Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor het cultiveren van primaire hippocampale neuronen uit embryonale muishersenen. De expressie van grote histocompatibiliteitscomplex klasse I op het extracellulaire oppervlak van gekweekte neuronen wordt vervolgens beoordeeld door flowcytometrische analyse.
Abstract
Toenemend bewijs ondersteunt de hypothese dat neuro-immuuninteracties de werking van het zenuwstelsel beïnvloeden bij zowel homeostatische als pathologische aandoeningen. Een goed bestudeerde functie van grote histocompatibiliteitscomplex klasse I (MHCI) is de presentatie van cel-afgeleide peptiden aan het adaptieve immuunsysteem, met name als reactie op infectie. Meer recent is aangetoond dat de expressie van MHCI-moleculen op neuronen activiteitsafhankelijke veranderingen in de synaptische connectiviteit kan moduleren tijdens normale ontwikkeling en neurologische aandoeningen. Het belang van deze functies voor de gezondheid van de hersenen ondersteunt de behoefte aan een gevoelige test die gemakkelijk MHCI-expressie op neuronen detecteert. Hier beschrijven we een methode voor primaire cultuur van murine hippocampale neuronen en vervolgens beoordeling van MHCI-expressie door flow cytometrische analyse. Murine hippocampus wordt microdissected van prenatale muis pups op de embryonale dag 18. Weefsel wordt gedissocieerd in een enkele celsuspensie met behulp van enzymatische en mechanische technieken en vervolgens gekweekt in een serumvrije media die de groei van niet-neuronale cellen beperkt. Na 7 dagen in vitro wordt MHCI expressie gestimuleerd door gekweekte cellen farmacologisch te behandelen met bèta interferon. MHCI-moleculen worden in situ gelabeld met een fluorescerend gelabeld antilichaam, waarna cellen niet-enzymatisch worden gedissocieerd tot een enkele celsuspensie. Om de neuronale identiteit te bevestigen, worden cellen gefixeerd met paraformaldehyde, gepermeabiliseerd en gelabeld met een fluorescerend gelabeld antilichaam dat neuronaal nucleair antigeen NeuN herkent. MHCI-expressie wordt vervolgens gekwantificeerd op neuronen door flow cytometrische analyse. Neuronale culturen kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd door genetische modificaties of farmacologische interventies om specifieke hypothesen te testen. Met kleine aanpassingen kunnen deze methoden worden gebruikt om andere neuronale populaties te gekweekt of om de expressie van andere eiwitten van belang te beoordelen.
Introduction
Het centrale zenuwstelsel (CZS) werd ooit verondersteld te zijn verstoken van immuunbewaking, aangeduid als "immuun geprivilegieerd1." Het is nu duidelijk dat dit voorrecht niet gelijk staat aan de absolute afwezigheid van immuuncomponenten, maar veeleer aan een gespecialiseerde regeling die functioneert om de schade in verband met immunopathologie te beperken1. In feite is communicatie tussen het CZS en het immuunsysteem een voortdurend gesprek dat nodig is voor een gezonde hersenontwikkeling en reactie op infecties2,3.
Belangrijke histocompatibiliteit complexe klasse I (MHCI) moleculen zijn polygene en polymorfe transmembrane eiwitten die het best bekend staan om hun functie bij het presenteren van antigene peptiden aan CD8+ T cellen tijdens infectie4. Klassieke MHCI-complexen bestaan uit een transmembrane α-keten en een extracellulaire lichtketen, β2-microglobuline genoemd. De α-keten bevat een polymorfe groef die een antigeen peptide bindt voor presentatie5. Een goede expressie van MHCI op het extracellulaire membraan vereist gecoördineerde werking van moleculaire chaperonnes in het endoplasmatisch reticulum om een goede vouwen van de α-keten en β2-microglobuline te garanderen, samen met het laden van een peptide ligand met hoge affiniteit5. Pas wanneer MHCI-complexen zijn geassembleerd, worden ze geëxporteerd van het endoplasmatisch reticulum naar het plasmamembraan6. Bij betrokkenheid van de cognate T-celreceptor met het met peptiden geladen MHCI-complex bemiddelen CD8+ T-cellen celdodend door het vrijgeven van lytische korrels die perforine en granzymen bevatten of door apoptose op te wekken door de Fas-receptor op het doelcelmembraan te binden7. Bovendien produceren CD8+ T-cellen cytokinen, zoals gamma-interferon (IFNγ) en tumornecrosefactor alfa (TNFα), die antivirale mechanismen in geïnfecteerde cellen kunnen activeren zonder cytopathische effecten8,9. Voor veel neurotrope virussen zijn CD8+ T-cellen nodig om de infectie uit het CZS10,11,12te verwijderen .
Eerder werd gedacht dat neuronen MHCI alleen uitdrukken onder omstandigheden van schade, virale infectie of met in vitro cytokinestimulatie. Onlangs heeft onderzoek een rol geïdentificeerd voor neuronale expressie van MHCI bij synaptische remodellering en plasticiteit13,14. Hoewel de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan synapsregulering niet goed worden begrepen , geven gegevens aan dat het MHCI-expressieniveau wordt gereguleerd door synaptische activiteit15,16. Een hypothese stelt dat neuronen gepaarde immunoglobuline-achtige receptor B (PirB) presynaptisch uitdrukken, die MHCI transynaptischbindt 13,17. Deze interactie initieert een signaleringscascade van PirB die zich verzet tegen trajecten die betrokken zijn bij synaptische remodellering, waardoor de synaptische verbinding17 , 18,19wordt versterkt en gestabiliseerd . Bij afwezigheid van neuronale activiteit wordt de MHCI-expressie verminderdmet 14, en het verlies van MHCI resulteert in gebrekkige synapsverwijdering en verkeerd georganiseerde synaptische circuits20,21.
De hier beschreven test, die werd aangepast van Chevalier et al.9, maakt gebruik van flow cytometrische analyse om de extracellulaire eiwitexpressie van MHCI kwantitatief te beoordelen op primaire culturen van muriene hippocampale neuronen. Dit protocol illustreert de eerste technieken voor het microdissecteren van hippocampaal weefsel van embryonale muisjongen. Vervolgens worden processen voor enzymatische en mechanische dissociatie van weefsel in één celsuspensie en methoden voor het in vitro onderhouden van de culturen in detailomgegaan. Omdat ze zich niet delen, moeten neuronen, zodra ze in cultuur zijn, worden geplateerd in een schaal en dichtheid die geschikt is voor hun experimentele eindpunt. Vervolgens worden stappen beschreven voor het induceren van MHCI-expressie met bèta-interferon (IFNβ), immunolabeling voor MHCI en neuronale kernmarker NeuN en het analyseren van cellen per flowcytometrie. Ten slotte beschrijft het procedures voor het beoordelen van de flowcytometriegegevens om MHCI-positieve neuronen te identificeren en het niveau van de MHCI-expressie te kwantificeren. Ook opgemerkt in dit protocol zijn kleine aanpassingen die kunnen worden gemaakt om corticale neuronen te culten naast of in plaats van hippocampale neuronen. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om specifieke hypothesen te testen met behulp van genetische variaties of farmacologische behandelingen.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals van de National Institutes of Health en volgens de International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals. Het protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van North Carolina van het Charlotte Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #19-020).
1. Voorbereiding op cultuur
OPMERKING: Deze procedures moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast met weefselkweek. Zie tabel 1 voor media en oplossingen.
- Steriliseer alle dissectiegereedschappen door autoclaving in zelfsluitende sterilisatiezakken.
- Bereid werkvoorraden poly-D-lysine voor de behandeling van 12-well kweekgerechten.
- Los poly-D-lysine op in 1x boraatbuffer tot een concentratie van 100 μg/ml (10x geconcentreerd). Bewaar ongeveer 1 ml aliquots bij -20 °C tot het nodig is.
- Verdun 10x geconcentreerd poly-D-lysine in dPBS tot 10 μg/ml (1x) en steriliseer het filter.
- Behandel 12-put kweekplaten met 0,5 ml per put van 1x poly-D-lysine bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur of 's nachts voor gebruik de volgende dag. Zorg ervoor dat het volume poly-D-lysine voldoende is om de bodem van het kweekgebied volledig te bedekken.
- Verwijder vlak voor het gebruik poly-D-lysine van de kweekplaat, spoel 3x in steriel water en bewaar in steriel water totdat het klaar is om cellen te borderen. Verwijder alle sporen van vloeistof door een grondige aspiratie voorafgaand aan het plateren van cellen.
- Bereid Neuron Growth Media en FACS buffer voor. Filtreer steriliseren en bewaren bij 4 °C tot gebruik. Neuron Growth Media kan worden bewaard voor ongeveer 2 wks; FACS buffer kan ongeveer 4 wks worden bewaard.
2. Embryonale hippocampus ontleden
OPMERKING: Deze procedure kan worden uitgevoerd op de benchtop omdat het gebruik van een stereomicroscoop vereist voor het verwijderen van hersenvliezen en microdissectie van de hippocampus. Houd u aan de strikte aseptische techniek om mogelijke besmetting te minimaliseren.
- Euthanaseer een getijde-zwangere C57BL/6J vrouwelijke muis op embryonale dag 18 in een CO2 kamer.
- Spray de buikhuid en vacht met 70% EtOH, knijp vervolgens de huid met weefseldop en maak een kleine incisie met een chirurgische schaar. Ingesneden het peritoneum om de ingewanden en baarmoeder bloot te stellen.
- Pak de baarmoeder vast met standaard patroon tang, til uit de holte en snijd de verbinding met het mesometrium met een fijne schaar. Breng de baarmoeder met embryo's over naar een steriele plastic kweekschaal van 100 mm die op ijs is geplaatst.
- Snijd met een fijne schaar en fijne tang de baarmoeder voorzichtig door en verwijder de embryonale zakjes om embryo's vrij te geven. Breng embryo's over naar een nieuwe steriele plastic kweekschaal van 100 mm met dPBS die op ijs is geplaatst.
- Onthoofd embryonale pups met een fijne schaar en breng de koppen over naar een nieuwe steriele plastic kweekschaal van 100 mm met hibernate-E-medium dat op ijs is geplaatst.
- Om de hersenen te verwijderen, houdt u het hoofd met een paar fijne tangen in één hand. Met behulp van gebogen Dumont #7 tang in de andere hand, steek de punt van de tang aan de basis van de schedel en knijp het bot en de overlappende huid bewegen vooraan langs de middellijn zonder de hersenen te doorboren.
- Met behulp van gebogen tangen trekken de huid en schedel uit elkaar om de hersenen bloot te stellen. Veeg de gebogen tang onder de hersenen van de blootgestelde olfactorische bol naar het cerebellum om de hersenen uit de schedel te tillen. Breng de hersenen over naar een nieuwe steriele plastic kweekschaal van 100 mm met hibernate-E-medium dat op ijs is geplaatst. Herhaal dit voor elk brein.
OPMERKING: Alle hersenen kunnen worden verzameld in één kweekschaal, tenzij ze gescheiden moeten zijn voor experimentspecifieke doeleinden. - Onder een stereo dissectiemicroscoop, werkend met één brein tegelijk en twee paar steriele Dumont-#5 tang, knijp je reuklampen af en trek je hersenvliezen weg. Grondige verwijdering van de hersenvliezen is noodzakelijk om cultuurverontreiniging door andere cellen te voorkomen en verdere dissectie mogelijk te maken.
- Zodra hersenvliezen goed zijn verwijderd, opent de superieure kant van de cortex lateraal, wat de hippocampus zal blootstellen. Knijp met Dumont #5 tang de hippocampus weg van de aangekoppelde cortex en breng de geïsoleerde hippocampus voorzichtig over naar een steriele conische buis van 15 ml met 5 ml hibernate-E-medium op ijs.
- Herhaal de dissectie voor beide hersenhelften voor elke embryonale muispuppy en combineer alle hippocampi in een enkele conische buis van 15 ml, tenzij afzonderlijk nodig voor experimentspecifieke doeleinden.
- Om corticale neuronen te gekweekt, kan de cortex worden gescheiden van de subcortex en identiek worden verwerkt aan hippocampale neuronen.
OPMERKING: Op dit punt kan het protocol worden onderbroken. Bewaar hersenen of ontleed hippocampi in sluimerstand-E medium aangevuld met B27 (2%) bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand, hoewel langdurige vertraging het aantal levensvatbare cellen in gevaar kan brengen.
- Om corticale neuronen te gekweekt, kan de cortex worden gescheiden van de subcortex en identiek worden verwerkt aan hippocampale neuronen.
3. Dissocieren en cultiveren van hippocampale neuronen
OPMERKING: Alle procedures moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een weefselkweek die is aangewezen als bioveiligheidskast.
- Bereid 0,5 ml pauselijke dissociatieoplossing per embryo voor hippocampale dissociatie. Het volume van de benodigde dissociatieoplossing zal variëren afhankelijk van het aantal embryonale hersenen dat wordt ontleed.
OPMERKING: Bereid voor corticale neuroncultuur 1,0 ml papaïneoplossing per embryo.- Los 20 μL papaïnesuspensie per 1 ml van het Sluimerstand E-medium op door ongeveer 3 minuten te vortexen.
- Nadat papaïne is opgelost, voegt u 1 μL DNase I per 1 ml van de oplossing toe. Draai de oplossing niet na DNase I toegevoegd, omdat dit het enzym kan deactiveren.
- Centrifugeer 15 ml conische buis met hippocampaal weefsel (stap 2.10) op 1,000 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en voeg papaïneoplossing toe. Resuspend het weefsel door meerdere keren om te keren. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C en keer om om het weefsel elke 10 minuten opnieuw te betepenzen.
- Als u corticale neuronen cultivert, breng dan alle cortices over naar een nieuwe steriele kweekschaal van 100 mm, aspireer voorzichtig media van de plaat en gehaktweefsel met een fijne schaar of scheermes. Voeg papaïne-oplossing toe aan de kweekschaal en breng corticale weefsel met papaïneoplossing over naar 15 ml conische buis met behulp van een steriele transferpipet. Incubeer weefsel en enzymoplossing bij 37 °C gedurende 30 minuten, elke 10 minuten roeren.
- Bereid gedurende 30 minuten incubatie 3 vuurgepolijste glazen Pasteur-pipetten voor: 1 volledig open, 1 half open en 1 kwart open.
- Centrifugeer na de incubatie van 30 minuten de conische buis van 15 ml met verteerde hersenweefsels gedurende 10 minuten op 125 x g. Verwijder de enzymoplossing en vervang door een gelijk volume vers Sluimer e-medium.
- Gebruik volledig open Pasteur pipet, triturate het weefsel 10x. Laat het weefsel 2 minuten bezinken en breng vervolgens de supernatante celsuspensie over in een steriele conische buis van 50 ml. Voeg een gelijk volume van Sluimerstand E medium terug aan het weefsel.
- Met behulp van half open Pasteur pipet, triturate weefsel 10x. Laat het weefsel 2 minuten bezinken en breng vervolgens de supernatante celsuspensie over naar dezelfde conische buis van 50 ml als in de vorige stap. Voeg een gelijk volume van Sluimerstand E medium terug aan het weefsel.
- Met behulp van kwart open Pasteur pipet, triturate weefsel 10x. Laat het weefsel 2 minuten bezinken en breng de supernatante celsuspensie vervolgens opnieuw over naar dezelfde 50 ml conische als in eerdere stappen. Gooi het resterende weefsel weg dat niet is gescheiden.
- Centrifugeer de 50 ml conische buis met het supernatant uit de celsuspensie gedurende 5 minuten op 125 x g. Als dit nog niet is gebeurd, wast u met poly-D-lysine bedekte platen met steriel water en verwijdert u alle sporen van vloeistof door grondige aspiratie tijdens centrifugeren.
- Gooi na centrifugeren het supernatant weg en resuspendeer de celkorrel in 5 ml neurongroeimedia. Tel levende cellen met trypan blauw en hemocytometer.
- Als u corticale neuronen cultieert, voeg dan ten minste 10 ml neurongroeimedia toe voor minder dichte cellen en nauwkeuriger tellen.
- Verdun cellen met Neuron Growth Media voor een uiteindelijke platingsdichtheid van 5 x10 5 levensvatbare cellen per ml en voeg 1 ml verdunde celsuspensie toe aan elke put van een plaat van 12 put. Neuronen op 37 °C houden met 5% CO2.
OPMERKING: Meestal leveren de hippocampi uit 1 embryonale muizenhersenen, d.w.z. 2 hippocampi, ongeveer 1 x 106 levensvatbare cellen op. Dit nummer is uitsluitend bedoeld voor experimentplanningsdoeleinden en mag niet worden beschouwd als een vervanging voor het tellen van cellen voor elke cultuur. - Verander de groeimedia de dag na de cultuur door de helft van het volume media uit elke put te verwijderen, d.w.z. 0,5 ml, en voeg een gelijk volume verse media toe aan de zijkant van de put om te voorkomen dat de gekweekte cellen worden verstoord. Voltooi twee keer per week halve mediaveranderingen voor de levensduur van de cultuur.
4. Beoordelen van MHCI expressie door flow cytometrie
- Bereid de behandeling voor door interferon bèta (IFNβ) of een gelijk volume verdunningsmiddel in neurongroeimedia te verdunnen. Aangezien mediaverandering een verandering van het halve volume zal zijn, bereidt u behandelingsmedia voor met 2x geconcentreerd IFNβ. d.w.z. om 3 putten van een 12-putplaat met 100 U/ml IFNβ te behandelen, bereidt u 1,5 ml voor met 200 U/ml IFNβ of een gelijk volume IFNβ-verdunningsmiddel voor mediabehandelde controles.
- Verwijder 0,5 ml uit elke put van neuronen en voeg 0,5 ml neurongroeimedia met of zonder IFNβ toe aan elke put. Incubeer in normale groeiomstandigheden (37 °C, 5% CO2)gedurende 6-72 uur, afhankelijk van experimentele omstandigheden en signaaloptimalisatie.
- Verwijder na de behandeling alle kweekmedia en was ze voorzichtig eenmaal in koude neurobasale media zonder supplementen (B27, L-glutamine, Pen-Strep).
- Voeg 0,5 ml niet-aangevulde koude neurobasale media met 1 μg/ml Fc-blok en 1 μg/ml fluorescerend geconjugeerd anti-MHCI-antilichaam toe aan elke put. Incubeer bij 4 °C beschermd tegen licht gedurende 45 minuten.
- Verwijder antilichaamhoudende media en was ze zorgvuldig eenmaal in koude dPBS. Voeg 0,5 ml enzymvrije celdissociatiebuffer op kamertemperatuur toe aan elke put en roer om cellen los te maken. Let op dissociatie met behulp van omgekeerde weefselkweekmicroscoop.
- Zodra cellen zijn losgemaakt van de kweekschaal, voegt u 0,5 ml FACS-buffer toe aan elke put, trituraatcellen om klonten te verspreiden en brengt u het totale volume van elke put over naar individuele 1,7 ml microcentrifugebuizen.
- Centrifugeer op 1.000 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant, resuspend de celkorrel in 100 μL FACS-buffer en breng het totale volume van elke buis over naar afzonderlijke putten van een U-bodemplaat van 96 well.
- Voeg 100 μL fixatief reagens toe aan elke put. Tritureer meerdere keren om te voorkomen dat cellen klonteren en incuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
- Centrifugeer gedurende 5 min. op 500 x g. Verwijder het supernatant en resuspend in 200 μl FACS-buffer.
- Centrifugeer gedurende 5 min. op 500 x g. Verwijder het supernatant en resuspend in 100 μL permeabilisatiereagens dat fluorescerend geconjugeerd anti-NeuN-antilichaam (1:100 verdunning) in elke put bevat. Meng goed en incubeer vervolgens op kamertemperatuur beschermd tegen licht met schommelen gedurende 20 minuten.
- Na incubatie centrifugeer je gedurende 5 min op 500 x g. Verwijder het supernatant en resuspend in 100 μL FACS buffer. Herhaal 2x.
- Na de laatste wasbeurt resuspend cellen in 100 μL van 2% paraformaldehyde verdund in FACS buffer. Meng goed om te voorkomen dat cellen samenklonteren. Bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht tot het klaar is om af te lezen op een flowcytometer. Lees de monsters zo snel mogelijk, binnen 1 week.
5. Kwantificeren en evalueren van gegevens
- Meet de compensatieregelaars voor elke fluorescerende kleurstof en corrigeer eventuele spectrale overlappingen. Ideale compensatiecontroles omvatten gekweekte neuronen die niet worden aangetast, alleen gekleurd met anti-MHCI en alleen gekleurd met anti-NeuN.
- Noteer indien mogelijk 100.000 gebeurtenissen voor elk monster (ten minste 10.000) en sla op als FCS-bestanden.
- Om gegevens te analyseren, met behulp van de juiste analysesoftware, stelt u sequentiële poorten in, zoals afgebeeld in figuur 1A-C om te selecteren op NeuN-positieve neuronen.
- Plot SSC-A (log) vs FSC-A (lineair). Teken een poort naar de cellulaire populatie (P1) om cellulair puin uit de analyse te verwijderen.
- Binnen de cellulaire P1-populatie, plot FSC-H (lineair) versus FSC-A (lineair). Teken een poort op eencellige populatie.
- Binnen de populatie met één cel plot SSC-A (log) versus NeuN (log). Teken een poort naar neun-positieve populatie met behulp van niet-bevlekte of MHCI-alleen bevlekte cellen als leidraad.
- Plot een histogram van MHCI-fluorescentie met cellulaire gebeurtenissen genormaliseerd naar modus op y-as. Gebruik niet-bevlekte of NeuN-only bevlekte neuronen als leidraad en teken een horizontale poort om het percentage neuronen te kwantificeren dat positief is voor MHCI.
- Exporteer de procentuele cellen positief voor MHCI, evenals de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) voor MHCI op de NeuN-positieve populatie voor statistische evaluatie en grafische tekening.
Representative Results
Met behulp van de hier gepresenteerde procedure werd hippocampaal weefsel ontleed van prenatale muispups op de embryonale dag 18. Het weefsel werd gedissocieerd in een eencellige suspensie met behulp van enzymatische en mechanische methoden, vervolgens gekweekt in 12 putplaten die werden voorbehandeld met poly-D-lysine. Na 7 dagen in vitro werden cellen slechts gedurende 72 uur behandeld met 100 U/ml IFNβ of media, wat de expressie van MHCI stimuleerde. Neuronen werden in situ gekleurd voor MHCI voordat ze niet-enzymatisch werden gedissocieerd tot een suspensie met één cel. Neuronen werden gefixeerd en gepermeabiliseerd, vervolgens intracellulair gekleurd voor neuronale kernen marker NeuN. Monsters werden beoordeeld op flowcytometrie en gegevens werden geanalyseerd met behulp van bijbehorende software. Neuronen werden geïdentificeerd door middel van sequentiële gating van de totale gebeurtenissen om cellulair puin en doubletten uit te sluiten (figuur 1A,B). Neuronen werden definitief geïdentificeerd door NeuN-positiviteit (Figuur 1C). NeuN+ cellen werden verder geanalyseerd op MHCI-positiviteit door cellen op een histogram te plotten met het aantal cellen genormaliseerd naar de modus op de y-as en MHCI fluorescentie op de x-as. Er werdeen MHCI + gate getrokken op het punt waar positieve en negatieve pieken uiteenliepen (Figuur 1D). Hieruit zijn de procenten neuronen positief voor MHCI-kleuring (figuur 1E) en de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI; Figuur 1F) werden berekend. De resultaten tonen aan dat ifnβ behandeling significant upregulated het percentage neuronen positief voor extracellulaire kleuring van MHCI, evenals het niveau van expressie, zoals aangegeven door MFI. Statistische analyse en grafische weergave werden gedaan met behulp van commercieel beschikbare statistische software.
Figuur 1: Representatieve gatingstrategie en MHCI-kwantificering.
Primaire hippocampale neuronen werden behandeld met 100 U/ml IFNβ of media. Na 72 uur werden neuronen extracellulair gekleurd met Pacific Blue-geconjugeerde MHCI (1 μg/ml H2-Kb),vervolgens intracellulair gelabeld met PE-geconjugeerd NeuN (1:100 verdunning). Cellulaire fluorescentie werd beoordeeld door flowcytometrie en gegevens werden geanalyseerd. (A) Totale gebeurtenissen werden uitgezet als SSC-A (log) vs FSC-A (lineair) en cellen (P1) werden gated om puin uit te sluiten. (B) Binnen de P1-populatie werden cellen uitgezet als FSC-H (lineair) versus FSC-A (lineair) om de eencellige populatie te gaten. (C) Binnen de populatie van één cel werden cellen uitgezet SSC-A (log) vs NeuN-PE (log). NeuN+ cellen werden gated om neuronen te identificeren. (D) Binnen de neuronpopulatie werden cellen uitgezet op een histogram met MHCI-PacBlu op de x-as en celnummers genormaliseerd naar modus op de y-as. Een horizontale poort werd getrokken om het percentage neuronen positief voor MHCI-kleuring te kwantificeren. (E) Kwantificering van procent MHCI+ van NeuN+ cellen alleen in media en MET IFNβ behandelde neuronen. (F) Kwantificering van de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) van MHCI op NeuN+ cellen in media (zwart) en MET IFNβ behandelde (rode) neuronen. De statistische significantie werd berekend aan de hand van een niet-gepaarde t-test. **, P < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Neuron Groei Media (50 ml) | |||
| Reagens | Definitieve concentratie | Voorraadconcentratie | Voor 50 ml |
| B27 supplement | 2% | 100% | 1,0 ml |
| L-glutamine | 2 mM | 200 mM | 0,5 ml |
| Penicilline-Streptomycine | 100 U/ml | 10.000 U/ml | 0,5 ml |
| Neurobasale media | 48,0 ml | ||
| FACS buffer (500 ml) | |||
| Reagens | Definitieve concentratie | Voorraadconcentratie | Voor 500 ml |
| Foetale Runderserum | 2% | 100% | 10 ml |
| Edta | 1 mM | 500 mM | 1 ml |
| dPBS | 489 ml | ||
| Papain Dissociatie Oplossing | |||
| Reagens | Definitieve concentratie | Voorraadconcentratie | Voor 1 ml |
| Papaïne suspensie | 20 U/ml | 1000 U/ml | 0,020 ml |
| DNase I | 2,5 U/ml | 2500 U/ml | 0,001 ml |
| Slaapstand-E | 1,0 ml | ||
| Opmerking: Het volume van papaïnedissociatieoplossing dat nodig is, varieert afhankelijk van het aantal embryonale hersenen dat wordt ontleed. Bereid 0,5 ml per brein voor hippocampale neuronen of 1,0 ml per brein voor corticale neuronen. | |||
| Opmerking: Bereid dissociatieoplossing voor door de papaïnesuspensie in de slaapstand-E ongeveer 3 minuten te vortexen. Nadat papaïne grondig is opgelost, voegt u DNase I toe. Draai geen DNase I. | |||
Tabel 1: Media en oplossingen.
Discussion
Dit protocol beschrijft de dissectie en cultuur van primaire hippocampale neuronen van prenatale muispups op embryonale dag 18. Het gebruik van primaire neuronen gekweekt uit knaagdieren is een van de meest fundamentele methodologieën ontwikkeld in de moderne neurobiologie22. Hoewel vereeuwigde cellijnen bepaalde aspecten van neuronen kunnen modelleren, roept hun aard als tumor-afgeleide cellen, het niet ontwikkelen van gedefinieerde axonen en voortdurende celdeling twijfels op of ze de eigenschappen van post-mitotische neuronen getrouw samenvatten in vivo23. Een ander alternatief voor primaire neuronen is het gebruik van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (HiPSC's). De technologie voor het gebruik van HiPSC's, vooral die welke van patiënten zijn afgeleid, is de afgelopen jaren snel vooruitgegaan24. Er zijn echter nog steeds beperkingen aan het werken met HiPSC's, waaronder variabiliteit tussen cellijnen, gebrek aan functionele volwassenheid en verschillen in epigenetische profielen25. Hoewel er ook beperkingen zijn aan het werken met het reductionistische model van primaire knaagdierneuronen, behouden gekweekte neuronen de post-mitotische aard van neuronen in vivo. Ook de uitgebreide moleculaire biologietools en genetische modificaties die beschikbaar zijn voor muizen, begunstigen het gebruik van primaire neuronen boven HiPSC's voor veel toepassingen, en muisstudies kunnen gemakkelijk worden vertaald naar het complexere in vivo organisme zonder het experimentele genetische systeem te verliezen. Om deze redenen gebruiken veel onderzoekers primaire knaagdierneuronen om belangrijke aspecten, zo niet het grootste deel, van hun onderzoek te verifiëren.
Voor bepaalde assays kunnen neuronen direct na isolatie van de hersenen ex vivo worden geanalyseerd. Dit is met name wenselijk voor experimenten met volwassen muizen die aan specifieke experimentele omstandigheden kunnen worden onderworpen of die afhankelijk kunnen zijn van interacties van meerdere celtypen; er zijn echter verschillende kwesties die het type analyses beperken dat kan worden uitgevoerd. Het is technisch uitdagend om een enkele cel suspensie van neuronen uit de hersenen van volwassen muizen voor te bereiden, omdat neuronen uniek met elkaar zijn verbonden en worden versopwarmd door myeline26. Niet-enzymatische methoden voor weefseltrituratie zijn inefficiënt in het dissocieren van het weefsel en veroorzaken celdood, terwijl enzymatische preparaten vaak celoppervlakantigenen27splitsen . Bovendien, terwijl myeline grotendeels afwezig is bij embryonale muizen, omvat het ongeveer 20% van de volwassen hersenen, en kan het de levensvatbare celisolatie aantasten en flowcytometrieanalyse belemmeren28. Veel van de technieken die zijn ontwikkeld, strippen uiteindelijk neuronen van hun cytosol en laten kleine, afgeronde cellichamen achter die voornamelijk bestaan uit kernen29. Hoewel dit voor sommige analyses aanvaardbaar is, is dit niet geschikt voor het kwantificeren van cytoplasmatische of extracellulaire eiwitexpressie. Bovendien maakt het reductionistische celkweeksysteem het mogelijk om specifieke mechanistische vragen te testen op een kortere tijdschaal dan vaak mogelijk is met een in vivo systeem.
Ook beschreven in dit protocol zijn methoden voor het stimuleren van MHCI expressie farmacologisch met IFNβ, en de kwantificering van extracellulaire MHCI expressie door flow cytometrie. Stimulatie door IFNβ is een nuttige positieve controle voor het testen van andere experimentele omstandigheden, maar opgemerkt kan worden dat IFNγ en kainzuur ook de MHCI-expressie in neuronen9,30kunnen stimuleren , terwijl tetrodotoxine de MHCI-expressievermindert 14. Eerdere methoden voor het detecteren van MHCI-expressie waren gebaseerd op in situ hybridisatie en immunohistochemische analyse14,15,20,31. Hoewel mRNA-gebaseerde assays, zoals in situ hybridisatie en qRT-PCR, de spatiotemporale lokalisatie, celtype specificiteit en niveaus van gentranscriptie kunnen bepalen, kunnen deze assays geen eiwitvertaling of transport naar het plasmamembraan beoordelen. Immunohistochemische en westerse vlekanalyse kan verschillen in eiwitexpressie en potentieel cellulaire lokalisatie bepalen, maar kan moeilijk nauwkeurig te kwantificeren zijn. Bovendien herkennen veel MHCI-antilichamen de tertiaire structuur van het complex en zijn ze zeer gevoelig voor conformationele veranderingen. Aldus leiden permeabilisatie of denatureringsomstandigheden tot verlies van MHCI-immunoreactiviteit32. De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van in situ immunostaining voor MHCI, waardoor het eiwit door het antilichaam in zijn oorspronkelijke conformatie kan worden erkend, gevolgd door fixatie- en permeabilisatiemethoden.
Met kleine aanpassingen kunnen de hier beschreven methoden worden gebruikt om andere neuronale populaties te gekweekt of om de expressie van andere extracellulaire eiwitten van belang te beoordelen. Opgemerkt in dit protocol zijn eenvoudige wijzigingen die kunnen worden aangebracht om corticale neuronen te culteren, maar de hier beschreven methoden kunnen ook worden gebruikt om andere neuronale populaties te gekweekt, zoals striatale neuronen33. Bovendien, hoewel dit protocol immunostaining van MHCI en NeuN specificeert, kunnen andere cellulaire markers op een vergelijkbare manier worden geïdentificeerd. Over het algemeen kunnen extracellulaire markers worden behandeld als MHCI en intracellulaire markers kunnen worden behandeld als NeuN. Er moet echter worden opgemerkt dat tijdens de cellulaire dissociatiestap axonale projecties worden gescheiden van de soma. Omdat de hier gedefinieerde gatingstrategie cellulair puin screent en zich richt op neuronale kernenmarker NeuN, kunnen eiwitten die uitsluitend worden uitgedrukt in axonale projecties niet worden gedetecteerd.
Tot voor kort werd gedacht dat neuronen MHCI alleen uitdrukken als reactie op schade, infectie of in vitro cytokinestimulatie om cytotoxische CD8+ T-cellen in te schakelen9. Nieuw onderzoek heeft een andere functie van MHCI bij het reguleren van synaptische verbindingen tijdens ontwikkelingopgehelderd 13. Het hier beschreven protocol gebruikt IFNβ om MHCI-expressie in wildtype gekweekte neuronen te stimuleren, maar vergelijkbare methoden kunnen worden gebruikt met een verscheidenheid aan cellulaire stimuli of genetische modificaties om specifieke hypothesen te testen. Deze methode stelt onderzoekers in staat om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die de MHCI-expressie reguleren, wat het begrip van de dichotome rol van MHCI op deze twee verschillende cellulaire functies zal verbeteren.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIA R00 AG053412 (KEF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Laboratory Supplies |
| 100 mm sterile culture dish | Fisher | FB012924 | Tissue Culture Supplies |
| 15 ml Centrifuge Tubes | Genesee | 21-103 | Laboratory Supplies |
| 50 ml centrifuge tube | Genesee | 21-108 | Laboratory Supplies |
| 500 mM EDTA | Invitrogen | AM9260G | FACS Buffer Reagent |
| 70% Ethanol | Fisher | BP82031Gal | Tissue Culture Supplies |
| 96 well U-bottom plate | Genesee | 25-221 | Flow Cytometry Supplies |
| B27 | Gibco | 17504044 | Neuron Culture Reagent |
| Borate Buffer | Thermo Scientific | 28341 | Tissue Culture Supplies |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13 678 20C | Laboratory Supplies |
| Cell Dissociation Buffer | Gibco | 13 151 014 | Flow Cytometry Supplies |
| DNase I | Thermo | 90083 | Dissociation Solution Reagent |
| dPBS | Gibco | 14190-235 | Tissue Culture Supplies |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dissection Tool |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | Dissection Tool |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Tissue Culture Supplies |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Dissection Tool |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | Dissection Tool |
| Fix and Perm Cell Permeabilization Kit | Invitrogen | GAS003 | Flow Cytometry Supplies |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Neuron Culture Reagent |
| Hibernate-E Medium | Gibco | A1247601 | Neuron Culture Reagent |
| Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher | 181254 | Tissue Culture Supplies |
| Interferon Beta | PBL Assay Science | 12405-1 | Flow Cytometry Supplies |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 | MilliporeSigma | FCMAB317PE | Flow Cytometry Antibody |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | Neuron Culture Reagent |
| Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody | BioLegend | 116513 | Flow Cytometry Antibody |
| Papain Solution | Worthington | LS003126 | Dissociation Solution Reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Fixative |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Neuron Culture Reagent |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | Neuron Culture Reagent |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | Dissection Tool |
| Stereo dissection microscope | Swift | M29TZ-SM99CL-BTW1 | Dissection Tool |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91401-10 | Dissection Tool |
| Transfer Pipets | Corning | 357575 | Laboratory Supplies |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 101319 | Flow Cytometry Antibody |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-100ML | Tissue Culture Supplies |
References
- Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. What is immune privilege (not). Trends in Immunology. 28 (1), 12-18 (2007).
- Morimoto, K., Nakajima, K. Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System. Frontiers in Neuroscience. 13, 916 (2019).
- Klein, R. S., et al. Neuroinflammation During RNA Viral Infections. Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).
- Janeway, C. A. The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation. Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).
- Peaper, D. R., Cresswell, P. Regulation of MHC class I assembly and peptide binding. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).
- Donaldson, J. G., Williams, D. B. Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules. Traffic. 10 (12), Copenhagen, Denmark. 1745-1752 (2009).
- Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. T cell-mediated cytotoxicity. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. , (2001).
- Guidotti, L. G., Chisari, F. V. Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response. Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).
- Chevalier, G., et al. Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection. PLoS Pathogens. 7 (11), 1002393 (2011).
- Shrestha, B., Diamond, M. S. Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection. Journal of Virology. 78 (15), 8312-8321 (2004).
- Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells. Virology. 449, 235-243 (2014).
- Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection. Journal of Virology. 77 (4), 2775-2778 (2003).
- Shatz, C. J. MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity. Neuron. 64 (1), 40-45 (2009).
- Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity. Neuron. 21 (3), 505-520 (1998).
- Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (16), 6828-6833 (2007).
- Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16999-17004 (2010).
- Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex. Science. 313 (5794), New York, N.Y. 1795-1800 (2006).
- Atwal, J. K., et al. PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration. Science. 322 (5903), New York, N.Y. 967-970 (2008).
- Takai, T. Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition. Immunology. 115 (4), 433-440 (2005).
- Lee, H., et al. Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db. Nature. 509 (7499), 195-200 (2014).
- Ribic, A., et al. Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey. Behavioral and Brain Functions. 7, 1 (2011).
- Sahu, M. P., Nikkilä, O., Lågas, S., Kolehmainen, S., Castrén, E. Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex. Neuronal Signaling. 3 (2), (2019).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
- Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (4), 165431 (2020).
- Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease. Cells, Tissues, Organs. 205 (5-6), 331-349 (2018).
- Ho, H., et al. A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159 (2018).
- Panchision, D. M., et al. Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Snaidero, N., Simons, M.
- Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 356-367 (2017).
- Lv, D., et al. Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling. PLoS One. 10 (8), 0135223 (2015).
- Barco, A., et al. Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture. Neuron. 48 (1), 123-137 (2005).
- Glynn, M. W., et al. MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections. Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons. Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).
