Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Super-resolution Imaging at studere co-lokalisering af proteiner og synaptiske markører i primære neuroner

Published: October 31, 2020 doi: 10.3791/61434
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 2,3, 1
1Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 2Department of Neuroscience, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 3Dulbecco Telethon Institute, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS

Summary

Denne protokol viser, hvordan man anvender super-opløsning mikroskopi til at studere protein co-lokalisering i primære neuronale kulturer.

Abstract

Synapser er de funktionelle elementer af neuroner og deres defekter eller tab er på grundlag af flere neurodegenerative og neurologiske lidelser. Imaging undersøgelser er almindeligt anvendt til at undersøge deres funktion og plasticitet i fysiologiske og patologiske forhold. På grund af deres størrelse og struktur kræver lokaliseringsundersøgelser af proteiner billedbehandlingsteknikker med høj opløsning. I denne protokol beskriver vi en procedure til undersøgelse i primære neuroner co-lokalisering af målproteiner med synaptiske markører på et superopløsningsniveau ved hjælp af struktureret belysningmikroskopi (SIM). SIM er en mønstret lys belysning teknik, der fordobler den rumlige opløsning af wide-field mikroskopi, nå en detalje på omkring 100 nm. Protokollen angiver de nødvendige kontrolelementer og indstillinger for robuste undersøgelser af sam lokalisering og en oversigt over de statistiske metoder til at analysere billeddataene korrekt.

Introduction

Synapsens forståelse og synsbillede har ændret sig enormt siden den første beskrivelse af Foster og Sherrington i 18971. Siden da er vores viden om neuronal kommunikation og de molekylære processer bag den vokset eksponentielt2. Det er blevet klart, at synapser kan opfattes som et system med to rum: et præsynaptisk rum, der indeholder vesikler til frigivelse af neurotransmittere og et postsynaptisk rum med receptorer3. Denne forsimplede opfattelse, i de sidste tyve år, har udviklet sig til et komplekst netværk af de proteiner, der kræves for at transduce sender binding til signalering4.

Gevinsterne i forståelsen skyldes delvis super-opløsningteknikker,der overvandt diffraktion grænse konventionelle lys mikroskopi, der passer til dimensionen af synapserbedre 5,6,7,8,9,10. På grund af diffraktionsgrænsen kan et optisk mikroskop ikke nå en opløsning over 200 nm sideomside 11,12. For at omgå denne grænse blev der udviklet superopløsningsteknikker ved hjælp af forskellige tilgange og opnåelse af forskellige subdiffraktionsgrænseopløsninger: SIM, STED (Stimuleret emissionsudtømning Mikroskopi), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) og STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM fordobler den rumlige opløsning af laserbaserede mikroskopisystemer med brede felter ved at indsætte en diffraktionsrist i excitationsstrålens sti15. Den bevægelige rist diffracts laserstråler til at skabe en kendt belysning mønster, normalt striber. Dette bevidst strukturerede lysmønster er overlejret til den ukendte rumlige fordeling af fluorescerende farvestof (af prøven). Interferens frynser dannet af de to mønstre indkode for ellers skelnes fine detaljer med normal wide-field mikroskopi. Det endelige super-løst billede opnås ved at kombinere og afkodning med matematiske metoder flere rå billeder af den samme prøve opnået ved oversættelser og rotationer af diffraktion rist. Opløsningen af de super-løste billeder når 100 nm i side- og 500 nm i aksiale retninger for 2D-SIM15 eller 100 nm i side- og 250 nm i aksiale retninger for 3D-SIM16.

Den nye forståelse af synapsen er endnu vigtigere i lyset af de mange neurologiske lidelser, hvor synaptisk dysfunktion spiller en stor rolle i debut og progression17,18. Alzheimers sygdom, Downs syndrom, Parkinsons sygdom, prionsygdomme, epilepsi, autisme spektrum lidelser og skrøbelige X syndrom blandt andre har været forbundet med abnormiteter i synaptisk sammensætning, morfologi ogfunktion 19,,20,21,22.

For nylig, ved hjælp af et sæt af SUMO-specifikke antistoffer, vi brugte SIM til at vise co-lokalisering i primære hippocampal neuroner af SUMO proteiner med præ- og post-synaptic markører synaptophysin og PSD95 på super-opløsning niveau23. Dette gjorde det muligt for os at bekræfte biokemiske og konfokale mikroskopi beviser for SUMO lokalisering i neuroner.

Her beskriver vi en protokol til at studere lokalisering af proteiner i mus hippocampal primære neuroner. Samtidig kan denne protokol tilpasses til forskellige typer af primære neuronale kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Primære kulturer

  1. Kultur mus hippocampal primære neuroner i chambered coverslips (såsom Ibidi μ-Slide 8 Nå eller Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass), der matcher det objektive krav til #1,5 (0,17 mm) coverslip tykkelse.
  2. Belagte dæksler med 100 μL poly-L-lysin (100 μg/ml).
  3. Den næste dag vaskes de dekoreree dækslip to gange med sterilt fosfat-bufferet saltvand (PBS).
  4. For at opnå mus primære neuroner, isolere hippocampi fra P1-P4 hvalpe23.
  5. Placer dissekeret hippocampi i 10 ml dissektionsmedier (tabel 1), og lad dem aflejre i bunden af røret.
  6. Ved hjælp af en steril pipette skal du forsigtigt fjerne dissektionsmediet, så hippocampien ikke er uforstyrret i bunden af røret.
  7. Der tilsættes 10 ml Media 1 (Tabel 1) til hippocampien og inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
  8. Brug en steril pipette, forsigtigt fjerne Media 1, forlader hippocampi uforstyrret i bunden af røret.
  9. Der tilsættes 10 ml Media 2 (Tabel 1) og centrifugerøret (capped) under kølerhjelmen vandret i 45 minutter.
  10. Lad centrifugerøret stå lodret, så vævet kan falde til i bunden af røret.
  11. Brug en steril pipette, forsigtigt fjerne Media 2, forlader hippocampi uforstyrret i bunden af centrifuge røret.
  12. Der tilsættes 2 ml Media 3 (Tabel 1).
  13. Ved hjælp af en p1000 pipette med en filtreret spids, mekanisk adskille celler fra vævet.
  14. Overfør supernatanten, hvor de isolerede neuroner er placeret, til et 15 ml centrifugerør.
  15. Centrifuge celle suspension i 2 min ved 300 x g ved stuetemperatur (RT).
  16. Efter centrifugering er celler placeret i bunden af centrifugerøret. Brug en steril pipette kassere supernatant.
  17. Opslæmrede celler i 1 ml Media 4.
  18. Brug et 70 μm filter til at fjerne ikke-usocierede celler.
  19. Tæl levedygtige celler i et Bürker-kammer ved at tilsætte 1 μL 0,4 % trypanblå opløsning til 19 μL af cellesuspensionen.
  20. Pladeceller ved 70.000 celler/brønd i et volumen på 200 μL pr. brønd.
  21. Cellerne fastgøres i 2 timer i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
  22. Tag de chamberde dækslip ud af inkubatoren, og udskift forsigtigt mediet med 200 μL kulturmedier.
  23. Lad de 2. dækslæderne blive ladt i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
  24. Erstat en tredjedel af mediet med friske kulturmedier hver 5-7 dage.
  25. Vent, indtil hippocampal primære neuroner er fuldt modnet (12-14 dage efter plating) til at udføre co-lokalisering undersøgelser.

2. Immunofluorescens farvning

  1. Tag de chambered coverslips fra rugemaskinen.
  2. Fjern mediet.
  3. Vask hurtigt brøndene med 200 μL PBS.
  4. Der tilsættes 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (200 μL/brønd) til neuroner for at løse dem hurtigt.
  5. Inkuber cellerne i 15 min. på RT.
  6. Fjern PFA-løsningen.
  7. Permeabilize cellerne ved at tilføje PBS med 0,2% Triton X-100 (200 μL/ godt).
  8. Inkuber i 1 min på RT.
  9. Opløsningen fjernes og inkuberes prøverne med 1% kvægserumalbumin (BSA) i PBS (200 μL/brønd) i 1 time i RT for passivt at dække alle pladens frie bindingsflader med et irrelevant protein til analysen. En BSA-baseret blokeringsbuffer uden Triton X-100 reducerer antistofbaggrunden mere effektivt end den samme buffer med 0,2 % Triton X-100.
  10. Fjern opløsningen.
  11. Det primære valgantistof fortyndes i en PBS-opløsning, der indeholder 1% BSA og 0,2 % Triton X-100 (120-200 μL/brønd, afhængigt af antistoffets fortynding og tilgængelighed). Inkuber prøverne i 2 timer.
    1. Som en negativ kontrol, ikke tilføje nogen primær antistof til en af brøndene. Der kan anvendes flere antistoffer af forskellige arter mod forskellige mål på samme tid. Brug et antistof mod MAP2 (en neuronal markør) rejst i kylling, et antistof mod enten PSD95 eller synaptophysin rejst i mus, og et antistof mod et mål protein rejst i kanin. Dette giver mulighed for sim-analyser med tre farver.
  12. Vask hurtigt brøndene tre gange med PBS (200 μL/brønd).
  13. Tilsæt sekundære antistoffer (dyLight og Alexa sekundære antistoffer kan begge anvendes) fortyndet i en PBS-opløsning, der indeholder 1% BSA og 0,2% Triton X-100 (200 μL/brønd). Inkuber prøverne i 1 time i RT.
  14. Vask hurtigt brøndene tre gange med PBS (200 μL/brønd).
  15. Der tilsættes Hoechst-farvestof i en koncentration på 1 μg/ml fortyndet i PBS (200 μL/brønd) til pletkerner. Inkuber prøverne i 10 minutter ved RT.
  16. Vask hurtigt brøndene to gange med PBS.
  17. Monter celler ved hjælp af en SIM-kompatibel mountant. Brug 10 μL/brønd ProLong Glass Antifade Mountant.
  18. Dæk og beskyt cellerne med et dækglas (f.eks. et rundt dækglas med en diameter på 8 mm). Square dem kan også bruges.
  19. Opbevar de chamberede dækslips på RT og vent mindst 48 timer, før du køber billeder. Diamond Glass kræver mindst to dages hærdning før super-opløsning opkøb.

3. Bekæmpelse af antistof specificitet

BEMÆRK: Brug to strategier til at sikre antistof specificitet. Den første strategi er at bruge mindst to forskellige antistoffer rettet mod samme substrat. Den anden strategi er antistofneutralisering ved inkubation med det rensede proteinmål eller epitopen, der anvendes til at hæve antistoffet.

  1. Inkuber det valg af antistof med fem gange over det rekombinant mål eller epitop i 1 time ved RT i 1% BSA i PBS.
  2. Efter inkubationen anvendes det neutraliserede antistof ved den sædvanlige koncentration til farvning som beskrevet ovenfor fra 2.11.

4. Mikroskopkalibrering

BEMÆRK: Vi bruger rutinemæssigt et N-SIM Super-Resolution Microscope System fremstillet af Nikon til superopløsningsundersøgelser. Men flere andre virksomheder tilbyder også super-opløsning mikroskoper i deres kataloger. Selvom specifikke indikationer for Nikons N-SIM-system er beskrevet, kan de følgende instruktioner generaliseres til andre systemer. Før erhvervelsen af SIM-billeder, kræver systemet en ordentlig kalibrering med specifikke sub-opløsning størrelse fluorescerende perler. Et eksempel er TetraSpeck mikrosfærer. Disse perler er plettet med forskellige fluorescerende farvestoffer til at tillade kalibrering af forskellige lasere med en prøve.

  1. I et vandbad sonikere omkring 1,8 x 108 fluorescerende mikrosfærer i 10 minutter. Nikons N-SIM-system kræver en tyndt befolket flerfarvet perler prøve til kalibreringen. Dette kan variere for andre systemer, der kræver et tæt enkelt lag af sub-opløsning størrelse fluorescerende perler. Juster antallet af fluorescerende partikler i overensstemmelse hermed.
  2. Fortyndes de fluorescerende mikrosfærer 1:500 i dobbelt destilleret vand.
  3. Sonikere en anden gang i yderligere 10 minutter.
  4. Pipet 15 μL af de fortyndede perler i en brønd af en chambered coverslip.
  5. Lad opløsningen tørre i 5 minutter ved RT.
  6. Der tilsættes 10 μL monteringsopløsning, og der skal sættes en 8 mm dækslæb ovenpå.
  7. Vent mindst 48 timer for at tillade korrekt hærdning.
  8. Tænd for mikroskopet og laserne.
  9. Lad systemet varme op for at nå den termiske ligevægt af alle mikroskopkomponenter. N-SIM Super-Resolution Microscope System kræver mindst 3 timer.
  10. Vælg 100x-målsætningen.
  11. Start kalibreringen ved at justere laserne til midten af diffraktionsristblokken. I N-SIM-systemet giver en mikrometerknap og et dedikeret kamera centrering af lysstrålerne til målet.
  12. Sæt den chamberede dækslæb i mikroskopet til visning. Indstil systemet til den kammerdækde dækslædtykkelse ved at justere den objektive korrektionskrave. NIS software, den proprietære software leveres med N-SIM Super-Resolution Microscope systemer, har en automatisk funktion til at regulere korrektion kraver.
  13. Juster ristblokfokus for hver kanal for at sikre fokuseret struktureret mønsterbelysning på prøven. NIS-software giver en automatisk funktion til denne opgave.
  14. Dernæst erhverve rå 3D-SIM-billeder af flerfarvede mikrosfærer. Rekonstruere de rå billeder for at opnå en super-løst billede ved hjælp af mikroskop software eller open source software platform til analyse af biologiske billeder ImageJ24 og plugin fairSIM25.
  15. Beregn fourier-transformeringen af det super-løste billede, der er opnået i 4.14, for hver adskilt bølgelængde. Hvis det transformerede billede ikke opnår et korrekt blomsterlignende mønster, skal du genstarte kalibreringen fra 4.11, da superopløsning ikke er opnået.
  16. I det superopsøgte billede skal du vælge en enkelt mikrosfære og beregne dens intensitetsprofil for hver kanal for at måle den opnåede opløsning. Det skal nu være tæt på 100 nm side om side.
  17. Dernæst udføre kanal registrering ved at overlejre en multichannel erhvervelse af mikrosfærer. Målet er at samle alle kanalsignaler side om side og aksialt. Dette vil fjerne kromatiske afvigelser på grund af forskydningen af de forskellige kanaler og hjælpe co-lokalisering analyse.
  18. Bekræft kvaliteten af kalibreringen ved hjælp af funktionerne "Illumination Phase Steps" og "Illumination Pattern Focus" af SIMcheck26, en suite af plugins til open source-programmet ImageJ. Med henblik herpå skal du forberede en dækslet i et kammer for at opnå et tæt enkelt lag TetraSpeck-mikrosfærer og anskaffe et 3D-SIM-billede af prøven. Analysér billedet i ImageJ, og genstart kalibrering af mikroskopet fra trin 4.11, hvis der registreres afvigelser.

5. Erhvervelse

  1. Begynd at analysere prøveemnet ved hjælp af en 40x-målsætning i konfokal eller widefield-tilstand. Dette gør det muligt at navigere til prøven, opretholde gode detaljer og et stort synsfelt.
  2. Brug MAP2-antistofsignalet til at identificere et område, der repræsenterer neuronale processer.
  3. Ansk af prøven i konfokal tilstand for at bestemme farvningskvaliteten. Dårlig konfokal kvalitet vil afspejle i dårlig SIM-kvalitet, hvilket kræver, at prøverne skal kasseres.
  4. Hvis området og kvaliteten af billederne er tilfredsstillende, skal du skifte målet til 100x.
  5. Anvend olie på 100x målet.
  6. Anskå et widefield- eller konfokalt billede, der senere skal bruges til at vurdere kvaliteten af det superkonfekterede billede (Figur 1A,B).
  7. Skift til 3D-SIM-tilstand.
  8. Ved hjælp af dialogvinduer til at angive parametre for anskaffelse skal du vælge den højeste tilgængelige bitdybdeindstilling for at maksimere farveoplysningerne. Typisk er 16-bit standardvalget. For at forbedre signal-støj-forholdet skal du desuden vælge en lav frekvensværdi for anskaffelse, f.eks.
  9. Ved hjælp af histogram vinduer, indstille lasere magt til at opnå en lineær reaktion af signal. Hvis du vil undgå tab af oplysninger, skal du begrænse mættede pixel i billederne. N-SIM-systemet bruger et Andor iXon3-kamera. Når du arbejder ved 16-bit, skal du vælge en målintensitet på 16.000 for at sikre kameraets lineære reaktion. Alternativt kan du vælge et interval mellem 30.000-45.000 for at maksimere det dynamiske område af anskaffelsen.
  10. Indstil lasereffekten mellem 0,1 % og 50 %, når prøverne og eksponeringstiden skal aflydes mellem 50 ms og 2 s. Laserkræfter over 50% kan forårsage hurtig fotobleaching af fluorophores i brug.
  11. Begynd at anskaffe billederne i 3D-SIM-tilstand.
  12. Brug SIMcheck, en suite af gratis plugins til ImageJ, at vurdere kvaliteten af erhvervelsen af de rå billeder.
  13. Hvis SIMCheck ikke registrerer artefakter eller kvalitetsproblemer, skal du anskaffe mindst 10 billeder fra 4 tekniske replikater for at muliggøre statistisk analyse.

6. Efterproduktion: genopbygning af billeder

BEMÆRK: 3D-SIM-erhvervede billeder er rå billeder, der skal behandles for at opnå rekonstruerede super-løste billeder. Forkert rekonstruktion af rå billeder kan føre til artefakter, der ville påvirke analysen af prøverne. Der bør derfor lægges stor vægt på at vælge genopbygningsparametre ordentligt.

  1. Betøb de rå billeder ved hjælp af mikroskoprekonstruktionsanalysesoftwaren for at opnå et superoparbejdet billede (Figur 1C). Alternativt kan du bruge den frit tilgængelige ImageJ plugin fairSIM at rekonstruere rå billeder.
  2. Beregn Fourier transformeringen af de super-løste billeder ved hjælp af mikroskoprekonstruktionssoftwaren eller ImageJ plugin SIMCheck. Et godt rekonstrueret billede bør vende tilbage, for hver kanal, en blomst-lignende billede. Hvis de rekonstruerede billeder ikke genskaber en blomsterlignende form, skal du genstarte fra de rå billeder og rekonstruere dem ved at ændre rekonstruktionsparametrene som Wiener-filtrering, apodisering og nul-ordens undertrykkelse27. I NIS-software skal du bruge eksemplet til at overvåge, hvordan ændring af parametre påvirker det endelige løst billede, ændre parametrene i) Belysningsmodulationskontrast, ii) støjundertrykkning med høj opløsning og iii) Out of Focus-undertrykkelse.
  3. Dernæst analysere det rekonstruerede billede til upartisk opdage artefakter ved hjælp af NanoJ-EGERN28, en ImageJ-baseret plugin til at vurdere kvaliteten af super-løst billeder.
  4. Hvis NanoJ-SQUIRREL registrerer artefakter, skal du genstarte fra de rå billeder og rekonstruere dem ved at ændre rekonstruktionsparametrene som Wiener-filtrering, apodisering og nul-ordens undertrykkelse. I NIS-software skal du bruge eksemplet til at overvåge, hvordan ændring af parametrene påvirker det endelige løsningsbillede, ændre parametrene Illumination Modulation Contrast, High Resolution Noise Suppression og Out of Focus Suppression.
  5. Brug de super-løste billeder til at beregne co-lokaliseringsprofilen og/eller Pearsons og Manders koefficienter.

7. Co-lokalisering med profilanalyse

BEMÆRK: Som et første skridt til at studere co-lokalisering mellem synaptiske markører og et protein af interesse, tage en super-løst billede og analysere en enkelt locus at bestemme signal overlapning.

  1. Identificer en enkelt locus på det super-løste billede.
  2. Få intensitetsprofilerne for fluorescerende signaler fra interesseens græs.
  3. Eksporter dataene.
  4. Brug GraphPad Prism, eller en lignende analyse software, til at normalisere alle signal toppe og opnå sammenlignelige signalintensiteter for hver kanal med det endelige mål at bestemme locus specifikke co-lokalisering.

8. Kvantificering af Pearsons og Manders koefficienter

BEMÆRK: Hvis profilanalysen har foreslået en enkelt locus-koalisering, kan der foretages en mere generel analyse af helhedsbilledet ved at beregne Pearsons og Manders koefficienter29,30.

  1. Brug JACoP31, en ImageJ plug-in, til at bestemme de to parametre for co-lokalisering: Pearson's og Mander's.

9. Statistisk analyse

  1. Brug GraphPad Prism, eller en lignende analyse og graftegning software, til at behandle data indsamlet med JACoP.
  2. Brug mindst 40 SIM-billeder til hver analyseret tilstand for at få grafer og statistisk relevans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi præsenterer her standard workflow at studere neuronal proteiner co-lokalisering. Vi kalibrerede først mikroskopet, og derefter udførte vi SIM-analyse af prøverne. For at kalibrere systemet brugte vi fluorescerende mikrosfærer med en diameter på 0,1 μm. Ved at opnå super-løst 3D-SIM-billeder af perlerne, er de underliggende billeddata Fourier-transformeret til at konvertere dem til en rumlig frekvens repræsentation. I figur 2Apræsenteres det særskilte blomstermønster som en indikation af detaljerniveauer i superopløsning. Vi målte derefter den opnåede opløsning ved at beregne den fulde bredde ved halvt maksimum (FWHM) af toppen af en enkelt perles intensitetsprofil (figur 2B,C). Endelig korrigerede vi kromatisk aberration ved kanalregistrering, igen ved hjælp af fluorescerende mikrosfærer (Figur 3A, B). Dernæst begyndte vi at analysere prøven med en 100x mål, og vi erhvervede 3D-SIM-billeder. Vi brugte SIMCheck til at vurdere jævnheden af feltbelysning eller bevægelse under erhvervelsen (Figur 4A). Vi kontrollerede forskelle i intensitet mellem belysningsmønstervinkler (Figur 4B), og vi beregnede forholdet mellem moduleringskontrasten og støj for at måle den lokale stribekontrast (Figur 4C). Endelig anslog vi en effektiv løsning af genopbygningen (figur 4D).

Vi bekræftede derefter kvaliteten af de super-løste billeder ved hjælp af NanoJ-SQUIRREL. I det første rekonstruerede billede (Figur 5A) opdagede NanoJ-SQUIRREL tilstedeværelsen af artefakter (Figur 5C). Vi ændrede genopbygningsparametrene for at opnå et nyt super-løst billede(Figur 5B)og NanoJ-SQUIRREL bekræftede manglen på artefakter (Figur 5D). Efter at have kalibreret systemet og vurderet kvaliteten af de rekonstruerede billeder, begyndte vi derefter at analysere de primære neuronale kulturer farves med et antistof mod MAP2, en neuronal markør, PSD95, en post-synaptisk markør og målproteinet SUMO1. Vi analyserede først prøven udfører fire-kanals konfokal mikroskopi med en 40x mål (Figur 6A). Ved at vælge et område, der repræsenterer neuronale processer, skiftede vi til en 100x mål. Vi har erhvervet både konfokale og SIM-billeder af samme område for at vurdere kvaliteten af rekonstruktionen med NanoJ-SQUIRREL og udføre co-lokaliseringsanalyse. I figur 6Bviser vi det superløse 3D-SIM-billede af neuroner, der er plettet for SENP1 og drebrin. Sam lokalisering i super-løst billeder kan analyseres med profil analyse (Figur 7A) og kvantificering af Pearsons og Mander's koefficienter (Figur 7B).

Figure 1
Figur 1: Sammenligning af erhvervelser af widefield, konfokale og SIM. (A)Widefield billede af primære hippocampal neuroner immunstained for SENP1 (grøn), drebrin (rød) og MAP2 (lilla). DAPI blev brugt til at plette kerner. Skaler bar 5 μm. (B) Konfokalbillede af samme prøve af panel A. (C) SIM-billede af den samme prøve af panel A og B. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Analyse af et 3D-SIM-billede af mikrosfærer til kalibrering af mikroskop. (A) Fast Fourier omdanne en erhvervelse af mikrosfærer med sin blomst-lignende form. (B) Valg af en enkelt mikrosfære til bestemmelse af lateral rumlig opløsning. cC) Intensitetsprofilen for den enkelte mikrosfære i B med måling af dens FWHM. Værdierne repræsenterer den opløsning, som instrumentet opnår. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Registrering af tre kanaler. A) Erhvervelse af flerfarvede (bølgelængder 488nm, 555nm og 647nm) TetraSpeck mikrosfærer før registreringen. BB) Erhvervelse af den samme prøve efter kalibrering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Kvalitetsvurdering af rå og rekonstruerede billeder ved hjælp af SIMcheck. (A) Analyse af bevægelses- og belysningsvariation ved hjælp af SIMCheck. Signal grå til hvid repræsenterer homogen belysning og fravær af bevægelse under erhvervelsen. (B) Kanalintensitetsprofil opnået ved at analysere det rå billede. I dette eksempel er intensitet variation minimal, at foreslå mangel eller blegning eller udsving. (C) Rå graduering Kontrast til at beregne forholdet mellem graduering kontrast-til-støj i billedet. Heatmap viser modulering kontrast variationer. (D) Rekonstrueret Fourier Plot at analysere amplitude Fourier spektrum til at bestemme den effektive opløsning af genopbygningen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Vurdering af billedkvalitet i superopløsning ved hjælp af NanoJ-SQUIRREL. (A) Reference super-opløsning billede med artefakter. (B) Reference super-opløsning billede af god kvalitet. (C) Billede, der repræsenterer NanoJ-SQUIRREL fejl kort over A. Lysere områder repræsenterer store artefakter, mens mørkere repræsenterer korrekt genopbygning. (D) NanoJ-SQUIRREL fejl kort over B. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Eksempel på SIM-billede. (A) Konfokal mikroskopi af primære neuroner. Der blev valgt et 40X-mål for at få et overblik over stikprøven, samtidig med at der blev bevaret en god opløsning. Cellerne blev immunstained for SUMO1 (grøn), PSD95 (rød) og MAP2 (lilla). DAPI blev brugt til at plette kerner. Skalabar 50 μm. Billeder blev vist som Z projektion. (B)SIM-billeder til SUMO1 og PSD95 på det område, der er fremhævet i den grønne boks i panel A ved hjælp af en 100X mål. Røde pilespidser angiver placeringen af det indlæg, der er vist i A, og som bruges til at beregne intensitetsprofilen. Skala bar 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Analyse af sam lokalisering. (A) Super-løst billede af primære neuroner plettet med et antistof mod SENP1 (med grønt) og drebrin (i rødt), skala bar 0,5 μm, og dens intensitet profil. Grafens værdier blev normaliseret for hver kanal til 100 (vilkårlig enhed) og svarer til den pixelintensitet, der vises af den blå pil. BB) Analyse ved hjælp af JACoP til beregning af Pearsons korrelationskoefficient og Manders koefficient mellem SENP1 og drebrin. Vinduer i plug-in-opsætningen og den visuelle grænse vises. Manders koefficient udtrykkes ved to værdier – SENP1-brøk, der sam lokaliserer med drebrin (M1) og den drebrinfraktion, der sam lokaliserer med SENP1 (M2). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Belysning af synapsens struktur og sammensætning er afgørende for at forstå de fysiologiske og patologiske processer, der regulerer hukommelse og kognition. Mens der i den normale tilstand, synapser er byggestenene i hukommelsen, de også ligger til grund for komplekse neurologiske lidelser såsom Alzheimers sygdom32. Den protokol, der er beskrevet her tjener til at studere co-lokalisering af neuronal proteiner med en super-opløsning mikroskopi teknik kaldet SIM. Ved hjælp af et bestemt belysningsmønster kan SIM nå en opløsning på ca. 0,1 μm, som er egnet til undersøgelse af synapser, som normalt måler mellem 0,03 og 0,15 μm. For endnu flere detaljer, andre super-opløsning teknikker såsom STED (Stimuleret Emission Udledning Mikroskopi), PALM (PhotoActivated Lokalisering Mikroskopi) eller STORM (Stokastisk Optisk Genopbygning Mikroskopi), der kan nå en opløsning på 10-20 nm, kan anvendes33.

Her beskriver vi analysen af co-lokalisering af målproteiner med synaptiske markører i primære neuroner. Protokollen kan anvendes på enhver primær kultur af neuronale celler, såsom hippocampal, cerebellar eller kortikale neuroner og endda til kulturer af primære neuroner, der ikke hører til centralnervesystemet, såsom enteriske nervesystem neuroner. Nøglen til analysen på superopløsningsniveau er imidlertid de reagenser, der anvendes under erhvervelsen, såsom kammerdækslip og monteringsløsninger, der er forenelige med målets diffraktionsindeks. Vi brugte chambered coverslips for deres brugervenlighed, men den klassiske, billigere metode til dyrkning af primære neuroner på belagt coverglas er ikke desto mindre gyldig, især med en høj præcision #1.5H (0,17 mm) coverglas. Derudover bør der anvendes et monteringsmedie, der kan nå et brydningsindeks så tæt som muligt på brydningsindekset for glas (1,52) og en nedsænkningsolie til 100x-målet med et brydningsindeks på 1,515. Konstant rumtemperatur og stabiliserede borde er også obligatoriske for at sikre nøjagtigheden af erhvervelserne.

Vi bruger både dyLight og Alexa sekundære antistoffer i SIM-undersøgelser. På grund af deres smalle toppe af excitation og emission og godt kvanteudbytte, er de indiceret til super-opløsning teknikker, der kræver det bedste signal til støj forhold. Dempsey et al. sammenlignede Alexa, dyLight og andre fluorophores for super-opløsning imaging34.

Under erhvervelsen indstiller vi rutinemæssigt kameraet til 1 MHz over 10 MHz. 1 MHz takket være en langsommere anskaffelseshastighed, giver billederne større nøjagtighed og mindre støj end 10 MHz. 1 MHz udlæsetilstand kan også optage med en bitdybde på 16 bit (sammenlignet med den maksimale 14 bit 10 MHz), hvilket giver mere farveinformation og en mere præcis farvegradient til billederne. Men 10 MHz, med sin hastighed, er nyttig for levende billeder. For at undgå blegning og bevare fluorophore, vi også indstille laser magt så lavt som muligt. For at forbedre signalintensiteten kan gain-værdier øges. Det er værd at bemærke, at lavere gevinst garanterer renere billeder uden at øge støj. Generelt opnås de bedste resultater, mens billeddannelse inden for 7 μm fra bunden af den chambered coverslip. Dette er især vigtigt, når du bruger en 100x mål med olie nedsænkning. Hvis dybere erhvervelse på tværs af celler / væv er påkrævet, et bedre valg kan være brugen af en 60x mål med vand nedsænkning.

En af de største udfordringer i udførelsen af SIM-undersøgelser er billedrekonstruktion35. Opnåelse af super-løste billeder uden artefakter og aberration kræver ikke kun brug af ad hoc eksperimentelle betingelser, men også omhyggelig kalibrering af systemet og parameteroptimering for at opnå de endelige billeder. I protokollen beskriver vi, hvordan man undgår nogle af de mest almindelige fejl ved at vurdere kalibrering af systemet og kvalitetsanalyse af rå og rekonstruerede billeder. Konkret beskriver vi brugen af ImageJ plugins SIMCheck og NanoJ-EGERN for at sikre korrekte instrumentindstillinger for at forhindre almindelige artefakter af super-løste billeder. Ansøgningerne giver mulighed for en objektiv kvalitetsvurdering af de endelige billeder, som ikke er baseret på subjektiv benchmarking af resultaterne i forhold til forudgående kendskab til studiestrukturerne.

Vi foreslår at bruge synaptophysin og PSD95 eller drebrin som præ- og post-synaptiske markører, selvom andre markører også er gyldige. En enorm mængde litteratur beskriver proteiner som fagot som synaptiske markører36,37. Det er værd at bemærke, at præ- og postsynaptiske markører dog er til stede i hele cellen, bortset fra kernen. Meget af deres signal er ikke-synaptisk, men repræsenterer proteiner i transport eller nedbrydning, baggrund eller andre artefakter. Det er derfor vigtigt nøje at vælge analyseområdet. Vi bruger MAP2 antistof signal til at vælge axon og dendritiske terminaler.

I analysen af co-lokalisering bruger vi to tilgange. Den første er en visuel tilgang, der er baseret på profilanalyse, der viser enkelte hændelser med sam lokalisering og identificerer bidraget fra hver kanal. Et forbehold over for denne tilgang er imidlertid den dårlige statistiske magt. Af denne grund besluttede vi også at bruge en anden metode baseret på analyse af et større antal begivenheder, der er repræsentative for hele området for hvert billede. Denne metode er baseret på beregning af Pearsons korrelationskoefficient og Manders M1- og M2-koefficienter. Vi bruger Pearsons korrelationskoefficient til at beskrive overlapningen af signaler i billedet og Manders M1 og M2 til at beskrive gensidig sam lokalisering mellem interessesignaler38. Til beregning anvender vi ImageJ plugin JACoP, da det har en funktion, der giver dig mulighed for at indstille en manuel tærskel for at kassere ethvert baggrundsbidrag til analysen, især kritisk for Manders analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Edoardo Micotti for konstruktiv kritik af manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af BrightFocus A2019296F, af Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), af Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) og af Marie Skłwska-Curie Innovative Training Network (JK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan blue solution  Thermo Fisher Scientific 15250061 Chemical
70 µm filter  Corning 352350 Equiment
Alexa Thermo Fisher Scientific - Antibody
Antibody SENP1 Santa Cruz sc-271360 Antibody
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Chemical
Bovine serum albumin  Merck 5470 Chemical
CaCl2 Merck Life Science 21115 Chemical
Chambered coverslips Ibidi 80826 Equiment
DyLight Thermo Fisher Scientific - Antibody
FBS (Hyclone) GIBCO SH3007002 (CHA1111L) Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent Thermo Fisher Scientific F8803 Equiment
Glucose Merck Life Science G8769 Chemical
Glutamax GIBCO 35050061 Chemical
HEPES Merck Life Science H3537 Chemical
L-Cystein  Merck Life Science  C6852-25g Chemical
MAP2 Merck AB15452 Antibody
MEM  Life Technologies 21575022 Medium
MgCl Merck Life Science M8266 Chemical
NaOH VWR International 1,091,371,000 Chemical
Neurobasal A Life Technologies 10888022 Medium
N-SIM Super Resolution Microscope Nikon - Instrument
Papain Merck Life Science  P-3125 Chemical
paraformaldehyde  Thermo Fisher Scientific 28908 Chemical
Pen/Strep 10x Life Technologies 15140122 Chemical
phosphate-buffered saline  Gibco 10010023 Chemical
Poly-L lysine Sigma P2636 Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970 Chemical
PSD95  NeuroMab K28/43 Antibody
Round coverglass Thermo 12052712 Equiment
SUMO1 Abcam ab32058 Antibody
Synaptophysin  Merck S5768  Antibody
Triton X-100  Merck T8787 Chemical
Trypsin inhibitor  Merck Life Science  T9003-500MG Chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, M., Sherrington, C. S. A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , MacMillan & Co Ltd. London. (1897).
  2. Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
  3. McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
  4. Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
  5. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  6. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  7. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
  8. Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
  9. Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
  10. Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
  11. Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).
  12. Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
  13. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
  14. Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
  15. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  16. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  17. Brose, N., O'Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
  18. Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington's disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
  19. Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
  20. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
  21. Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
  22. Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
  23. Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
  26. Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
  27. Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
  28. Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
  29. Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
  30. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
  31. Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
  32. Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
  33. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  34. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  35. Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy - A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
  36. Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
  37. Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
  38. Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).

Tags

Neurovidenskab Problem 164 Neurovidenskab Hjerne Primær Neuronal Kultur Mikroskopi Super-opløsning
Super-resolution Imaging at studere co-lokalisering af proteiner og synaptiske markører i primære neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Russo, L., Natale, C., Conz, A.,… More

Russo, L., Natale, C., Conz, A., Kelk, J., Restelli, E., Chiesa, R., Salmona, M., Fioriti, L., Colnaghi, L. Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (164), e61434, doi:10.3791/61434 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter