Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å dyrke primære hippocampale nevroner fra embryonal musehjerne. Uttrykket av stor histokompatibilitet kompleks klasse I på den ekstracellulære overflaten av dyrkede nevroner blir deretter vurdert ved strømningscytometrisk analyse.
Abstract
Økende bevis støtter hypotesen om at nevro-immuninteraksjoner påvirker nervesystemets funksjon i både homeostatiske og patologiske forhold. En godt studert funksjon av større histokompatibilitetskompleks klasse I (MHCI) er presentasjonen av celleavledede peptider til det adaptive immunsystemet, spesielt som respons på infeksjon. Mer nylig har det vist seg at uttrykket av MHCI-molekyler på nevroner kan modulere aktivitetsavhengige endringer i synaptisk tilkobling under normal utvikling og nevrologiske lidelser. Betydningen av disse funksjonene for hjernehelsen støtter behovet for en sensitiv analyse som lett oppdager MHCI-uttrykk på nevroner. Her beskriver vi en metode for primærkultur av murine hippocampal nevroner og deretter vurdering av MHCI-uttrykk ved strømningscytometrisk analyse. Murine hippocampus er mikrodissektert fra prenatal musevalper på den embryonale dagen 18. Vev dissosieres til en enkeltcellet suspensjon ved hjelp av enzymatiske og mekaniske teknikker, deretter dyrket i et serumfritt medium som begrenser veksten av ikke-nevronale celler. Etter 7 dager in vitro stimuleres MHCI-uttrykket ved å behandle dyrkede celler farmakologisk med betainterferon. MHCI-molekyler er merket in situ med et fluorescerende merket antistoff, da blir celler ikke-enzymatisk dissosiert til en enkelt celle suspensjon. For å bekrefte nevronidentiteten er cellene festet med paraformaldehyd, permeabilisert og merket med et fluorescerende merket antistoff som gjenkjenner nevronalt nukleært antigen NeuN. MHCI-uttrykk kvantifiseres deretter på nevroner ved strømningscytometrisk analyse. Nevronkulturer kan lett manipuleres av enten genetiske modifikasjoner eller farmakologiske intervensjoner for å teste spesifikke hypoteser. Med små modifikasjoner kan disse metodene brukes til å dyrke andre nevronpopulasjoner eller for å vurdere uttrykk for andre proteiner av interesse.
Introduction
Sentralnervesystemet (CNS) ble en gang antatt å være blottet for immunovervåking, referert til som "immunprivilegert1." Det er nå klart at dette privilegiet ikke tilsvarer det absolutte fraværet av immunkomponenter, men snarere en spesialisert regulering som fungerer for å begrense skaden forbundet med immunopathology1. Faktisk er kommunikasjon mellom CNS og immunsystemet en pågående samtale som er nødvendig for sunn hjerneutvikling og respons på infeksjoner2,3.
Store histokompatibilitetskompleksklasse I (MHCI) molekyler er polygene og polymorfiske transmembrane proteiner som er mest kjent for sin funksjon i å presentere antigene peptider til CD8+ T-celler under infeksjon4. Klassiske MHCI-komplekser består av en transmembran α-kjede og en ekstracellulær lyskjede, kalt β2-mikroglobulin. Den α-kjeden inneholder et polymorfisk spor som binder et antigent peptid for presentasjon5. Riktig uttrykk for MHCI på den ekstracellulære membranen krever koordinert virkning av molekylære anstander ved endoplasmic retikulum for å sikre riktig folding av α-kjeden og β2-mikroglobulin sammen med lasting av en høy affinitet peptid ligand5. Først når MHCI-komplekser er montert, eksporteres de fra endoplasmic retikulum til plasmamembranen6. Ved engasjement av cognate T celle reseptor med peptid-lastet MHCI kompleks, CD8+ T celler mediate celle drap ved å frigjøre lytiske granulater som inneholder perforin og granzymer eller ved å indusere apoptose gjennom bindende Fas reseptor på målcellemembranen7. I tillegg produserer CD8+ T-celler cytokiner, som gammainterferon (IFNγ) og tumornekrosefaktor alfa (TNFα), som kan aktivere antivirale mekanismer i infiserte celler uten cytopatiske effekter8,9. For mange nevrotrope virus er CD8+ T-celler nødvendige for å fjerne infeksjonen fra CNS10,11,12.
Det ble tidligere antatt at nevroner uttrykker MHCI bare under forhold med skade, virusinfeksjon eller med in vitro cytokinstimulering. Nylig har forskning identifisert en rolle for nevronal uttrykk for MHCI i synaptisk ombygging og plastisitet13,14. Selv om de presise mekanismene som ligger til grunn for synapsereguleringen ikke er godt forstått, indikerer data at MHCI-uttrykksnivå er regulert av synaptisk aktivitet15,16. En hypotese hevder at nevroner uttrykker parret immunoglobulin-lignende reseptor B (PirB) presynaptisk, som binder MHCI transynaptisk13,17. Denne interaksjonen starter en signalkaskade av PirB som motsetter seg veier som er involvert i synaptisk ombygging, og dermed forsterker og stabiliserer den synaptiske forbindelsen17,18,19. I fravær av nevronaktivitet reduseres MHCI-uttrykket14, og tapet av MHCI resulterer i defekt synapse eliminering og feilorganiserte synaptiske kretser20,21.
Analysen beskrevet her, som ble tilpasset fra Chevalier et al.9, bruker strømningscytometrisk analyse for å kvantitativt vurdere ekstracellulært proteinuttrykk av MHCI på primære kulturer av murine hippocampal nevroner. Denne protokollen illustrerer de første teknikkene for mikrodissecting hippocampal vev fra embryonale musevalper. Den beskriver deretter prosesser for enzymatisk og mekanisk dissosiasjon av vev i en enkelt celle suspensjon og metoder for å opprettholde kulturene in vitro. Fordi de ikke deler seg, når de først er i kultur, må nevroner være belagt i en tallerken og tetthet som passer for deres eksperimentelle endepunkt. Deretter skisserer den trinn for å indusere MHCI-uttrykk med betainterferon (IFNβ), immunolabeling for MHCI og nevronal nukleimarkør NeuN, og analysere celler ved strømningscytometri. Til slutt beskriver den prosedyrer for å vurdere strømningscytometridataene for å identifisere MHCI-positive nevroner og kvantifisere nivået på MHCI-uttrykket. Også nevnt i denne protokollen er små justeringer som kan gjøres for å kultur kortikale nevroner i tillegg til eller i stedet for hippocampal nevroner. Denne protokollen kan enkelt modifiseres for å teste spesifikke hypoteser ved hjelp av genetiske variasjoner eller farmakologiske behandlinger.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med anbefalingene i Veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health og i henhold til de internasjonale veiledende prinsippene for biomedisinsk forskning som involverer dyr. Protokollen ble godkjent av University of North Carolina ved Charlotte Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #19-020).
1. Forberedelse til kultur
MERK: Disse prosedyrene bør gjøres under sterile forhold i et vevskultur-utpekt biosikkerhetsskap. Se tabell 1 for medier og løsninger.
- Steriliser alle disseksjonsverktøy ved å autoklavere i selvforseglingssteriliseringsposer.
- Forbered arbeidsbestander av poly-D-lysin for behandling av 12-brønns kulturretter.
- Løs opp poly-D-lysin i 1x boratbuffer til en konsentrasjon på 100 μg/ml (10x konsentrert). Oppbevar ca. 1 ml aliquots ved -20 °C til det er nødvendig.
- Fortynn 10x konsentrert poly-D-lysin i dPBS til 10 μg/ml (1x) og filtrer steriliser.
- Behandle 12-brønns kulturplater med 0,5 ml per brønn på 1x poly-D-lysin ved romtemperatur i minst 1 time eller over natten for bruk neste dag. Sørg for at volumet av poly-D-lysin er nok til å dekke bunnen av kulturområdet fullt ut.
- Rett før bruk, fjern poly-D-lysin fra kulturplaten, skyll 3x i sterilt vann, og hold i sterilt vann til du er klar til å plateceller. Fjern alle spor av væske med en grundig aspirasjon før plating celler.
- Klargjør Neuron Growth Media og FACS buffer. Filtrer steriliser og oppbevar ved 4 °C til bruk. Neuron Growth Media kan holdes i ca 2 wks; FACS-bufferen kan oppbevars i ca. 4 wks.
2. Dissekere embryonal hippocampus
MERK: Denne prosedyren kan utføres på benken, da det krever bruk av et stereomikroskop for fjerning av meninger og mikrodesisseksjon av hippocampus. Hold deg til streng aseptisk teknikk for å minimere potensiell forurensning.
- Euthanize en tidsinnstilt gravid C57BL/6J kvinnelig mus på embryonal dag 18 i et CO2-kammer.
- Spray bukhuden og pelsen med 70% EtOH, klem deretter huden med vevs tang og gjør små snitt med kirurgisk saks. Incise bukhinnen for å eksponere viscera og livmor.
- Ta tak i livmoren med standard mønster tang, løft ut av hulrommet, og kutt forbindelsen til mesometrium med fin saks. Overfør livmor med embryoer til 100 mm steril plastkulturrett plassert på is.
- Bruk fin saks og fine tang, kutt livmoren forsiktig og fjern embryonale sekker for å frigjøre embryoer. Overfør embryoer til en ny 100 mm steril plastkulturrett som inneholder dPBS plassert på is.
- Decapitate embryonale valper ved hjelp av fin saks, og overfør hoder til nye 100 mm sterile plastkulturfat som inneholder Hibernate-E medium plassert på is.
- For å fjerne hjernen, hold hodet med et par fine tang i den ene hånden. Bruk buede Dumont #7 tang i den andre hånden, sett spissen av tangene på bunnen av skallen og klem beinet og overliggende hud beveger seg fremre langs midtlinjen uten å piercing hjernen.
- Ved hjelp av buede tang trekker du fra hverandre huden og skallen for å eksponere hjernen. Feie de buede tangene under hjernen fra den eksponerte olfaktoriske pæren til cerebellum for å løfte hjernen ut av skallen. Overfør hjernen til en ny 100 mm steril plastkulturrett som inneholder Hibernate-E medium plassert på is. Gjenta for hver hjerne.
MERK: Alle hjerner kan samles i en enkelt kulturrett med mindre det er nødvendig for å være atskilt for eksperimentspesifikke formål. - Under et stereo disseksjonsmikroskop, som arbeider med en hjerne om gangen og to par sterile Dumont-#5 tang, klemmer av olfaktoriske pærer og trekker bort meninger. Grundig fjerning av meningene er nødvendig for å unngå kulturforurensning av andre celler og for å tillate videre disseksjon.
- Når meninges er riktig fjernet, åpnes den overlegne siden av cortex lateralt, noe som vil avsløre hippocampus. Bruk Dumont #5 tang, klem hippocampusen bort fra den vedlagte cortexen, og overfør forsiktig isolert hippocampus til et sterilt 15 ml konisk rør som inneholder 5 ml Hibernate-E medium på is.
- Gjenta disseksjonen for begge hjernehalvdeler for hver embryonale musepupp og kombiner alle hippocampi i et enkelt 15 ml konisk rør, med mindre det er nødvendig separat for eksperimentspesifikke formål.
- For å dyrke kortikale nevroner kan cortex skilles fra subcortex og behandles identisk med hippocampal nevroner.
MERK: På dette tidspunktet kan protokollen settes på pause. Oppbevar hjerner eller dissekert hippocampi i Hibernate-E medium supplert med B27 (2%) ved 4 °C i opptil 1 måned, men utvidet forsinkelse kan kompromittere antall levedyktige celler.
- For å dyrke kortikale nevroner kan cortex skilles fra subcortex og behandles identisk med hippocampal nevroner.
3. Dissosierende og kultiverende hippocampal nevroner
MERK: Alle prosedyrer skal utføres under sterile forhold i et vevskultur utpekt biosikkerhetsskap.
- Forbered 0,5 ml papain dissosiasjonsløsning per embryo for hippocampal dissosiasjon. Volumet av dissosiasjonsløsning som trengs vil variere avhengig av antall embryonale hjerner som dissekeres.
MERK: For kortikale nevronkulturer, lag 1,0 ml papainoppløsning per embryo.- Løs opp 20 μL papain suspensjon per 1 ml av Hibernate E-mediet ved å virvelere i ca. 3 min.
- Etter at papain er oppløst, tilsett 1 μL DNase I per 1 ml av løsningen. Ikke virvel løsningen etter DNase jeg har blitt tilsatt, da dette kan deaktivere enzymet.
- Sentrifuge 15 ml konisk rør som inneholder hippocampalvev (trinn 2.10) ved 1.000 x g i 5 min. Fjern supernatanten og tilsett papain-løsning. Resuspend vevet ved å invertere flere ganger. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter, og inverter for å resuspendere vevet hver 10.
- Hvis du dyrker kortikale nevroner, overfør alle kortikaler til en ny 100 mm steril kulturrett, aspirer forsiktig medier fra tallerken og hakkevev med fin saks eller barberblad. Tilsett papainoppløsning i kulturretten og overfør kortikale vev med papainoppløsning til 15 ml konisk rør ved hjelp av en steril overføringspipette. Inkuber vev og enzymoppløsning ved 37 °C i 30 minutter, og omrør hver 10.
- I løpet av 30 min inkubasjon, lag 3 brannpolerte pasteurpipetter: 1 helt åpen, 1 halv åpen og 1 kvart åpen.
- Etter 30 min inkubasjon, sentrifuger 15 ml konisk rør som inneholder fordøyd hjernevev på 125 x g i 10 minutter. Fjern enzymoppløsningen og erstatt med et likt volum ferskt dvalemodus E-medium.
- Bruk helt åpen Pasteur pipette, triturer vevet 10x. La vevet bosette seg i 2 min, og overfør deretter den supernatante cellefjæringen til et sterilt 50 ml konisk rør. Legg til et likt volum dvalemodus E medium tilbake til vevet.
- Ved hjelp av halv åpen Pasteur pipette, triturat vev 10x. La vevet bosette seg i 2 min, og overfør deretter den supernatante cellefjæringen til samme 50 ml koniske rør som i forrige trinn. Legg til et likt volum dvalemodus E medium tilbake til vevet.
- Ved hjelp av kvart åpen Pasteur pipette, triturat vev 10x. La vevet bosette seg i 2 min, og overfør deretter den supernatante cellefjæringen igjen til samme 50 ml koniske som i tidligere trinn. Kast bort gjenværende vev som ikke har gått i oppløsning.
- Sentrifuger det koniske røret på 50 ml som inneholder supernatanten fra cellefjæringen ved 125 x g i 5 minutter. Hvis det ikke allerede er gjort, vask poly-D-lysinbelagte plater med sterilt vann og fjern alle spor av væske ved grundig aspirasjon under sentrifugering.
- Etter sentrifugering, kast den supernatante og resuspend cellepelleten i 5 ml Neuron Growth Media. Tell levende celler ved hjelp av trypan blå og hemocytometer.
- Hvis du dyrker kortikale nevroner, legg til minst 10 ml Neuron Growth Media for mindre tette celler og mer nøyaktig telling.
- Fortynn celler med Neuron Growth Media for en endelig platingtetthet på 5 x 105 levedyktige celler per ml og tilsett 1 ml fortynnet celleoppheng til hver brønn på en 12 brønnplate. Opprettholde nevroner ved 37 °C med 5 % CO2.
MERK: Vanligvis gir hippocampi fra 1 embryonal musehjerne, det vil si 2 hippocampi, omtrent 1 x 106 levedyktige celler. Dette tallet er kun gitt for eksperimenteringsformål og bør ikke betraktes som en erstatning for å telle celler for hver kultur. - Endre vekstmediene dagen etter kultur ved å fjerne halvparten av medievolumet fra hver brønn, det vil si 0,5 ml, og legg til et likt volum ferske medier på siden av brønnen for å unngå å forstyrre de kultiverte cellene. Fullfør halve medieendringer to ganger i uken i kulturens levetid.
4. Vurdering av MHCI-uttrykk ved strømningscytometri
- Forbered behandling ved å fortynne Interferon beta (IFNβ) eller like mye fortynningsmiddel i Neuron Growth Media. Siden medieendring vil være en halvvolumendring, forberede behandlingsmedier med 2x konsentrert IFNβ. Dvs. å behandle 3 brønner av en 12 brønnplate med 100 U/ml IFNβ, forberede 1,5 ml med 200 U/ml IFNβ eller like mye IFNβ-fortynningsmiddel for mediebehandlede kontroller.
- Fjern 0,5 ml fra hver brønn av nevroner og tilsett 0,5 ml Neuron Growth Media med eller uten IFNβ til hver brønn. Inkuber i normale vekstforhold (37 °C, 5 % CO2) i 6–72 timer, avhengig av eksperimentelle forhold og signaloptimalisering.
- Etter behandlingstid, fjern alle kulturmedier og vask forsiktig en gang i kalde nevrobasale medier som mangler kosttilskudd (B27, L-glutamin, Pen-Strep).
- Tilsett 0,5 ml ikke-supplert kaldt Neurobasal-medium som inneholder 1 μg/ml Fc-blokk og 1 μg/ml fluorescerende konjugert anti-MHCI-antistoff til hver brønn. Inkuber ved 4 °C beskyttet mot lys i 45 minutter.
- Fjern antistoffholdige medier og vask forsiktig en gang i kald dPBS. Tilsett 0,5 ml romtemperatur enzymfri celledissosiasjonsbuffer til hver brønn og rør opp for å løsne celler. Se etter dissosiasjon ved hjelp av invertert vev kultur mikroskop.
- Når cellene er løsrevet fra kulturretten, tilsett 0,5 ml FACS-buffer til hver brønn, trituratceller for å spre klumper, og overfør det totale volumet av hver brønn til individuelle 1,7 ml mikrosentrifugerør.
- Sentrifuge ved 1000 x g i 5 min. Fjern supernatanten, resuspend cellepellet i 100 μL FACS buffer, og overfør totalt volum av hvert rør til individuelle brønner av en 96 brønn U-bunnplate.
- Tilsett 100 μL fikseringsreagens til hver brønn. Trianturer flere ganger for å unngå celler som klumper seg og inkuberer i 15 minutter ved romtemperatur beskyttet mot lys.
- Sentrifuge ved 500 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend i 200 μl AV FACS-bufferen.
- Sentrifuge ved 500 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend i 100 μL permeabiliseringsreagens som inneholder fluorescerende konjugert anti-NeuN antistoff (1:100 fortynning) til hver brønn. Bland godt, og inkuber deretter ved romtemperatur beskyttet mot lys med gynging i 20 minutter.
- Etter inkubasjon, sentrifuge ved 500 x g i 5 min. Fjern supernatanten og resuspend i 100 μL FACS-buffer. Gjenta 2x.
- Etter den endelige vasken, resuspend celler i 100 μL av 2% paraformaldehyd fortynnet i FACS buffer. Bland godt for å forhindre at celler klumper seg. Oppbevars ved 4 °C beskyttet mot lys til det er klart til å leses på et strømningscytometer. Les prøver så snart som mulig, innen 1 uke.
5. Kvantifisere og evaluere data
- Mål kompensasjonskontrollene for hvert fluorescerende fargestoff og korriger eventuelle spektrale overlappinger. Ideelle kompensasjonskontroller inkluderer dyrkede nevroner som er unstained, farget med bare anti-MHCI, og farget med bare anti-NeuN.
- Hvis det er mulig, kan du registrere 100 000 hendelser for hvert utvalg (minst 10 000) og lagre som FCS-filer.
- Hvis du vil analysere data ved hjelp av riktig analyseprogramvare, konfigurerer du sekvensielle porter, som vist i figur 1A-C for å velge for NeuN-positive nevroner.
- Tegn inn SSC-A (logg) vs FSC-A (lineær). Tegn en port på den cellulære populasjonen (P1) for å eliminere cellulært rusk fra analysen.
- Innenfor P1 cellulær populasjon, plott FSC-H (lineær) vs FSC-A (lineær). Tegn en port på enkeltcellepopulasjonen.
- I populasjonen med én celle tegner du inn SSC-A (logg) vs NeuN (logg). Tegn en port på NeuN-positiv populasjon ved hjelp av uoppdagede eller MHCI-bare fargede celler som en guide.
- Plott et histogram av MHCI fluorescens med cellulære hendelser normalisert til modus på y-akse. Bruk unstained eller NeuN-bare fargede nevroner som guide, tegn en horisontal port for å kvantifisere prosentandelen nevroner som er positive for MHCI.
- Eksporter prosentcellene som er positive for MHCI, samt median fluorescensintensitet (MFI) for MHCI på den NeuN-positive populasjonen for statistisk evaluering og grafisk tegning.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, ble hippocampal vev dissekert fra prenatal musevalper på den embryonale dagen 18. Vevet ble dissosiert til en enkeltcellet suspensjon ved hjelp av enzymatiske og mekaniske metoder, deretter dyrket i 12 brønnplater som ble forbehandlet med poly-D-lysin. Etter 7 dager in vitro ble celler behandlet med 100 U / ml IFNβ eller media bare i 72 timer, noe som stimulerte uttrykket av MHCI. Nevroner ble farget in situ for MHCI før de ikke-enzymatisk ble dissosiert til en enkelt celle suspensjon. Nevroner ble fikset og permeabilisert, deretter farget intracellulært for nevronkjernemarkør NeuN. Prøver ble vurdert ved strømningscytometri og data ble analysert ved hjelp av tilhørende programvare. Nevroner ble identifisert gjennom sekvensiell gating av de totale hendelsene for å utelukke cellulært rusk og dobler (Figur 1A, B). Nevroner ble definitivt identifisert av NeuN-positivitet (Figur 1C). NeuN+ celler ble videre analysert for MHCI-positivitet ved å plotte celler på et histogram med antall celler normalisert til modusen på y-aksen og MHCI fluorescens på x-aksen. En MHCI+ gate ble trukket på det punktet hvor positive og negative topper divergerte (Figur 1D). Fra dette er prosentandelen nevroner positive for MHCI-farging (figur 1E) og median fluorescensintensitet (MFI; Figur 1F) ble beregnet. Resultatene viser at IFNβ-behandlingen betydelig oppregulerte prosentandelen nevroner som var positive for ekstracellulær farging av MHCI, samt uttrykksnivået, som angitt av MFI. Statistisk analyse og grafisk representasjon ble gjort ved hjelp av kommersielt tilgjengelig statistisk programvare.
Figur 1: Representativ gatingstrategi og MHCI-kvantifisering.
Primære hippocampale nevroner ble behandlet med 100 U/ml IFNβ eller bare media. Etter 72 timer ble nevroner farget ekstracellulært med Pacific Blue-konjugert MHCI (1 μg/ml H2-Kb), deretter intracellulært merket med PE-konjugert NeuN (1:100 fortynning). Cellulær fluorescens ble vurdert ved strømningscytometri, og data ble analysert. (A) Totalt antall hendelser ble tegnet inn som SSC-A (logg) vs FSC-A (lineær), og celler (P1) ble inngjerdet for å utelate rusk. (B) I P1-populasjonen ble celler tegnet inn som FSC-H (lineær) vs FSC-A (lineær) for å gate den enkelte cellepopulasjonen. (C) I enkeltcellepopulasjonen ble celler tegnet inn SSC-A (logg) vs NeuN-PE (logg). NeuN+ celler ble inngjerdet for å identifisere nevroner. (D) I nevronpopulasjonen ble celler tegnet inn på et histogram med MHCI-PacBlu på x-aksen og cellenumre normalisert til modus på y-aksen. En horisontal port ble trukket for å kvantifisere prosentandelen av nevroner som var positive for MHCI-farging. (E) Kvantifisering av prosent MHCI+ av NeuN+ celler bare i media og IFNβ-behandlede nevroner. (F) Kvantifisering av median fluorescensintensitet (MFI) av MHCI på NeuN+ celler i medier (svart) og IFNβ-behandlede (røde) nevroner. Statistisk signifikans ble beregnet ved ubetalt t-test. **, P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Neuron vekstmedier (50 ml) | |||
| Reagent | Endelig konsentrasjon | Lagerkonsentrasjon | For 50 ml |
| B27 tillegg | 2% | 100% | 1,0 ml |
| L-glutamin | 2 mM | 200 mM | 0,5 ml |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/ml | 10 000 U/ml | 0,5 ml |
| Nevrobasale medier | 48,0 ml | ||
| FACS-buffer (500 ml) | |||
| Reagent | Endelig konsentrasjon | Lagerkonsentrasjon | For 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | 2% | 100% | 10 ml |
| Edta | 1 mM | 500 mM | 1 ml |
| dPBS | 489 ml | ||
| Papain dissosiasjonsløsning | |||
| Reagent | Endelig konsentrasjon | Lagerkonsentrasjon | For 1 ml |
| Papain suspensjon | 20 U/ml | 1000 U/ml | 0,020 ml |
| DNase I | 2,5 U/ml | 2500 U/ml | 0,001 ml |
| Dvalemodus-E | 1,0 ml | ||
| Merk: Volumet av Papain Dissociation Solution som trengs vil variere avhengig av antall embryonale hjerner som dissekeres. Forbered 0,5 ml per hjerne for hippocampale nevroner eller 1,0 ml per hjerne for kortikale nevroner. | |||
| Merk: Forbered dissosiasjonsløsning ved å virvelge papain-suspensjon i Hibernate-E i ca. 3 minutter. Etter at papain er grundig oppløst, legg til DNase I. Ikke virvel DNase I. | |||
Tabell 1: Medier og løsninger.
Discussion
Denne protokollen beskriver disseksjonen og kulturen til primære hippocampale nevroner fra prenatale musevalper på embryonal dag 18. Bruken av primære nevroner dyrket fra gnagere er en av de mest grunnleggende metodene utviklet i moderne nevrobiologi22. Selv om udødelige cellelinjer kan modellere visse aspekter av nevroner, øker deres natur som tumoravledede celler, unnlatelse av å utvikle definerte axoner og fortsatt celledeling tvil om de trofast recapitulate egenskaper til post-mitotic nevroner in vivo23. Et annet alternativ til primære nevroner er bruk av menneskeskapte pluripotente stamceller (HiPSC). Teknologien for bruk av HiPSCer, spesielt de som er pasientavledede, har utviklet seg raskt de siste årene24. Det er imidlertid fortsatt begrensninger for å arbeide med HiPSCer, inkludert variasjon mellom cellelinjer, mangel på funksjonell modenhet og forskjeller i epigenetiske profiler25. Selv om det også er begrensninger for å jobbe med reduksjonsmodellen av primære gnagernevroner, beholder dyrkede nevroner den post-mitotiske naturen til nevroner in vivo. Også de ekspansive molekylærbiologiske verktøyene og genetiske modifikasjonene som er tilgjengelige for mus, favoriserer bruken av primære nevroner over HiPSCs for mange applikasjoner, og musestudier kan enkelt oversettes til den mer komplekse in vivo-organismen uten å miste det eksperimentelle genetiske systemet. Av disse grunnene bruker mange forskere primære gnagernevroner for å verifisere viktige aspekter, om ikke hoveddelen, av forskningen deres.
For visse analyser kan nevroner analyseres direkte etter isolasjon fra hjerne ex vivo. Dette er spesielt ønskelig for eksperimenter som involverer voksne mus som kan bli utsatt for spesifikke eksperimentelle forhold eller som kan avhenge av interaksjoner mellom flere celletyper; Det er imidlertid flere problemstillinger som begrenser hvilken type analyser som kan gjøres. Det er teknisk utfordrende å forberede en enkelt celle suspensjon av nevroner fra hjernen til voksne mus fordi nevroner er unikt sammenkoblet og omsluttet av myelin26. Ikke-enzymatiske metoder for vevstrianturasjon er ineffektive for å dissosiere vevet og forårsake celledød, mens enzymatiske preparater ofte cleave celleoverflateantigener27. Videre, mens myelin i stor grad er fraværende fra embryonale mus, består den av ca 20% av den voksne hjernen, og kan svekke levedyktig celleisolasjon og hindre strømningscytometrianalyse28. Mange av teknikkene som er utviklet, stripper til slutt nevroner av cytosolen og forlater små, avrundede cellelegemer som hovedsakelig består av kjerner29. Selv om dette er akseptabelt for noen analyser, er dette ikke hensiktsmessig for kvantifisering av cytoplasmatisk eller ekstracellulært proteinuttrykk. Videre tillater det reduksjonistiske cellekultursystemet å teste spesifikke mekanistiske spørsmål på kortere tidsskala enn det som ofte er mulig med et in vivo-system.
Også beskrevet i denne protokollen er metoder for å stimulere MHCI-uttrykk farmakologisk med IFNβ, og kvantifisering av ekstracellulært MHCI-uttrykk ved strømningscytometri. Stimulering ved IFNβ er en nyttig positiv kontroll for testing av andre eksperimentelle forhold, men det kan bemerkes at IFNγ og kainsyre også kan stimulere MHCI-uttrykk hos nevroner9,30, mens tetrodotoxin reduserer MHCI-uttrykk14. Tidligere metoder for å oppdage MHCI-uttrykk baserte seg på in situ hybridisering og immunhiistokjemisk analyse14,15,20,31. Mens mRNA-baserte analyser, som in situ hybridisering og qRT-PCR, kan bestemme den romlige lokaliseringen, celletypespesifikkiteten og nivåene av gentranskripsjon, kan ikke disse analysene vurdere proteinoversettelse eller transport til plasmamembranen. Immunhiistokjemisk og vestlig blotanalyse kan bestemme forskjeller i proteinuttrykk og potensielt cellulær lokalisering, men kan være vanskelig å kvantifisere nøyaktig. Videre gjenkjenner mange MHCI-antistoffer kompleksets tertiære struktur, og er svært følsomme for konformasjonsendringer. Dermed permeabilisering eller denaturering forhold resulterer i tap av MHCI immunoreaktivitet32. Metoden som presenteres her bruker in situ immunostaining for MHCI, noe som gjør det mulig å gjenkjenne proteinet ved antistoffet i sin opprinnelige konformasjon, etterfulgt av fikserings- og permeabiliseringsmetoder.
Med små modifikasjoner kan metodene beskrevet her brukes til å dyrke andre nevronpopulasjoner eller for å vurdere uttrykk for andre ekstracellulære proteiner av interesse. Notert i denne protokollen er enkle modifikasjoner som kan gjøres for å kultur kortikale nevroner, men metodene beskrevet her kan også brukes til å dyrke andre nevronale populasjoner, for eksempel striatal nevroner33. Videre, selv om denne protokollen spesifiserer immunisering av MHCI og NeuN, kan andre cellulære markører identifiseres på en lignende måte. Generelt kan ekstracellulære markører behandles som MHCI, og intracellulære markører kan behandles som NeuN. Det skal imidlertid bemerkes at under det cellulære dissosiasjonstrinnet blir axonale projeksjoner kuttet fra soma. Fordi gating strategien definert her skjermer ut cellulære rusk og fokuserer på nevronale nuklei markør NeuN, proteiner som uttrykkes utelukkende i axonal projeksjoner kan ikke oppdages.
Inntil nylig ble nevroner antatt å uttrykke MHCI bare som svar på skade, infeksjon eller in vitro cytokinstimulering for å engasjere cytotoksisk CD8+ T-celler9. Ny forskning har belyst en annen funksjon av MHCI i regulering av synaptiske forbindelser under utvikling13. Protokollen beskrevet her bruker IFNβ for å stimulere MHCI-uttrykk i wildtype dyrkede nevroner, men lignende metoder kan brukes med en rekke cellulære stimuli eller genetiske modifikasjoner for å teste spesifikke hypoteser. Denne metoden vil gjøre det mulig for forskere å undersøke de molekylære mekanismene som regulerer MHCI-uttrykket, noe som vil forbedre forståelsen av MHCI's dikotome rolle på disse to forskjellige cellulære funksjonene.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIA R00 AG053412 (KEF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Laboratory Supplies |
| 100 mm sterile culture dish | Fisher | FB012924 | Tissue Culture Supplies |
| 15 ml Centrifuge Tubes | Genesee | 21-103 | Laboratory Supplies |
| 50 ml centrifuge tube | Genesee | 21-108 | Laboratory Supplies |
| 500 mM EDTA | Invitrogen | AM9260G | FACS Buffer Reagent |
| 70% Ethanol | Fisher | BP82031Gal | Tissue Culture Supplies |
| 96 well U-bottom plate | Genesee | 25-221 | Flow Cytometry Supplies |
| B27 | Gibco | 17504044 | Neuron Culture Reagent |
| Borate Buffer | Thermo Scientific | 28341 | Tissue Culture Supplies |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13 678 20C | Laboratory Supplies |
| Cell Dissociation Buffer | Gibco | 13 151 014 | Flow Cytometry Supplies |
| DNase I | Thermo | 90083 | Dissociation Solution Reagent |
| dPBS | Gibco | 14190-235 | Tissue Culture Supplies |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dissection Tool |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | Dissection Tool |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Tissue Culture Supplies |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Dissection Tool |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | Dissection Tool |
| Fix and Perm Cell Permeabilization Kit | Invitrogen | GAS003 | Flow Cytometry Supplies |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Neuron Culture Reagent |
| Hibernate-E Medium | Gibco | A1247601 | Neuron Culture Reagent |
| Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher | 181254 | Tissue Culture Supplies |
| Interferon Beta | PBL Assay Science | 12405-1 | Flow Cytometry Supplies |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 | MilliporeSigma | FCMAB317PE | Flow Cytometry Antibody |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | Neuron Culture Reagent |
| Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody | BioLegend | 116513 | Flow Cytometry Antibody |
| Papain Solution | Worthington | LS003126 | Dissociation Solution Reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Fixative |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Neuron Culture Reagent |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | Neuron Culture Reagent |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | Dissection Tool |
| Stereo dissection microscope | Swift | M29TZ-SM99CL-BTW1 | Dissection Tool |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91401-10 | Dissection Tool |
| Transfer Pipets | Corning | 357575 | Laboratory Supplies |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 101319 | Flow Cytometry Antibody |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-100ML | Tissue Culture Supplies |
References
- Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. What is immune privilege (not). Trends in Immunology. 28 (1), 12-18 (2007).
- Morimoto, K., Nakajima, K. Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System. Frontiers in Neuroscience. 13, 916 (2019).
- Klein, R. S., et al. Neuroinflammation During RNA Viral Infections. Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).
- Janeway, C. A. The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation. Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).
- Peaper, D. R., Cresswell, P. Regulation of MHC class I assembly and peptide binding. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).
- Donaldson, J. G., Williams, D. B. Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules. Traffic. 10 (12), Copenhagen, Denmark. 1745-1752 (2009).
- Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. T cell-mediated cytotoxicity. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. , (2001).
- Guidotti, L. G., Chisari, F. V. Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response. Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).
- Chevalier, G., et al. Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection. PLoS Pathogens. 7 (11), 1002393 (2011).
- Shrestha, B., Diamond, M. S. Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection. Journal of Virology. 78 (15), 8312-8321 (2004).
- Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells. Virology. 449, 235-243 (2014).
- Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection. Journal of Virology. 77 (4), 2775-2778 (2003).
- Shatz, C. J. MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity. Neuron. 64 (1), 40-45 (2009).
- Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity. Neuron. 21 (3), 505-520 (1998).
- Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (16), 6828-6833 (2007).
- Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16999-17004 (2010).
- Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex. Science. 313 (5794), New York, N.Y. 1795-1800 (2006).
- Atwal, J. K., et al. PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration. Science. 322 (5903), New York, N.Y. 967-970 (2008).
- Takai, T. Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition. Immunology. 115 (4), 433-440 (2005).
- Lee, H., et al. Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db. Nature. 509 (7499), 195-200 (2014).
- Ribic, A., et al. Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey. Behavioral and Brain Functions. 7, 1 (2011).
- Sahu, M. P., Nikkilä, O., Lågas, S., Kolehmainen, S., Castrén, E. Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex. Neuronal Signaling. 3 (2), (2019).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
- Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (4), 165431 (2020).
- Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease. Cells, Tissues, Organs. 205 (5-6), 331-349 (2018).
- Ho, H., et al. A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159 (2018).
- Panchision, D. M., et al. Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Snaidero, N., Simons, M.
- Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 356-367 (2017).
- Lv, D., et al. Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling. PLoS One. 10 (8), 0135223 (2015).
- Barco, A., et al. Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture. Neuron. 48 (1), 123-137 (2005).
- Glynn, M. W., et al. MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections. Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons. Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).
