होती है, तो संस्कृति का इलाज 50 mM N-acetylglucosamine के साथ करें।
  11. अवशिष्ट अलैंगिक चरणों को साफ करने के लिए मीडिया को बदलते हुए न्यूनतम 3 दिनों के लिए 10x स्टॉक समाधान प्रति अच्छी तरह (5 एमएल) से एन-एसिटिलग्लूकोसामाइन का 0.5 एमएल जोड़ें।
    नोट: एन-एसिटिलग्लूकोसामाइन यौन रूप से प्रतिबद्ध मेरोजोइट्स के आक्रमण को भी अवरुद्ध कर सकता है, गेमटोसाइट संस्कृति के दिन 7 के बाद ही उपचार शुरू किया जाना चाहिए।

4. मानक झिल्ली खिला परख (SMFA) का उपयोग कर मच्छर संक्रमण

नोट: विट्रो में उगाए जाने वाले गेमटोसाइट्स को ग्लास झिल्ली फीडर का उपयोग करके मच्छरों को खिलाया जा सकता है। रक्त आहार तंत्र की स्थापना चित्र 2में दिखाई गई है । जैसा कि ऊपर वर्णित है, मच्छरों द्वारा निगलने से पहले सक्रियण से बचने के लिए हमेशा 37 डिग्री सेल्सियस पर गेमटोसाइट्स बनाए रखें। प्रीवार्म प्लास्टिकवेयर, रिएजेंट्स और उपकरण का उपयोग गेमटोसाइट संस्कृति के साथ 37 डिग्री सेल्सियस तक किया जाता है।

  1. झिल्ली खिलाने से पहले 6.5 घंटे या रात भर के लिए अपने चीनी पानी को हटाकर 3-7 दिन पुरानी मादा एनोफेल्स मच्छरों को भूखा रखें।
  2. उन्हें मोटरचालित या मुंह संचालित एस्पिरेटर का उपयोग करके ठीक जाल कपड़े की दोहरी परत से ढके पेपर कप में स्थानांतरित करें। वैकल्पिक रूप से, मच्छरों को ठंडे कमरे या रेफ्रिजरेटर में गिराएं ताकि उन्हें पेपर कप में स्थानांतरित किया जा सके।
    नोट: एक पिंट आकार कप १०० मच्छरों को खिलाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. सेंट्रलाइज ने आरटी में 5 मिनट के लिए 500 x g पर खून धोया और सुपरनेट को त्याग दिया। पूरे रक्त के पुनर्गठन के लिए हौसले से गल मानव सीरम की एक समान मात्रा जोड़ें। रक्त और सीरम मिश्रण को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी स्नान में स्थानांतरित करें।
  4. गेमटोसाइट कल्चर को प्री-गर्म 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब और सेंट्रलाइज को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 600 x g पर ट्रांसफर करें। संस्कृति सुपरनेट को ध्यान से एस्पिएरेट करें और ऊपर वर्णित परिपक्व गेमटोसाइटेमिया को निर्धारित करने के लिए पतले रक्त धब्बा बनाएं।
  5. अंतिम रक्त फ़ीड बनाने के लिए, पूरे रक्त के पुनर्गठित का उपयोग करके वांछित एकाग्रता के लिए गेमटोसाइट पेलेट को पतला करें। मच्छर और कांच के फीडर तैयार होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर रक्त आहार रखें।
    नोट: 0.02 से 0.3% के बीच परिपक्व गेमटोसाइट सांद्रता लगातार मच्छर ों को संक्रमित करेगी। हालांकि, मच्छरों के विभिन्न कप के लिए विभिन्न सांद्रता खिलाकर गेमटोसाइटिया का अनुकूलन करने की सलाह दी जाती है।
  6. सुनिश्चित करें कि कांच झिल्ली फीडर में दो उद्घाटन हैं, संक्रमित रक्त को पिपेट करने के लिए एक संकीर्ण शीर्ष उद्घाटन और झिल्ली लगाव के लिए एक नीचे खोलने। एक पैराफिन फिल्म को वर्गों में काटें, एक भी मोटाई तक फैलाएं और रक्त फ़ीड के लिए सीलबंद डिब्बे बनाने के लिए फीडर के उद्घाटन पर रहें।
  7. झिल्ली फीडर के आसपास जैकेट के माध्यम से गर्म पानी के पारित होने के लिए अनुमति देने के लिए प्रत्येक तरफ टयूबिंग को जोड़कर एक संचार पानी-स्नान के लिए झिल्ली फीडर संलग्न करें।
    नोट: कई ग्लास फीडरों को कई फीडिंग स्थितियों के लिए समायोजित करने के लिए श्रृंखला में जोड़ा जा सकता है।
  8. सभी फीडरों को पानी के स्नान से जोड़ने के बाद, इसे चालू करें और किसी भी लीक के लिए निरीक्षण करें।
  9. क्लैंप या टेप का उपयोग करके झिल्ली-साइड डाउन और सुरक्षित फीडरों के साथ मच्छर कप पर जाल के केंद्र में फीडर रखें। सुनिश्चित करें कि झिल्ली फीडर किसी भी तरफ झुका नहीं हैं ताकि कप पर जाल के साथ रक्त फ़ीड के वितरण और पूरे फीडर के निकट संपर्क की अनुमति दी जा सके, ताकि मच्छरों को कप के अंदर से पहुंच की अनुमति दी जा सके।
  10. पिपेट लगभग 200-1000 माइक्रोन झिल्ली फीडरों में रक्त फ़ीड करता है।
    नोट: रक्त फ़ीड की मात्रा मच्छरों की संख्या और झिल्ली फीडर के आकार के आधार पर भिन्न होगी। 14 एमएम ग्लास फीडर के लिए और 50 मच्छर 200 माइक्रोन ब्लड फीड का इस्तेमाल करते हैं।
  11. सुनिश्चित करें कि लोडिंग ठीक से किया गया था और रक्त फ़ीड पैराफिन फिल्म पर मढ़ा गया था।
  12. मच्छरों को रुक-रुक कर निगरानी के साथ लगभग 30 मिनट तक खिलाने की अनुमति दें।
    नोट: धीरे से मुंह के साथ मच्छरों को उड़ाने के लिए सीओ2 जो बेहतर रक्त खिला प्रेरित करेगा प्रदान करते हैं ।
  13. बिनाफेड मच्छरों को ठंडे कमरे में गिराकर निकालें। ताजा रक्त भोजन के संकेत के रूप में पेट में उभार और लालिमा के लिए मच्छरों का निरीक्षण करें। वैकल्पिक रूप से, बिनाफेड मच्छरों को चुनिंदा रूप से हटाने के लिए मुंह संचालित एस्पिरेटर का उपयोग करें।
  14. बिनाफेड मच्छरों को त्यागें, उन्हें 70% इथेनॉल में भिगोने के बाद और मच्छरों को वापस मच्छर कप में डाल दें।
  15. डबल पिंजरे मच्छर कप और उन्हें उच्च रोकथाम इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करने के लिए मानव मलेरिया परजीवी पी फाल्सीपेरमसे संक्रमित मच्छरों के लिए निर्दिष्ट ।
  16. उन्हें चीनी भोजन प्रदान करने के लिए मच्छर कप पर 10% सुक्रोज में भिगोए गए सूती पैड रखें। हर दूसरे दिन कपास पैड को बदलें, जब तक मच्छरों को विच्छेदित नहीं किया जाता है।

5. मच्छर मध्य आंत विच्छेदन और oocyst लोड मात्राकरण

नोट: मिडगुट विच्छेदन का एक योजनाबद्ध चित्रा 3में दिखाया गया है ।

  1. 7-8 दिन बाद रक्त आहार, मच्छरों को नीचे गिराने के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक मच्छर कप स्थानांतरित करें।
  2. ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग कर बर्फ पर एक पेट्री डिश के लिए विच्छेदन करने के लिए मच्छरों को स्थानांतरित करें ।
  3. मच्छरों को 1-2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में भिगोकर उन्हें इच्छामृत्यु दें। सभी मच्छरों के इच्छामृत्यु के बाद इथेनॉल को धोने के लिए पेट्री डिश में पीबीएस जोड़ें।
    नोट: PBS जोड़ने से पहले सुनिश्चित करें कि सभी मच्छरों मर चुके हैं ।
  4. केंद्र में पीबीएस के माइक्रोस्कोप और पिपेट 100 माइक्रोन को विच्छेदन करने पर एक ग्लास स्लाइड माउंट करें। ध्यान से पीबीएस में संदंश का उपयोग कर एक मच्छर स्थानांतरित करें और बर्फ पर पेट्री डिश में मच्छरों के बाकी छोड़ दें।
  5. ठीक-इत्तला वाले संदंश का उपयोग करके, मच्छर के पीछे के छोर से पेट के तीसरे खंड को पकड़ें और दूसरे संदंश के साथ छाती और पेट के बीच जंक्शन पकड़ें। धीरे-धीरे पेट को तब तक खींचें जब तक कि मिडगुट पूरी तरह से उजागर न हो जाए।
  6. मच्छर के ऊतकों के बाकी त्यागें और पीबीएस की कुछ बूंदों वाले एक साफ स्लाइड में मिडगुट स्थानांतरित करें।
  7. जब मच्छरों की वांछित संख्या का विच्छेदन किया गया है, तो ध्यान से पीबीएस को एक पिपेट का उपयोग करके हटा दें और 2-5 मिनट के लिए 0.2% मर्क्रोक्रोम के साथ मिडगुट को दाग दें।
  8. स्लाइड पर अतिरिक्त मर्क्रोक्रोम और लाइन-अप मिडगिट निकालें ताकि उन्हें प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे आसानी से कल्पना की जा सके।
  9. एक कवर स्लिप रखें और 10x उद्देश्य के तहत प्रत्येक मिडगुट पर ओसास्ट गिनती करें। Oocysts दाग गुलाबी और आकार में परिपत्र(चित्रा 6C)हैं ।

6. मच्छर लार ग्रंथि विच्छेदन और स्पोरोजोइट लोड क्वांटिफिकेशन

नोट: लार ग्रंथि विच्छेदन का एक योजनाबद्ध चित्रा 4में दिखाया गया है ।

  1. 14-18 दिन बाद रक्त आहार, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मच्छर कप रखें।
    नोट: मच्छरों के हिलने-जाने से रोकने तक इंतजार करना महत्वपूर्ण है।
  2. मच्छरों के हिलने से रोकने की प्रतीक्षा करते समय, विच्छेदन के लिए उपकरण तैयार करें।
  3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप चरण पर एक गिलास प्लेट रखें। 1 मिली सीरिंज पर 25 जी सुइयों के 2 सेट और एक 9 "पाश्चर पिपेट और रबर बल्ब तैयार करें। 6 अच्छी प्लेट में 70% एटोह और विच्छेदन माध्यम (एचबीबीएस, एल-15 या पीबीएस) रखें।
  4. कोल्ड रूम में, 70% एटोह युक्त 6 अच्छी प्लेट में एनेस्थेटाइज्ड मच्छरों को स्थानांतरित करें। मच्छरों को धीरे-धीरे संदंश के साथ ले जाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी मच्छरों को भिगोया जाए, फिर मच्छरों को 70% एटोह को धोने के लिए संदंश का उपयोग करके विच्छेदन माध्यम में स्थानांतरित करें।
  5. विच्छेदन कक्ष में ले जाएं और मच्छरों को विच्छेदन माइक्रोस्कोप चरण पर रखें।
  6. मच्छरों से अतिरिक्त माध्यम निकालें, विच्छेदन के दौरान आवश्यक के रूप में नए माध्यम जोड़ें। मच्छरों को सूखने से बचें फिर भी बहुत अधिक तरल विच्छेदन को और अधिक कठिन बनाता है।
  7. 25 जी सुइयों के साथ 2 सीरिंज का उपयोग करना, मच्छर छाती और सिर पकड़ो, और धीरे से छाती से लार ग्रंथियों खींचने के लिए सिर को ऊपर की ओर खींचो ।
  8. सिर और छाती से लार ग्रंथियों को सुई से डिस्कनेक्ट करें।
  9. कांच की प्लेट पर मध्यम की एक अलग बूंद में लार ग्रंथियों अस्थायी जगह है।
  10. 15-20 लार ग्रंथियों को विच्छेदन करने के बाद, उन्हें पाश्चुर पिपेट का उपयोग करके कम प्रतिधारण ट्यूब में इकट्ठा करें।
    नोट: एक बार लार ग्रंथियों पाश्चर पिपेट के व्यापक भाग में प्रवेश, वे गिलास से चिपके रहेंगे और उन्हें बाहर निकलना मुश्किल है।
  11. टेबल-टॉप अपकेंद्रित्र में शॉर्ट पल्स स्पिन द्वारा पैलेट लार ग्रंथियां। पैलेट को बाधित किए बिना विच्छेदन माध्यम को हटा दें और नए विच्छेदन माध्यम के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  12. स्पोरोजोइट प्राप्त करने के लिए 1 मिनट के लिए एक छोटे समरूप के साथ लार ग्रंथियों को पीसें।
  13. हेमोसाइटोमीटर पर स्पाइरोजोइट युक्त विच्छेदन माध्यम के 10 माइक्रोन रखें।
    नोट: लार ग्रंथियों की संख्या के आधार पर, किसी को गिनती से पहले माध्यम के साथ 1:10 से 1:50 तक स्पोरोजोइट समाधान को पतला करने की आवश्यकता हो सकती है।
  14. चार क्वाड्रंट्स में से दो में स्पोरोजोइट्स की संख्या गिनें और स्पोरोजोइट्स/मच्छर की संख्या की गणना करें:

Equation 1

Equation 2

Equation 3

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Representative Results

यहां हम ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न पी फाल्सीपेरम एनएफ 54 गेमटोसाइट संस्कृतियों का उपयोग करके झिल्ली फ़ीड की एक श्रृंखला से परिणाम प्रस्तुत करते हैं (देखें(चित्र 5)। गेमटोसाइट संस्कृति को 0 दिन पर लगभग 0.5% मिश्रित चरण अलैंगिक संस्कृति के साथ शुरू किया गया था, जो दिन 4 और 5 दिन तक लगभग 15% की चोटी परजीवी तक बढ़ गया। जैसा कि इस उच्च परजीवी में चित्रा 5A में दिखाया गया है, परजीवी पर जोर दिया जाता है और अलैंगिक चरण संस्कृति दुर्घटनाग्रस्त हो जाती है। हालांकि, इस तनाव के समान रूप से गेमटोसाइटोजेनेसिस को शामिल करने का परिणाम है। शुरुआती गेमटोसाइट्स दिन 6 और दिन 7 के बाद दिखाई दिए और अलैंगिक परजीवी धीरे-धीरे गिरावट आई लेकिन निम्न स्तर पर रहे। अलैंगिक चरण परजीवी की उपस्थिति ने मच्छर खिला प्रयोगों को प्रभावित नहीं किया। हालांकि, यदि गेमटोसाइट्स का उपयोग उन प्रयोगों में किया जाना है जिनके लिए शुद्ध संस्कृतियों की आवश्यकता होती है, जैसे कि दवा संवेदनशीलता परख और प्रोटेओमिक या ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन, अवशिष्ट अलैंगिक चरणों को 50 mM N-acetylglucosamine के साथ उपचार द्वारा हटाया जा सकता है। अधिकांश गेमटोसाइट्स 15 दिन तक वी चरण के लिए परिपक्व होते हैं, जिस समय वे मच्छरों के लिए संक्रामक हो जाते हैं और खिलाया जाने के लिए तैयार थे। गेमटोसाइट संस्कृति की दीक्षा के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर गिमसा-रंजित रक्त स्मीयरों की प्रतिनिधि छवियां चित्र 5बीमें दिखाई जाती हैं।

रक्त आहार के 8 से 10 दिनों के बीच, मच्छरों को संक्रमण की व्यापकता और तीव्रता निर्धारित करने के लिए विच्छेदित किया गया था। व्यापकता खिलाया मच्छरों का प्रतिशत है कि oocysts है, जबकि तीव्रता प्रत्येक मच्छर में पाया oocysts की संख्या है । दोनों ही फीड की सफलता के महत्वपूर्ण संकेतक हैं । 5 स्वतंत्र मच्छर फ़ीड से डेटा चित्र 6 में दिखाया गयाहै । पी फाल्सीपेरम एनएफ 54 की दिन 16 संस्कृति से 0.3% परिपक्व गेमटोसाइट्स के साथ खिलाने के बाद संक्रमितता के स्तर में सामान्य भिन्नता दिखाने के लिए फीड चुने गए थे। ऊसायक तीव्रता गेमटोसाइट्स के मच्छर संक्रमितता को निर्धारित करने के लिए मात्रात्मक डेटा प्रदान करती है और व्यापकता से पता चलता है कि संक्रमित होने वाले खिलाया मच्छरों का प्रतिशत। इन आंकड़ों का उपयोग ट्रांसमिशन अवरुद्ध एजेंटों का मूल्यांकन करने और टीकों और दवाओं को अवरुद्ध करने वाले पारेषण के लिए लक्ष्यों की पहचान करने और उनकी विशेषता के लिए किया जा सकता है । विभिन्न प्रयोगीय स्थितियों के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए प्रति पलटन के भीतर और बीच में oocysts की संख्या भिन्न होती है।

Oocyst तीव्रता सबसे पारेषण अवरुद्ध परख और रणनीतियों के अंत बिंदु के रूप में माना जाता है, लेकिन स्पोरोजोइट की संख्या आमतौर पर स्पोरोजोइट जीव विज्ञान के लिए और जिगर चरण के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं । तालिका 1 12 स्वतंत्र रक्त फ़ीड से प्रति मच्छर प्राप्त औसत संख्या स्पोरोजोइट्स दिखाती है। जैसा कि तालिका में दिखाया गया है, स्पोरोज़ोइट्स की औसत संख्या लगातार थी, हालांकि, एक प्रयोग था जहां हमने शून्य स्पोरोज़ोइट प्राप्त किया, जो परख की कभी-कभी विफलता का प्रतिनिधित्व करता था।

Figure 1
चित्रा 1: पी फाल्सीपेरम गेमटोसाइट संस्कृति और झिल्ली खिला प्रोटोकॉल का कार्यप्रवाह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मच्छर रक्त खिला सेट-अप। (ए)ग्लास फीडर और पैराफिन फिल्म का आयताकार टुकड़ा(बी) मच्छर कप के शीर्ष पर पैराफिल्म झिल्ली अटैचमेंट(सी)ग्लास फीडर से पहले और बाद में प्रदर्शित दो ग्लास फीडर और परिसंचरण जल स्नान से जुड़े हुए हैं । (घ,ई) कांच फीडर(एफ)ग्लास फीडर के नीचे देखने में रक्त फ़ीड की पिपटिंग रक्त फ़ीड(जी)के समरूप वितरण को दिखाते हुए पैराफिल्म झिल्ली के माध्यम से खिलाने वाले कई मच्छर। (ज)खिलाने के बाद मच्छर कप का शीर्ष दृश्य, कप के नीचे खिलाने वाले मच्छरों द्वारा उत्सर्जित रक्त की बूंदें दिखाता है । स्केल बार = 10 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: मच्छर मिडगुट विच्छेदन के चरणों को दिखाने वाले ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: मच्छर लार ग्रंथि विच्छेदन के कदम दिखा चित्रमय प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: संक्रमित मच्छर मिडगुट पर पी फाल्सीपेरम गेमटोसाइट संस्कृति और ओसिस्ट विज़ुअलाइज़ेशन। (A)15 दिन की गेमटोसाइट कल्चर का टाइम कोर्स, जो पहले 4 दिनों के भीतर पीक परजीवी के लिए अलैंगिक चरणों का भारी गुणा दिखाता है, जिसके बाद समय के साथ गेमटोसाइटोजेनेसिस और परिपक्वता होती है। (ख)गेमोसिट संस्कृति के विभिन्न चरणों को दिखाने वाले गेमोसिटे पतले रक्त धब्बा, दिन 1 प्रारंभिक अलैंगिक चरण, दिन 4 चोटी अलैंगिक परजीवी, उच्च परजीवी भार के कारण 6 दिन तनावग्रस्त संस्कृति, दिन 9 और 12 प्रारंभिक गेमटोसाइट्स और दिन 15 परिपक्व पुरुष और महिला गेमटोसाइट्स दिखाते हैं । अलैंगिक चरण से रूपात्मक रूप से प्रारंभिक चरण गेमटोसाइट्स अविवेच्य थे, लेकिन देर से चरण II ने नुकीले सिरों के साथ वर्धमान आकार दिखाया और परजीवी के रूप में विस्तारित किया गया जो चरण III और IV में विकसित हुआ। परिपक्व चरण वी गेमटोसाइट्स, हालांकि, गोल सिरों और न्यूनतम मेजबान सेल दृश्यता14के साथ क्लासिक वर्धमान आकार की विशेषता थी। स्केल बार = 10 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: पी फाल्सीपेरम ओसास्ट प्रति मच्छर मिडगुट गिना जाता है। (क)ग्राफ वर्षों में ओसास्ट मायने रखता है, प्रत्येक प्रयोग के लिए, मच्छरों को 0.3% गेमटोसाइट्स के साथ खिलाया गया था और 8 पोस्ट रक्त फ़ीड पर मिडगिट्स को विच्छेदित किया गया था। प्रत्येक डॉट व्यक्तिगत मिडगट्स से oocysts की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है और क्षैतिज रेखा औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करती है। (ख)टेबल शो का मतलब ओसिस्ट काउंट, संक्रमित मच्छरों की व्यापकता और संक्रमण की रेंज । (ग)विभिन्न आवर्धन पर दो अलग-अलग रक्त आहार प्रयोगों से मच्छर मिडगुट पर ओसिस्ट दिखाते चित्र। स्केल बार = 150 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रयोग विच्छेदन का दिन (रक्त फ़ीड के बाद) मतलब स्पोरोजोइट/मच्छर
1 14 42, 000
2 14 40, 000
3 14 42, 750
4 15 25, 411
5 15 33, 750
6 14 15, 750
7 16 0
8 15 33, 200
9 14 56, 333
10 14 45, 333
11 17 43, 750
12 16 56, 000

तालिका 1: 2 साल की अवधि में 12 स्वतंत्र चक्रों के लिए प्रति मच्छर लार ग्रंथियों की औसत संख्या। ए स्टीफेंसी मच्छरों को 0.3% पी फाल्सीपेरम गेमटोसाइट्स के साथ खिलाया गया था और 14-17 मच्छरों को 14-17 पोस्ट रक्त खिलाने के बीच विच्छेदित किया गया था। प्रति मच्छर औसत स्पोरोजोइट मायने रखता है।

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Discussion

यहां वर्णित तरीकों का 10 वर्षों तक जॉन्स हॉपकिंस मलेरिया अनुसंधान संस्थान में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है15,16 , 17,18,19,20,21 , 22,22. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पादित गेमटोसाइट्स का उपयोग उच्च थ्रूपुट गेमटोसाइटोसिडल परख22,प्रोटेओमिक15के साथ-साथ ट्रांसक्रिप्टोमिक23 अध्ययनों के लिए किया गया है। हालांकि , इन तरीकों को विकसित करने का एक बड़ा कारण मच्छरों के चरणों और स्पोरोजोइट्स23 , 24 , 25,26पर अध्ययन के लिए मच्छरों को संक्रमित करने के लिए परिपक्व गेमटोसाइट्स का उपयोग करना है। यह पांडुलिपि कांच झिल्ली फीडर का उपयोग करके परिपक्व पी फाल्सीपेरम गेमटोसाइट्स और मच्छरों के संक्रमण को उत्पन्न करने के विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। ये विधियां ट्रांसमिशन अवरुद्ध रणनीतियों, स्पोरोजोइट चरणों और पी फाल्सीपेरम के पूर्व-एरिथ्रोसाइटिक यकृत चरणों पर काम करने वाली किसी भी प्रयोगशाला के लिए महत्वपूर्ण हैं।

1981 में इफेइबा और वेंडरबर्ग ने 50 माइक्रोग्राम / एमएल हाइपोक्सेंथिन की उपस्थिति में पी फाल्सीपेरमकी दीर्घकालिक संस्कृति का वर्णन किया, जिसने अत्यधिक संक्रामक परिपक्व गेमटोसाइट्स27का उत्पादन किया। तब से 9 , 10 , 11,12के विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए गेमटोसाइट्स का उत्पादन करने के तरीकों का वर्णन करने वाले कई प्रकाशनहुएहैं । इनमें से अधिकांश प्रकाशन पैदावार बढ़ाने के लिए पहले वर्णित गेमटोसाइटोजेनेसिस-उत्प्रेरण स्थितियों का उपयोग करते हैं। वातानुकूलित मीडिया का उपयोग करना, अचानक परजीवी में वृद्धि द्वारा संस्कृति पर जोर देना, एनीमिया की नकल करने के लिए हेमेटोक्रिट में गिरावट, लाल रक्त कोशिका लाइसिस और लॉग चरण दमन थोक ऊपर तक, गेमटोसाइटोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहां वर्णित विधि सरल और समय की जांच की जाती है। 4% हेमेटोरिट पर 0.3-1% अलैंगिक चरण परजीवी के साथ गेमटोसाइट संस्कृति शुरू करें और 15-18 दिन तक हर दिन मीडिया बदलें। लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए, कम मार्ग अलैंगिक चरण परजीवी के साथ गेमटोसाइट संस्कृति शुरू करना, ताजा आरबीसी (<1 सप्ताह) का उपयोग करना और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि मीडिया परिवर्तन के दौरान संस्कृति के तापमान में उतार-चढ़ाव न हो। चूंकि फाल्सीपेरम गेमटोसाइट विकास प्रक्रिया अस्थि मज्जा4,5में पाठ्येतर रिक्त स्थान की स्थिर स्थितियों में तनहा होती है, इसलिए संस्कृति अवधि में बसे आरबीसी परतों को परेशान नहीं करना महत्वपूर्ण है।

स्थिरता के साथ पी फाल्सीपेरम गेमटोसाइट्स की मांग की जा रही है लेकिन उन्हें मच्छरों को संक्रमित करने के लिए प्राप्त करना जटिलता का एक और स्तर प्रस्तुत करता है। झिल्ली खिलाना गेमटोसाइट्स के अलावा कई चरों के अधीन है, जैसे मच्छर की उम्र और फिटनेस, मिडगुट माइक्रोबायोटा, और भोजन व्यवहार28,29। आमतौर पर एसएमएफए के आंकड़े उच्च मात्रा में परिवर्तनशीलता दिखाते हैं और विभिन्न प्रायोगिक स्थितियों के प्रभावों की पहचान करने के लिए बड़ी संख्या में मच्छरों की आवश्यकता होती है11,28. गेमटोसाइट्स के लिए कम मार्ग संस्कृति का उपयोग करना, स्वस्थ 3 - 6-दिन पुराने मच्छर और अनुकूलित झिल्ली खिला प्रोटोकॉल ओसास्ट गिनती में भिन्नता के साथ मदद कर सकते हैं।

गेमटोसाइट खेती और झिल्ली खिला दोनों के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल को कई वर्षों से अनुकूलित किया गया है। ये विधियां परिपक्व संचरण सक्षम गेमटोसाइट्स, मानक झिल्ली फीडिंग परख, मच्छर मिडगुट विच्छेदन और ओसास्ट क्वांटिफिकेशन के साथ-साथ लार ग्रंथि विच्छेदन और स्पोरोज़ोइट क्वांटिफिकेशन प्राप्त करने के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं। ये प्रोटोकॉल विश्वसनीय मच्छर संक्रमितता और मजबूत ओसास्ट मायने रखता है और स्पोरोज़ोइट पैदावार प्रदान करने के लिए आवश्यक गेमटोसाइट्स की संख्या के संदर्भ में संगत हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक जॉन्स हॉपकिंस मलेरिया अनुसंधान संस्थान (JHMRI) को वित्तीय सहायता के लिए ब्लूमबर्ग फिलेंज्ट्रीज का शुक्रिया अदा करते हैं । यह काम जेएचएमआरआई कीट और परजीवी विज्ञान कोर सुविधाओं द्वारा प्रदान की गई विशेषज्ञता के बिना संभव नहीं होता ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Sugar solution
10ml serological pipet Falcon 357551
15 ml conical tube Falcon 352096
1ml serological pipet Falcon 357521
25 ml serological pipet Falcon 357535
37°C Incubator
50 ml conical tube Falcon 352070
5ml serological pipet Falcon 357543
6 well tissue culture plates Falcon 353046
70% Ethanol
9" glass pipet Fisherbrand 13-678-6B
Anopheles Mosquitoes JHMRI, Insectary core We use A. stephensi or A. gambiae (keele)
cell counter
Circulating water bath
fine tip forceps Fisherbrand 12-000-122
Geimsa stain Sigma GS1L
Glass desiccator
Glass membrane feeder Chemglass Life Sciences CG183570
Glass slides Fisherbrand 12-552-3
HBSS Sigma H6648
Human Blood O+ JHU Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit
Human Serum O+ Interstate blood bank Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C.
Hypoxanthine Sigma H9337 Make 500x stock in 1M NaOH
Mercurochrome Sigma M7011 Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed
Micro Pipette
Microscope Olympus Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work.
Mosquito cups Neptune cups
N-acetylglucosamine Sigma A3286 Optional and needed only when pure gametocytes are required.
Netting Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding
Parafilm
PBS
Petri dish Thermo Scientific 249964
Pipet tips
Pipetman
Plasmodium falciparum NF54 BEI Resources MRA-1000 Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply
RPMI 1640 Corning CV-041-CV Media contains glutamine and HEPES
Slide warmer
Sodium bicarbonate Sigma S6297 Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation
water bath
Xanthurenic Acid Sigma D120804 For flagellation media

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References

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Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding. J. Vis. Exp. (161), e61426, doi:10.3791/61426 (2020).

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