Summary
이 프로토콜은 배아 마우스 뇌에서 1 차적인 해마 뉴런을 배양하기위한 방법을 설명합니다. 배양된 뉴런의 세포외 표면에 있는 주요 조직적합성 복합 클래스 I의 발현은 유동 세포 측정 분석에 의해 평가된다.
Abstract
증가 증거는 신경 면역 상호 작용동종 및 병리 조건 모두에서 신 경계 기능에 영향을 미치는 가설을 지원. 주요 조직적합성 복합클래스 I(MHCI)의 잘 연구된 기능은 특히 감염에 대한 반응으로 적응성 면역 계통에 세포 유래 펩티드의 프리젠테이션이다. 최근에는 뉴런에 대한 MHCI 분자의 발현이 정상적인 발달 및 신경 학적 장애 동안 시냅스 연결의 활동 의존적 변화를 조절할 수 있음을 보여주었습니다. 뇌 건강에 이러한 기능의 중요성은 뉴런에 MHCI 표현을 쉽게 감지 하는 민감한 분석에 대 한 필요성을 지원. 여기서 우리는 뮤린 해마 뉴런의 1 차 적인 문화에 대한 방법을 설명하고 유동 세포 분석에 의한 MHCI 발현의 평가. 뮤린 해마는 배아 의 날에 산전 마우스 새끼에서 미세 하게 18. 조직은 효소 및 기계 기술을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 해리되고, 비 신경 세포의 성장을 제한하는 혈청없는 매체에서 배양됩니다. 시험관내 7일 후, MHCI 발현은 베타 인터페론으로 약리학적으로 배양된 세포를 치료함으로써 자극된다. MHCI 분자는 형광 태그 항체로 시트에 표시되고, 세포는 단하나 세포 현탁액으로 비 효소적으로 해리된다. 신경 정체성을 확인하기 위해 세포는 파라포름알데히드, 투과성, 뉴런 핵 항원 NeuN을 인식하는 형광 태그 항체로 부착됩니다. MHCI 발현은 유동 세포 측정 분석에 의해 뉴런에 정량화된다. 신경 배양은 특정 가설을 시험하기 위하여 유전 수정 또는 약리학 내정간섭에 의해 쉽게 조작될 수 있습니다. 약간의 수정으로, 이러한 방법은 다른 신경 인구를 문화하거나 관심의 다른 단백질의 표현을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
중추 신경계 (CNS)는 한 때 면역 감시가 없는 것으로 생각되었다, "면역 특권1."로언급. 이 특권은 면역 성분의 절대부재와 동일시되는 것이 아니라 면역병리학1과관련된 손상을 제한하는 기능적인 규정이 분명합니다. 실제로, CNS와 면역 계통 사이 통신은 건강한 두뇌 발달 및 감염에 대한반응에필요한 지속적인 대화입니다2,3.
주요 조직적합성 복합클래스 I(MHCI) 분자는 감염4시CD8+ T 세포에 항원 펩티드를 제시하는 기능으로 가장 잘 알려진 다형성 및 다형성 트랜스멤브레인 단백질이다. 고전적인 MHCI 복합체는 β2-microglobulin에게 불린 α 세포외 광 사슬 및 세포외 광 사슬로 이루어져 있습니다. α 체인에는 프레젠테이션5에항원 펩티드를 결합하는 다형성 홈이 포함되어 있습니다. 세포외 막상에서 MHCI의 적절한 발현은 고혈압 펩타이드 리간드5의하중과 함께 α 사슬 및 β2-microglobulin의 적절한 접이식을 보장하기 위해 내시경 망상에서 분자 샤페론의 조정된 작용을 필요로 한다. MHCI 복합체가 조립된 후에만, 그들은 진피성 망상에서 플라즈마 멤브레인6으로수출된다. 펩티드 로드 MHCI 복합체와 cognate T 세포 수용체의 결합시,CD8+ T 세포는 페포린과 그란자임을 포함하는 lytic 과립을 방출하거나 표적 세포막7에결합 Fas 수용체를 통해 세포 멸망을 유도함으로써 세포 를 중화한다. 또한,CD8+T 세포는 감마 인터페론(IFNγ) 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα)와 같은 사이토카인을 생성하여 세포요법 효과 없이 감염된 세포에서 항바이러스 메커니즘을 활성화할 수 있다8,9. 많은 신경성 바이러스의 경우,CD8+ T 세포는 CNS10,11,12로부터감염을 지우기 위해 필요하다.
그것은 이전에 뉴런 손상의 조건에서 MHCI를 표현 생각 되었다, 바이러스 감염, 또는 체 외 사이토 카 인 자극. 최근, 연구는 시냅스 리모델링 및가소성(13,14)에서MHCI의 신경 발현에 대한 역할을 확인했습니다. 시냅스 규정의 기본 정확한 메커니즘은 잘 이해되지 않지만, 데이터는 MHCI 발현 수준이 시냅스 활동에 의해 조절된다는 것을나타냅니다(15,16). 한 가설은 뉴런이 결합 된 면역 글로불린 같은 수용체 B (PirB)를 선신적으로 표현한다는 것을 주며, 이는 MHCI transynaptically13,17을결합합니다. 이러한 상호작용은 시냅스 리모델링과 관련된 경로를 반대하는 PirB에 의한 신호 캐스케이드를 개시하여 시냅스 연결17,18,19를보강및 안정화시킨다. 신경 활성이 없는 경우, MHCI 발현이14감소되고,MHCI의 손실은 결함이 있는 시냅스 제거 및 잘못된 시냅스회로(20,21)의결과로 발생한다.
여기에서 기술된 분석체는 Chevalier외. 9에서적응된, 뮤린 해마 뉴런의 1차 배양에 MHCI의 세포외 단백질 발현을 정량적으로 평가하기 위하여 유량 세포 측정 분석을 이용합니다. 이 프로토콜은 배아 마우스 새끼로부터 해마 조직을 미세 하부화하기 위한 초기 기술을 보여줍니다. 그런 다음 조직의 효소 및 기계적 해리과정을 단일 세포 현탁액으로 구체화하고 시험관 내 배양을 유지하는 방법을 자세히설명합니다. 그들은 분할하지 않기 때문에, 일단 문화에, 뉴런은 자신의 실험 끝점에 적합한 접시와 밀도에 도금해야합니다. 다음으로, 베타 인터페론(IFNβ)을 사용하여 MHCI 발현을 유도하고, MHCI 및 뉴런 핵 마커 NeuN에 대한 면역 라벨링, 유동 세포측정을 통해 세포를 분석하는 단계를 간략하게 설명합니다. 마지막으로, MHCI 양성 뉴런을 식별하고 MHCI 발현의 수준을 정량화하기 위해 유동 세포측정 데이터를 평가하는 절차를 설명합니다. 또한이 프로토콜에 언급 된 것은 해마 뉴런 이외에 또는 대신 피질 뉴런을 배양하기 위해 만들 수있는 작은 조정입니다. 이 프로토콜은 유전 변이 또는 약리학적 치료를 사용하여 특정 가설을 테스트하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다.
Protocol
모든 절차는 국립 보건원의 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권고사항을 준수하고 동물과 관련된 생물 의학 연구를위한 국제 지침 원칙에 따라 수행되었습니다. 프로토콜은 샬럿 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 노스 캐롤라이나 대학에 의해 승인되었다 (프로토콜 #19-020).
1. 문화준비
참고: 이러한 절차는 조직 배양으로 지정된 생물 안전 캐비닛의 멸균 조건하에서 수행해야 합니다. 미디어 및 솔루션에 대한 표 1을 참조하십시오.
- 자체 밀봉 살균 백에서 자동화하여 모든 해부 도구를 소독합니다.
- 12웰 문화 요리를 치료하기 위해 폴리 D-리신의 작업 주식을 준비합니다.
- 100 μg/mL(10배 농축)의 농도로 폴리-D-리신을 1배 붕산완충으로 용해한다. 필요할 때까지 -20°C에 약 1mL 알리쿼트저장하십시오.
- dPBS에서 10배 농축 폴리-D-리신을 10μg/mL(1x)으로 희석하고 필터 살균을 제거합니다.
- 12웰 배양판을 실온에서 1배 의 웰당 0.5mL로 처리하여 다음날 사용하기 위해 최소 1시간 또는 하룻밤 동안 처리합니다. 폴리 D-리신의 부피가 문화 영역의 바닥을 완전히 덮기에 충분하도록 보장합니다.
- 사용하기 직전에 배양 판에서 폴리-D-리신을 제거하고 멸균 물에 3배 헹구고, 플레이트 셀에 준비될 때까지 멸균 물에 보관하십시오. 도금 세포 전에 철저한 포부로 액체의 모든 흔적을 제거하십시오.
- 뉴런 성장 미디어 및 FACS 버퍼를 준비합니다. 필터 살균 및 사용까지 4 °C에 저장합니다. 뉴런 성장 미디어는 약 2 wks에 대해 보관할 수 있습니다. FACS 버퍼는 약 4 wks에 대해 보관할 수 있습니다.
2. 배아 해마를 해부
참고: 이 절차는 해마의 수막 및 미세 절제거를 위한 스테레오 현미경의 사용을 필요로 하기 때문에 벤치탑에서 수행될 수 있습니다. 잠재적인 오염을 최소화하기 위해 엄격한 무균 기술을 준수하십시오.
- 18일CO2 챔버에서 배아의 날에 임신한 C57BL/6J 암컷 마우스를 안락사시한다.
- 복부 피부와 모피를 70% EtOH로 뿌린 다음, 조직 집게로 피부를 꼬집어 수술 가위로 작은 절개를 합니다. 궁수와 자궁을 노출하도록 회중을 절개합니다.
- 표준 패턴 집게로 자궁을 잡고, 캐비티에서 들어 올리고, 미세 한 가위로 심술통에 대한 연결을 잘라. 배아를 가진 자궁을 얼음 위에 놓는 100mm 멸균 플라스틱 배양 접시로 옮습니다.
- 미세 한 가위와 미세 한 집게를 사용 하 여, 조심스럽게 자궁을 잘라 배아 주머니를 제거 배아를 방출. 배아를 얼음 위에 올려놓은 dPBS를 함유한 새로운 100mm 멸균 플라스틱 배양 접시로 배아를 옮기.
- 미세 가위를 사용하여 참수 배아 새끼를 참수하고 얼음에 배치 된 최대 절전 모드 - E 매체를 포함하는 새로운 100mm 멸균 플라스틱 배양 접시로 머리를 옮긴다.
- 뇌를 제거하려면 한 손에 미세 한 개의 집게로 머리를 잡습니다. 다른 한편으로는 구부러진 Dumont #7 집게를 사용하여 두개골 바닥에 집게 의 끝을 삽입하고 뼈를 꼬집어 뇌를 관통하지 않고 중간라인을 따라 앞쪽으로 움직이는 피부를 덮습니다.
- 구부러진 집게를 사용하여 피부와 두개골을 분리하여 뇌를 드러냅니다. 노출된 후각 전구에서 소뇌로 뇌 아래 구부러진 집게를 쓸어내고 두개골에서 뇌를 들어 올립니다. 얼음 위에 놓인 최대 절전 모드-E 배지를 함유한 새로운 100mm 멸균 플라스틱 배양 접시에 뇌를 옮긴다. 각 뇌에 대해 반복합니다.
참고: 실험별 목적으로 분리될 필요가 없는 한 모든 뇌는 단일 문화 접시에서 수집될 수 있습니다. - 스테레오 해부 현미경에서, 한 번에 하나의 뇌와 멸균 Dumont #5 집게의 두 쌍으로 작업, 후각 전구를 꼬집어 수막을 당겨. 수막의 철저한 제거는 다른 세포에 의한 배양 오염을 피하고 추가 해부를 허용하기 위해 필요합니다.
- 수막이 제대로 제거되면 피질의 우수한 측면이 측면으로 열리면 해마가 노출됩니다. Dumont #5 집게를 사용하여 부착 된 피질에서 해마를 꼬집고 격리 된 해마를 얼음 위에 최대 절전 모드 - E 배지 5 mL이 들어있는 멸균 15 mL 원추형 튜브로 조심스럽게 이송하십시오.
- 각 배아 마우스 새끼에 대한 두 뇌 반구에 대한 해부를 반복하고 실험 특정 목적을 위해 별도로 필요하지 않는 한 모든 해마를 단일 15 mL 원판 튜브로 결합하십시오.
- 피질 뉴런을 배양하기 위해 피질은 피질과 분리되어 해마 뉴런과 동일하게 처리될 수 있다.
참고: 이 시점에서 프로토콜이 일시 중지될 수 있습니다. B27로 보충된 최대 절전 모드에서 뇌 또는 해마를 저장합니다(2%) 최대 4°C에서 최대 1개월 동안 연장지연이 실행 가능한 세포의 수를 손상시킬 수 있다.
- 피질 뉴런을 배양하기 위해 피질은 피질과 분리되어 해마 뉴런과 동일하게 처리될 수 있다.
3. 해마 뉴런을 해리하고 배양
참고: 모든 절차는 생물 안전 캐비닛으로 지정된 조직 배양에서 멸균 조건하에서 수행되어야 합니다.
- 해마 해리를 위해 배아당 0.5mL의 파아플 해리 용액을 준비한다. 필요한 해리 솔루션의 양은 해부되는 배아 뇌의 수에 따라 달라집니다.
참고: 피질 뉴런 배양을 위해 배아당 1.0mL의 파팡 용액을 준비하십시오.- 최대 절전 모드 E 배지의 1mL당 20 μL의 파판 서스펜션을 약 3분 동안 소용돌이로 녹입니다.
- 파파인이 용해된 후 용액의 1mL당 1 μL의 DΜL을 추가합니다. DNase 후 용액을 소용돌이하지 마십시오 나는이 효소를 비활성화 할 수 있기 때문에 추가되었습니다.
- 심해 조직(Step 2.10)을 함유한 원심분리기 15mL 원문관(Step 2.10)에서 1, 000 x g에서 5분 동안. 상체를 제거하고 파파인 솔루션을 추가합니다. 여러 번 반전하여 조직을 다시 중단합니다. 37°C에서 30분 동안 배양하고, 10분마다 조직을 되돌려 보도록 되돌린다.
- 피질 뉴런을 배양하는 경우 모든 코르티체를 새로운 100mm 멸균 배양 접시에 옮기고, 조심스럽게 접시에서 미디어를 흡인하고, 미세 한 가위 또는 면도날로 조직을 다진다. 배양 접시에 파팡 용액을 추가하고 멸균 전달 파이펫을 사용하여 15mL 원상 관에 파팡 용액을 사용하여 피질 조직을 이송합니다. 조직 과 효소 용액을 37 °C에서 30 분 동안 배양하여 10 분마다 교반합니다.
- 30분 동안 3개의 불을 닦은 유리 파스퇴르 파이펫(1개 완전 개방, 1반개방, 1쿼터 오픈)을 준비합니다.
- 30분 배양 후, 10분 동안 소화된 뇌 조직을 함유한 15mL 원심형 튜브를 10분 동안 125xg에 원심분리합니다. 효소 용액을 제거하고 신선한 최대 절전 모드 E 배지의 동일한 볼륨으로 대체합니다.
- 완전히 열린 파스퇴르 파이펫을 사용하여 조직을 10배 세리하게 합니다. 조직이 2 분 동안 정착한 다음 상체 세포 현탁액을 멸균 50 mL 원문 튜브로 옮기게하십시오. 조직에 다시 최대 절전 모드 E 배지의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 반 오픈 파스퇴르 파이펫을 사용하여 조직을 10배 세리로 세리라세이트합니다. 조직이 2 분 동안 정착한 다음, 상체 세포 현탁액을 이전 단계와 동일한 50 mL 원문 튜브로 전송하게하십시오. 조직에 다시 최대 절전 모드 E 배지의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 쿼터 오픈 파스퇴르 파이펫을 사용하여 조직을 10배 세리로 세리라세이트합니다. 조직이 2 분 동안 정착한 다음, 상체 세포 현탁액을 이전 단계와 동일한 50 mL 원식으로 다시 전달하십시오. 해리되지 않은 나머지 조직을 폐기하십시오.
- 원심분리기는 셀 서스펜션으로부터 상신을 포함하는 50mL 원문관을 5분 동안 125 x g에서 분리한다. 아직 완료되지 않은 경우 폴리 D-lysine 코팅 플레이트를 멸균물로 세척하고 원심 분리 중에 철저한 포부로 액체의 모든 흔적을 제거하십시오.
- 원심 분리 후, 상체를 폐기하고 뉴런 성장 미디어의 5 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 트라이판 블루와 혈전계를 사용하여 라이브 셀을 계산합니다.
- 피질 뉴런을 배양하는 경우, 덜 조밀 한 세포와 더 정확한 계산을 위한 신경 성장 매체의 적어도 10 mL를 추가합니다.
- ml 당 5 x 105 실행 가능한 세포의 최종 도금 밀도에 대한 뉴런 성장 매체와 세포를 희석하고 12 웰 플레이트의 각 우물에 희석 된 세포 현탁액 1 mL을 추가합니다. 5% CO2로37°C에서 뉴런을 유지한다.
참고: 전형적으로, 1배배마우스 뇌, 즉 2해마피에서 해마는 약 1 x 106개의 실행 가능한 세포를 산출한다. 이 숫자는 실험 계획 목적으로만 제공되며 각 배양에 대한 셀 을 계산하기 위한 대체로 간주되어서는 안됩니다. - 각 우물, 즉 0.5 mL에서 미디어 볼륨의 절반을 제거하고 배양 세포를 방해하지 않도록 우물 의 측면에 동일한 양의 신선한 매체를 추가하여 문화 다음 날 성장 매체를 변경합니다. 문화의 수명을 위해 매주 두 번 반 미디어 변경 완료.
4. 유동 세포측정에 의한 MHCI 발현 평가
- 인터페론 베타(IFNβ) 또는 뉴런 성장 미디어에서 희석제의 동등한 양을 희석하여 치료를 준비한다. 미디어 변화는 반부체 변화가 될 것이기 때문에, 2배 농축 IFNβ로 치료 매체를 준비한다. 즉, IFNβ의 100 U/mL로 12웰 플레이트의 3개의 웰을 치료하기 위해, 200 U/mL IFNβ 또는 동일한 부피의 IFNβ 희석제를 사용하여 1.5mL를 준비하여 미디어 처리 제어를 위해 희석제를 준비한다.
- 뉴런의 각 우물에서 0.5 mL을 제거하고 각각의 우물에 IFNβ의 유무에 관계없이 뉴런 성장 미디어의 0.5 mL을 추가합니다. 실험 조건 및 신호 최적화에 따라 정상 성장 조건(37°C, 5%CO2)에서6-72h에 대한 배양한다.
- 치료 시간 다음, 모든 문화 매체를 제거 하 고 부드럽게 보충 부족 감기 신경 물질 에서 한 번 세척 (B27, L-글루타민, 펜-스트렙).
- Fc 블록의 1 μg/mL을 포함하는 비 보충 된 감기 신경 물질 의 0.5 mL과 형광 공인 항 MHCI 항체의 1 μg /mL을 각각 잘 추가하십시오. 4°C에서 45분 동안 빛으로부터 보호된 인큐베이션.
- 항체 함유 매체를 제거하고 차가운 dPBS에서 한 번 조심스럽게 세척하십시오. 각 우물에 0.5mL 실온 효소가 없는 세포 소염 버퍼를 추가하고 세포를 제거하기 위해 동요합니다. 반전 된 조직 배양 현미경을 사용하여 해리에 대한 시계.
- 세포가 배양 접시에서 분리되면 각 우물에 0.5 mL의 FACS 버퍼를 추가하고, 세포를 세리로 하여 덩어리를 분산시키고, 각 웰의 총 부피를 개별 1.7 mL 마이크로 센트리슈에 튜브로 옮깁니다.
- 원심 분리기 1, 000 x g에서 5 분 동안. 상체를 제거하고, FACS 버퍼의 100 μL에서 셀 펠릿을 재연하고, 각 튜브의 총 부피를 96개의 U-하텀 플레이트의 개별 우물로 이송한다.
- 각 웰에 고정 시약 100 μL을 추가합니다. 세포가 응집하지 않도록 여러 번 삼중하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.
- 5분 동안 500 x g의 원심분리기. 상체를 제거하고 FACS 버퍼의 200 μl에서 다시 중단합니다.
- 5분 동안 500 x g의 원심분리기. 미신을 제거하고 각 우물에 형광-컨쥬게이드 항-NeuN 항체(1:100 희석)를 함유한 퍼메아빌화 시약의 100μL에서 재차질한다. 잘 섞은 다음 20 분 동안 흔들면서 빛으로부터 보호 된 실온에서 배양하십시오.
- 인큐베이션 후 원심분리기는 500 x g에서 5분 동안. 상체를 제거하고 FACS 버퍼의 100 μL에서 다시 중단합니다. 2x를 반복합니다.
- 최종 세척 후, FACS 버퍼에서 희석된 파라포름알데히드의 100 μL에서 세포를 재중단한다. 세포가 뭉치지 않도록 잘 섞습니다. 흐름 사이토미터에서 읽을 준비가 될 때까지 빛으로부터 보호되는 4°C에 보관하십시오. 1주일 이내에 가능한 한 빨리 샘플을 읽으십시오.
5. 데이터 정량화 및 평가
- 각 형광염에 대한 보상 제어를 측정하고 스펙트럼 중복을 수정합니다. 이상적인 보상 컨트롤에는 얼룩이 없는 배양 된 뉴런이 포함되며, 안티 MHCI만으로 염색되며 안티 NeuN만으로 염색됩니다.
- 가능하면 각 샘플(최소 10,000개)에 대해 100,000개의 이벤트를 기록하고 FCS 파일로 저장합니다.
- 데이터를 분석하려면 적절한 분석 소프트웨어를 사용하여 그림 1A-C에 설명된 대로 순차적인 게이트를 설정하여 NeuN 양성 뉴런을 선택합니다.
- SSC-A(로그) 대 FSC-A(선형)를 플롯합니다. 분석에서 세포 이물질을 제거하기 위해 세포 인구 (P1)에 게이트를 그립니다.
- P1 셀룰러 모집단 내에서 FSC-H(선형) 대 FSC-A(선형)를 플롯합니다. 단일 세포 인구에 게이트를 그립니다.
- 단일 셀 모집단 내에서 SSC-A(로그) 대 NeuN(로그)을 플롯합니다. 비염색형 또는 MHCI 전용 스테인드 셀을 사용하여 NeuN 양성 집단에 대한 게이트를 가이드로 그립니다.
- y축에서 모드로 정규화된 셀룰러 이벤트로 MHCI 형광의 히스토그램을 플롯합니다. 스테인드 또는 NeuN 전용 스테인드 뉴런을 가이드로 사용하여 수평 게이트를 그려 MHCI에 대해 양성 신경을 정량화합니다.
- 통계 평가 및 그래픽 도면을 위한 NeuN 양성 인구에 MHCI에 대한 MHCI에 대한 양수 세포뿐만 아니라 중간 형광 강도(MFI)를 수출한다.
Representative Results
여기에 제시된 절차를 사용하여, 해마 조직은 배아 의 날에 태아 마우스 새끼에서 해부되었다 18. 조직은 효소 및 기계적 방법을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 해리된 다음 폴리 D-lysine로 사전 처리된 12개의 웰 플레이트에서 배양되었습니다. 시험관내 7일 후, 세포는 72h에 대해서만 IFNβ 또는 매체의 100U/mL로 처리되어 MHCI의 발현을 자극하였다. 뉴런은 MHCI를 위해 시에 염색된 후 효소적으로 단일 세포 현탁액으로 해리되었다. 뉴런은 고정되고 투과화되었고, 그 후 뉴런 핵 마커 NeuN을 위해 세포내 염색되었습니다. 샘플은 흐름 세포측정에 의해 평가되었고 데이터는 관련 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 뉴런은 셀룰러 파편과 이중을 배제하기 위해 총 이벤트의 순차적 게이팅을 통해확인되었다(그림 1A, B). 뉴런은 NeuN양성(도 1C)에의해 결정적으로 확인되었다. NeuN+ 세포는 x 축상에 y축 및 MHCI 형광에 모드로 정규화된 세포의 수를 사용하여 히스토그램상에 세포를 플로팅하여 MHCI 양성성을 위해 추가로 분석하였다. 긍정적이고 음수 피크가 갈라진 지점에서 MHCI+ 게이트가 그려졌습니다(그림1D). 이로부터, MHCI 염색에 대한 퍼센트 뉴런 양성(도 1E)및 중간 형광 강도 (MFI; 도 1F) 계산되었습니다. 결과는 IFNβ 처리가 MFI에 의해 표시된 것과 같이 MHCI의 세포외 염색을 위한 양성 신경의 백분율을 현저하게 강화했다는 것을 보여줍니다. 통계 분석 및 그래픽 표현은 시판되고 있는 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.
그림 1: 대표적인 게이팅 전략 및 MHCI 정량화.
1차 해마 뉴런은 IFNβ 또는 미디어의 100 U/mL로 처리되었다. 72h 후, 뉴런은 태평양 블루-컨쥬게이트 MHCI(1 μg/mL H2-Kb)로세포외 염색된 다음, 세포내 에 PE-컨쥬게이드 NeuN(1:100 희석)으로 표시하였다. 세포형광은 유동 세포측정에 의해 평가되었고, 데이터를 분석했다. (A)총 이벤트는 SSC-A(로그) 대 FSC-A(선형) 및 셀(P1)으로 플롯되어 이물질을 배제하였다. (B)P1 집단 내에서, 세포는 단일 세포 집단을 게이트하기 위해 FSC-H(선형) 대 FSC-A(linear)로 플롯되었다. (C)단일 세포 집단 내에서, 세포는 SSC-A(로그) 대 NeuN-PE(log)를 플롯하였다. NeuN+ 세포는 뉴런을 식별하기 위해 문이 있었습니다. (D)뉴런 집단 내에서, 세포는 x축에 MHCI-PacBlu를 가진 히스토그램에 플롯되었고, 세포 수는 y축에 모드로 정규화되었다. 수평 게이트는 MHCI 염색에 대한 긍정적 인 뉴런의 백분율을 정량화하기 위해 그려졌다. (E)미디어 전용 및 IFNβ 처리 뉴런에서 NeuN+ 세포의 퍼센트 MHCI+ 정량화. (F)중형암농도(MFI)의 정량화는 미디어(블랙) 및 IFNβ 처리(red) 뉴런의NeuN+ 세포상에 관한 MHCI의 정량화. 통계적 유의성은 짝을 이루지 않은 t 테스트로 계산되었다. **, P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 뉴런 성장 미디어 (50 ml) | |||
| 시약 | 최종 농도 | 재고 농도 | 50ml용 |
| B27 보충제 | 2% | 100% | 1.0 ml |
| L-글루타민 | 2 mM | 200 mM | 0.5 ml |
| 페니실린-연쇄절제술 | 100 U/ml | 10,000 U/ml | 0.5 ml |
| 신경 물질 | 48.0 ml | ||
| FACS 버퍼 (500ml) | |||
| 시약 | 최종 농도 | 재고 농도 | 500 ml용 |
| 태아 소 세럼 | 2% | 100% | 10 ml |
| EDTA | 1 mM | 500 mM | 1 ml |
| dPBS | 489 ml | ||
| 파팡 해리 솔루션 | |||
| 시약 | 최종 농도 | 재고 농도 | 1 ml용 |
| 파팡 서스펜션 | U/ml 20개 | 1000 U/ml | 0.020 ml |
| DNase I | 2.5 U/ml | 2500 U/ml | 0.001 ml |
| 최대 절전 모드-E | 1.0 ml | ||
| 참고: 필요한 파팡 해리 솔루션의 양은 해부되는 배아 뇌의 수에 따라 달라집니다. 해마 뉴런을 위해 뇌당 0.5 ml 또는 피질 뉴런을 위해 뇌당 1.0 ml를 준비하십시오. | |||
| 참고: 최대 절전 모드에서 파판 서스펜션을 약 3분 동안 피질하여 해리 솔루션을 준비하십시오. 파통증이 철저히 용해된 후 DNase I를 추가합니다. DNase I를 소용돌이하지 마십시오. | |||
표 1: 미디어 및 솔루션.
Discussion
이 프로토콜은 배아 의 날에 태아 마우스 새끼에서 1 차 해마 뉴런의 해부와 문화를 설명 합니다 18. 설치류에서 배양 된 기본 뉴런의 사용은 현대 신경 생물학22에서개발 된 가장 기본적인 방법론 중 하나입니다. 불멸의 세포주가 뉴런의 특정 측면을 모델링할 수 있지만, 종양 유래 세포로서의 성질, 정의된 축축을 개발하지 못함, 그리고 지속적인 세포 분열은 생체 내 미토세포 뉴런의 성질을 충실하게 재구성하는지 의문을제기한다. 1 차적인 뉴런에 대한 또 다른 대안은 인간 유도 만능 줄기 세포 (HiPSCs)의 사용입니다. HiPSC를 사용하기위한 기술, 특히 환자 파생 된 기술은 최근24년 동안 급속히 발전했습니다. 그러나, 세포주 간 가변성, 기능성 성숙도 부족, 후성유전학프로파일(25)의차이를 포함하여 HiPSC와 협력하는 데는 여전히 한계가 있다. 1 차설치 뉴런의 환원주의 모형으로 일하는 것도 한계가 있더라도, 배양한 뉴런은 생체내에서 뉴런의 미토틱 후 특성을 유지합니다. 또한, 마우스에 사용할 수 있는 광대한 분자 생물학 도구 및 유전자 변형은 많은 응용 분야에 대한 HiPSCs를 통해 1 차적인 뉴런의 사용을 선호하며, 마우스 연구는 실험적인 유전 시스템을 잃지 않고 생체 내 유기체에서 더 복잡한 것으로 쉽게 번역될 수 있다. 이러한 이유로, 많은 연구원은 주요 측면을 확인 하기 위해 기본 설치류 뉴런을 사용, 하지 않을 경우 대량, 그들의 연구의.
특정 분석의 경우, 뉴런은 뇌 전 생체로부터의 격리를 직접 분석할 수있다. 이것은 특정 실험 조건에 복종할 수 있거나 다중 세포 모형의 상호 작용에 의존할 수 있는 성인 마우스를 관련시키는 실험을 위해 특히 바람직합니다; 그러나 수행할 수 있는 분석 유형을 제한하는 몇 가지 문제가 있습니다. 뉴런이 독특하게 상호 연결되고 myelin26에의해 ensheathed이기 때문에 성인 마우스의 두뇌에서 뉴런의 단일 세포 현탁액을 준비하는 것은 기술적으로 도전적입니다. 조직 삼화의 비 효소 방법은 조직을 해리하고 세포 사멸을 일으키는 데 비효율적이며 효소 제제는 종종 세포 표면항원(27)을갈라둡니다. 더욱이, myelin은 배아 마우스에서 크게 결석하는 동안, 그것은 성인 두뇌의 대략 20%를 포함하고, 실행 가능한 세포 격리를 손상하고 흐르는 세포측정 분석28을방해할 수 있습니다. 개발 된 기술의 대부분은 궁극적으로 자신의 사이토솔의 뉴런을 제거하고 주로 핵29로구성된 작고 둥근 세포 체를 둡니다. 이것은 몇몇 분석을 위해 허용하더라도, 이것은 세포질 또는 세포외 단백질 발현을 정량화하기 위한 적합하지 않습니다. 더욱이, 감소주의 세포 배양 시스템은 생체 내 시스템에서 자주 가능한 것보다 짧은 시간 척도에 특정 기계론적 질문을 테스트할 수 있게 한다.
또한 본 프로토콜에 기재된 것은 IFNβ와 약리학적으로 MHCI 발현을 자극하는 방법, 및 유동 세포측정에 의한 세포외 MHCI 발현의 정량화이다. IFNβ에 의한 자극은 다른 실험 조건을 테스트하기 위한 유용한 양성 대조군이지만, IFNγ 및 카이닉산은 또한 뉴런9,30에서MHCI 발현을 자극할 수 있으며, 테트로도독신은 MHCI 발현(14)을 감소시키는 것으로 주목할 수 있다. MHCI 발현을 검출하기 위한 이전 방법은 시상 혼성화 및 면역히스토케미칼 분석에 의존하여14,15,20,31에의존한다. mRNA 기반 의 소사, 시투 혼성화 및 qRT-PCR와 같은, 현면 국소화, 세포 유형 특이성 및 유전자 전사의 수준을 결정할 수 있지만, 이러한 연구는 플라즈마 막에 단백질 번역 또는 전송을 평가할 수 없다. 면역 조직화학 및 서양 얼룩 분석은 단백질 발현 및 잠재적으로 세포 국소화의 차이를 결정할 수 있지만 정확하게 정량화하기 어려울 수 있습니다. 더욱이, 많은 MHCI 항체는 복합체의 삼차 구조를 인식하고, 형성 변화에 매우 민감하다. 따라서 투과성 또는 탈약 조건은 MHCI 면역 반응활성32의손실을 초래한다. 여기에 제시된 방법은 MHCI를 위한 시투 면역스테인링에서 사용하며, 이는 그 다음에 고착 및 투과화 방법에 따라 본체에 의해 단백질을 인식할 수 있게 한다.
약간의 수정으로, 여기에 설명된 방법은 다른 신경 인구를 배양하거나 관심있는 다른 세포 외 단백질의 발현을 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜에 주목되는 것은 피질 뉴런을 배양하기 위하여 할 수 있는 쉬운 수정입니다, 그러나 여기에서 기술된 방법은 또한 striatal 뉴런 과 같은 그밖 신경 인구를 배양하기 위하여 이용될 수 있습니다(33). 더욱이, 이 프로토콜은 MHCI 와 NeuN의 면역 스테인링을 지정하지만, 다른 세포 마커는 유사한 방식으로 식별 될 수있다. 일반적으로 세포외 마커는 MHCI처럼 치료될 수 있으며 세포내 마커는 NeuN처럼 치료될 수 있다. 그러나, 세포 해리 단계 도중, 축축한 돌출이 소마에서 절단된다는 것을 주의해야 합니다. 여기에 정의된 게이팅 전략은 세포 이물질을 차단하고 뉴런 핵 마커 NeuN에 초점을 맞추고 있기 때문에 축산 프로젝션에서 독점적으로 발현되는 단백질은 검출되지 않을 수 있습니다.
최근까지, 뉴런은 세포 독성 CD8+ T 세포9를참여하기 위해 손상, 감염 또는 체외 사이토카인 자극에 대한 응답으로만 MHCI를 발현하는 것으로 생각되었다. 새로운 연구는 개발 중 시 냅 스 연결을 조절에 MHCI의 또 다른 기능을 해명했다 13. 여기서 설명된 프로토콜은 IFNβ를 사용하여 야생형 배양 뉴런에서 MHCI 발현을 자극하지만, 유사한 방법은 특정 가설을 시험하기 위해 다양한 세포 자극 또는 유전자 변형과 함께 사용될 수 있다. 이 방법은 연구원이 MHCI 발현을 통제하는 분자 기계장치를 조사할 수 있게 해주며, 이는 이 두 가지 세포 기능에 대한 MHCI의 이분적 역할에 대한 이해를 향상시킬 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIA R00 AG053412 (KEF)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Laboratory Supplies |
| 100 mm sterile culture dish | Fisher | FB012924 | Tissue Culture Supplies |
| 15 ml Centrifuge Tubes | Genesee | 21-103 | Laboratory Supplies |
| 50 ml centrifuge tube | Genesee | 21-108 | Laboratory Supplies |
| 500 mM EDTA | Invitrogen | AM9260G | FACS Buffer Reagent |
| 70% Ethanol | Fisher | BP82031Gal | Tissue Culture Supplies |
| 96 well U-bottom plate | Genesee | 25-221 | Flow Cytometry Supplies |
| B27 | Gibco | 17504044 | Neuron Culture Reagent |
| Borate Buffer | Thermo Scientific | 28341 | Tissue Culture Supplies |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13 678 20C | Laboratory Supplies |
| Cell Dissociation Buffer | Gibco | 13 151 014 | Flow Cytometry Supplies |
| DNase I | Thermo | 90083 | Dissociation Solution Reagent |
| dPBS | Gibco | 14190-235 | Tissue Culture Supplies |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dissection Tool |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | Dissection Tool |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Tissue Culture Supplies |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Dissection Tool |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | Dissection Tool |
| Fix and Perm Cell Permeabilization Kit | Invitrogen | GAS003 | Flow Cytometry Supplies |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Neuron Culture Reagent |
| Hibernate-E Medium | Gibco | A1247601 | Neuron Culture Reagent |
| Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher | 181254 | Tissue Culture Supplies |
| Interferon Beta | PBL Assay Science | 12405-1 | Flow Cytometry Supplies |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 | MilliporeSigma | FCMAB317PE | Flow Cytometry Antibody |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | Neuron Culture Reagent |
| Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody | BioLegend | 116513 | Flow Cytometry Antibody |
| Papain Solution | Worthington | LS003126 | Dissociation Solution Reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Fixative |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Neuron Culture Reagent |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | Neuron Culture Reagent |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | Dissection Tool |
| Stereo dissection microscope | Swift | M29TZ-SM99CL-BTW1 | Dissection Tool |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91401-10 | Dissection Tool |
| Transfer Pipets | Corning | 357575 | Laboratory Supplies |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 101319 | Flow Cytometry Antibody |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-100ML | Tissue Culture Supplies |
References
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