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Immunology and Infection

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा प्राथमिक मुरीन हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स पर मेजर हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स कक्षा 1 की अभिव्यक्ति का आकलन करना

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61436
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of North Carolina at Charlotte

Summary

यह प्रोटोकॉल भ्रूणीय माउस मस्तिष्क से प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स को बनाने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की बाहेल सतह पर प्रमुख हिस्टोकंपैटिबिलिटी जटिल वर्ग 1 की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा किया जाता है।

Abstract

बढ़ते सबूत इस परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि न्यूरो-प्रतिरक्षा इंटरैक्शन होमोस्टेटिक और पैथोलॉजिकल दोनों स्थितियों में तंत्रिका तंत्र के कार्य को प्रभावित करता है। प्रमुख हिस्टोकंप्यूटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स क्लास 1 (एमएचसीआई) का एक अच्छी तरह से अध्ययन किया गया कार्य विशेष रूप से संक्रमण के जवाब में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए सेल-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स की प्रस्तुति है। हाल ही में यह दर्शाया गया है कि न्यूरॉन्स पर MHCI अणुओं की अभिव्यक्ति सामान्य विकास और न्यूरोलॉजिक विकारों के दौरान सिनैप्टिक कनेक्टिविटी में गतिविधि पर निर्भर परिवर्तनों को संशोधित कर सकती है। मस्तिष्क स्वास्थ्य के लिए इन कार्यों का महत्व एक संवेदनशील परख की आवश्यकता का समर्थन करता है जो न्यूरॉन्स पर MHCI अभिव्यक्ति का आसानी से पता लगाता है। यहां हम मुरीन हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं और फिर प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा MHCI अभिव्यक्ति का आकलन करते हैं। मुरीन हिप्पोकैम्पस भ्रूणीय दिन 18 में जन्म के पूर्व माउस पिल्ले से microdissected है । ऊतक को एंजाइमेटिक और यांत्रिक तकनीकों का उपयोग करके एकल कोशिका निलंबन में अलग किया जाता है, फिर सीरम-मुक्त मीडिया में सुसंस्कृत किया जाता है जो गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के विकास को सीमित करता है। विट्रो में 7 दिनों के बाद, MHCI अभिव्यक्ति बीटा इंटरफेरॉन के साथ सुसंस्कृत कोशिकाओं के इलाज के द्वारा प्रेरित किया जाता है। MHCI अणुओं को एक फ्लोरोसेंटली टैग किए गए एंटीबॉडी के साथ सीटू में लेबल किया जाता है, फिर कोशिकाओं को एक एकल कोशिका निलंबन में गैर-एंजाइमेटिक रूप से अलग किया जाता है। न्यूरोनल पहचान की पुष्टि करने के लिए, कोशिकाओं को पैराफॉर्मलडिहाइड, परमीबिलाइज्ड के साथ तय किया जाता है, और एक फ्लोरोसेंटली टैग किए गए एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है जो न्यूरोनल न्यूक्लियर एंटीजन न्यून को पहचानता है। एमएचसीआई अभिव्यक्ति तो प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा न्यूरॉन्स पर मात्रा निर्धारित है । न्यूरोनल संस्कृतियों को आसानी से विशिष्ट परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए आनुवंशिक संशोधनों या फार्माकोलॉजिक हस्तक्षेपों से छेड़छाड़ की जा सकती है। मामूली संशोधनों के साथ, इन तरीकों का उपयोग अन्य न्यूरोनल आबादी को संस्कृति या ब्याज के अन्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को एक बार प्रतिरक्षा निगरानी से रहित माना जाता था, जिसे "प्रतिरक्षा विशेषाधिकार प्राप्त1"कहा जाता है। अब यह स्पष्ट है कि यह विशेषाधिकार प्रतिरक्षा घटकों की पूर्ण अनुपस्थिति के बराबर नहीं है, बल्कि, एक विशेष विनियमन जो इम्यूनोपैथोलॉजी1से जुड़े नुकसान को सीमित करने के लिए कार्य करता है। वास्तव में, सीएनएस और प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच संचार एक सतत वार्तालाप है जो स्वस्थ मस्तिष्क के विकास और संक्रमण2,3के प्रति प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है।

प्रमुख हिस्टोकंपनि जटिल वर्ग 1 (एमएचसीआई) अणु पॉलीजेनिक और बहुरूपिक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन हैं जो संक्रमण 4 केदौरानसीडी 8+ टी कोशिकाओं को एंटीजेनिक पेप्टाइड्स पेश करने में अपने कार्य के लिए जाने जाते हैं। शास्त्रीय एमएचसीआई परिसरों में एक ट्रांसमेम्ब्रेन α-चेन और एक एक्सट्रासेलुलर लाइट चेन शामिल है, जिसे 2-माइक्रोग्लोबुलिन कहा जाता है। α-श्रृंखला में एक बहुरूपी नाली होती है जो प्रस्तुति5के लिए एक एंटीजेनिक पेप्टाइड को बांधती है। बाह्य झिल्ली पर MHCI की उचित अभिव्यक्ति के लिए एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम पर आणविक चैपरोन की समन्वित कार्रवाई की आवश्यकता होती है ताकि उच्च एफ़िनिटी पेप्टाइड लिगामेंट5की लोडिंग के साथ-साथ α-श्रृंखला और 2-माइक्रोग्लोबुलिन की उचित तह सुनिश्चित की जा सके। केवल एक बार MHCI परिसरों को इकट्ठा कर रहे हैं, वे एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम से प्लाज्मा झिल्ली6को निर्यात कर रहे हैं । पेप्टाइड-लोडेड एमएचसीआई कॉम्प्लेक्स के साथ कॉग्नेट टी सेल रिसेप्टर की सगाई पर, सीडी 8+ टी कोशिकाएं पेफोरिन और ग्रेन्ज़िम्स युक्त लिटिक ग्रेन्यूल्स को रिहा करके या लक्ष्य कोशिका झिल्ली7पर बाइंडिंग फास रिसेप्टर के माध्यम से एपोप्टोसिस को प्रेरित करके सेल की हत्या में मध्यस्थता करती हैं। इसके अतिरिक्त, सीडी 8+ टी कोशिकाएं साइटोकिन्स का उत्पादन करती हैं, जैसे गामा इंटरफेरॉन (IFNγ) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफएα), जो साइटोपैथिक प्रभाव8,9के बिना संक्रमित कोशिकाओं में एंटीवायरल तंत्र को सक्रिय कर सकते हैं। कई न्यूरोट्रोपिक वायरस के लिए सीएनएस10, 11,12से संक्रमण को साफ करने के लिए सीडी 8+ टी कोशिकाएं आवश्यक हैं।

यह पहले सोचा गया था कि न्यूरॉन्स केवल नुकसान, वायरल संक्रमण, या इन विट्रो साइटोकिन उत्तेजना की स्थिति में MHCI व्यक्त करते हैं । हाल ही में, अनुसंधान ने सिनैप्टिक रीमॉडलिंग और प्लास्टिसिटी13, 14में एमएचसीआई की न्यूरोनल अभिव्यक्ति के लिए एक भूमिका की पहचान की है । यद्यपि सिनैप्स विनियमन में अंतर्निहित सटीक तंत्र अच्छी तरह से समझ में नहीं आते हैं, लेकिन डेटा इंगित करता है कि एमएचसीआई अभिव्यक्ति स्तर को सिनैप्टिक गतिविधि15,16द्वारा विनियमित किया जाता है। एक परिकल्पना यह है कि न्यूरॉन्स ने इम्यूनोग्लोबुलिन जैसे रिसेप्टर बी (पीरबी) को पूर्वनिर्धारणात्मक रूप से जोड़ा, जो MHCI को13,17से बांधता है। यह बातचीत पीरबी द्वारा एक संकेत झरना शुरू करती है जो सिनैप्टिक रीमॉडलिंग में शामिल रास्तों का विरोध करती है, इस प्रकार सिनैप्टिक कनेक्शन17,18,19को मजबूत और स्थिर करती है। न्यूरोनल गतिविधि के अभाव में, एमएचसीआई अभिव्यक्ति14कम हो जाती है, और एमएचसीआई के नुकसान के परिणामस्वरूप दोषपूर्ण सिनैप्स उन्मूलन और गलत संगठित सिनैप्टिक सर्किट20,21 होतेहैं।

यहां वर्णित परख, जिसे शेवेलियर एट अल9से अनुकूलित किया गया था, मुरीन हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की प्राथमिक संस्कृतियों पर MHCI की बाह्य प्रोटीन अभिव्यक्ति का मात्रात्मक रूप से आकलन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग करता है। यह प्रोटोकॉल भ्रूणीय माउस पिल्ले से हिप्पोकैम्पस ऊतक को माइक्रोडिसेक्टिंग करने के लिए प्रारंभिक तकनीकों को दिखाता है। इसके बाद यह ऊतक के एंजाइमेटिक और यांत्रिक वियोजन के लिए प्रक्रियाओं को एकल कोशिका निलंबन और विट्रो में संस्कृतियों को बनाए रखने के तरीकों में विवरण देताहै । क्योंकि वे विभाजित नहीं है, एक बार वे संस्कृति में हैं, न्यूरॉन्स एक डिश और उनके प्रयोगात्मक अंत बिंदु के लिए उपयुक्त घनत्व में चढ़ाया जाना चाहिए । इसके बाद, यह बीटा इंटरफेरॉन (IFNο) के साथ MHCI अभिव्यक्ति को प्रेरित करने, MHCI और न्यूरोनल न्यूक्लिय मार्कर न्यून के लिए इम्यूनोलेबेलिंग और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए कदम रेखांकित करता है । अंत में, यह एमएचसीआई-सकारात्मक न्यूरॉन्स की पहचान करने और MHCI अभिव्यक्ति के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री डेटा का आकलन करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है । इसके अलावा इस प्रोटोकॉल में उल्लेख किया छोटे समायोजन है कि आदेश में या हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के अलावा या इसके बजाय कॉर्टिकल न्यूरॉन्स संस्कृति के लिए किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल को आनुवंशिक विविधताओं या औषधीय उपचारों का उपयोग करके विशिष्ट परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया और जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए अंतरराष्ट्रीय मार्गदर्शक सिद्धांतों के अनुसार जानवरों को शामिल किया गया । प्रोटोकॉल शार्लोट इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (प्रोटोकॉल #19-020) में यूनिवर्सिटी ऑफ नॉर्थ कैरोलिना ने मंजूरी दी थी ।

1. संस्कृति के लिए तैयारी

नोट: इन प्रक्रियाओं को एक ऊतक संस्कृति नामित जैवसेफ्टी कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए । मीडिया और समाधान के लिए तालिका 1 देखें।

  1. सेल्फ सीलिंग नसबंदी बैग में ऑटोक्लेविंग करके सभी विच्छेदन उपकरणों को स्टरलाइज करें।
  2. 12-अच्छी संस्कृति व्यंजनों के इलाज के लिए पॉली-डी-lysine के काम कर रहे स्टॉक तैयार करें।
    1. 1x बोरेट बफर में पॉली-डी-lysine को 100 μg/एमएल (10x केंद्रित) की एकाग्रता में भंग करें। जरूरत होने तक लगभग 1 एमएल एलिकोट्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. डीपीबीएस में 10x केंद्रित पॉली-डी-lysine 10 μg/mL (1x) और फिल्टर स्टरलाइज करने के लिए पतला करें।
    3. अगले दिन का उपयोग करने के लिए कम से कम 1 घंटे या रात भर के लिए कमरे के तापमान पर 1x पॉली-डी-lysine के 0.5 एमएल प्रति अच्छी तरह से 12-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों का इलाज करें। सुनिश्चित करें कि पॉली-डी-lysine की मात्रा पूरी तरह से संस्कृति क्षेत्र के नीचे कवर करने के लिए पर्याप्त है ।
    4. उपयोग से ठीक पहले, संस्कृति प्लेट से पॉली-डी-lysine को हटा दें, बाँझ पानी में 3x कुल्ला करें, और कोशिकाओं को प्लेट करने के लिए तैयार होने तक बाँझ पानी में रखें। चढ़ाना कोशिकाओं से पहले एक पूरी तरह से आकांक्षा द्वारा तरल के सभी निशान निकालें।
  3. न्यूरॉन ग्रोथ मीडिया और FACS बफर तैयार करें। उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टरलाइज और स्टोर करें। न्यूरॉन ग्रोथ मीडिया को लगभग 2 डब्ल्यूकेएस के लिए रखा जा सकता है; FACS बफर लगभग 4 wks के लिए रखा जा सकता है।

2. भ्रूण हिप्पोकैम्पस विच्छेदन

नोट: यह प्रक्रिया बेंचटॉप पर की जा सकती है क्योंकि इसके लिए हिप्पोकैम्पस के मेनिंग्स और माइक्रोडिसेक्शन को हटाने के लिए स्टीरियो माइक्रोस्कोप के उपयोग की आवश्यकता होती है। संभावित संदूषण को कम करने के लिए सख्त एसेप्टिक तकनीक का पालन करें।

  1. एक सीओ2 कक्ष में भ्रूण दिवस 18 पर एक समय पर गर्भवती C57BL/6J महिला माउस इच्छामृत्यु ।
  2. पेट की त्वचा और फर को 70% एटोह के साथ स्प्रे करें, फिर ऊतक संदंश के साथ त्वचा को चुटकी लें और सर्जिकल कैंची के साथ छोटा चीरा दें। आंत और गर्भाशय को बेनकाब करने के लिए पेरिटोनम को चीरना।
  3. मानक पैटर्न संदंश के साथ गर्भाशय को पकड़ें, गुहा से बाहर उठाएं, और ठीक कैंची के साथ मेसोमट्रियम से कनेक्शन काटें। भ्रूण के साथ गर्भाशय को बर्फ पर रखे 100 मिमी बाँझ प्लास्टिक संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें।
  4. ठीक कैंची और ठीक संदंश का उपयोग करना, ध्यान से गर्भाशय में कटौती और भ्रूण को रिहा करने के लिए भ्रूण थैली को हटा दें। एक नया १०० मिमी बाँझ प्लास्टिक संस्कृति बर्फ पर रखा dPBS युक्त पकवान के लिए भ्रूण हस्तांतरण ।
  5. ठीक कैंची का उपयोग कर भ्रूण पिल्ले decapitate, और नए १०० मिमी बाँझ प्लास्टिक संस्कृति हाइबरनेट-ई बर्फ पर रखा माध्यम युक्त पकवान के लिए सिर हस्तांतरण ।
  6. मस्तिष्क को हटाने के लिए, सिर को एक हाथ में एक जोड़ी बारीक संदंश के साथ पकड़ें। दूसरे हाथ में घुमावदार ड्यूमोंट #7 संदंश का उपयोग करना, खोपड़ी के आधार पर संदंश की नोक डालें और मस्तिष्क को छेदने के बिना हड्डी और ओवरलाइंग त्वचा को मिडलाइन के साथ पूर्वकाल में आगे बढ़ाते हुए चुटकी लें।
  7. घुमावदार संदंश का उपयोग करने से मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए त्वचा और खोपड़ी को अलग करते हैं। मस्तिष्क को खोपड़ी से बाहर निकालने के लिए उजागर घ्राण बल्ब से मस्तिष्क के नीचे घुमावदार संदंश को सेरिबैलम तक स्वीप करें। मस्तिष्क को बर्फ पर रखे हाइबरनेट-ई माध्यम से युक्त एक नए 100 मिमी बाँझ प्लास्टिक संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें। प्रत्येक मस्तिष्क के लिए दोहराएं।
    नोट: सभी दिमाग एक ही संस्कृति पकवान में एकत्र किया जा सकता है जब तक प्रयोग विशिष्ट प्रयोजनों के लिए अलग होने की जरूरत है ।
  8. एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक समय में एक मस्तिष्क के साथ काम करना और बाँझ ड्यूमोंट के दो जोड़े #5 संदंश, घ्राण बल्बों को चुटकी और मेनिंग्स को दूर खींचें। अन्य कोशिकाओं द्वारा संस्कृति संदूषण से बचने और आगे विच्छेदन की अनुमति देने के लिए मेनिंग्स को पूरी तरह से हटाना आवश्यक है।
  9. एक बार मेनिंग्स को ठीक से हटा दिया जाता है, कॉर्टेक्स का बेहतर पक्ष बाद में खुलता है, जो हिप्पोकैम्पस का पर्दाफाश करेगा। ड्यूमोंट #5 संदंश का उपयोग करके, हिप्पोकैम्पस को संलग्न कॉर्टेक्स से दूर करें, और सावधानी से अलग हिप्पोकैम्पस को एक बाँझ 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें जिसमें बर्फ पर हाइबरनेट-ई माध्यम के 5 एमएल होते हैं।
  10. प्रत्येक भ्रूण माउस पिल्ला के लिए दोनों मस्तिष्क गोलार्द्धों के लिए विच्छेदन दोहराएं और सभी हिप्पोकैम्पी को एक 15 एमएल शंकुदाता में जोड़ें, जब तक कि प्रयोग विशिष्ट उद्देश्यों के लिए अलग से आवश्यक न हो।
    1. कॉर्टिकल न्यूरॉन्स संस्कृति के लिए, कॉर्टेक्स को उपकॉर्टेक्स से अलग किया जा सकता है और हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के लिए समान रूप से संसाधित किया जा सकता है।
      नोट: इस बिंदु पर, प्रोटोकॉल रुका हुआ हो सकता है। B27 (2%) 1 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर, हालांकि विस्तारित देरी व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या से समझौता कर सकती है।

3. हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स को अलग और तरह से अलग करना

नोट: सभी प्रक्रियाओं को एक ऊतक संस्कृति नामित जैवसेफ्टी कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए।

  1. हिप्पोकैम्पस वियोजन के लिए प्रति भ्रूण 0.5 एमएल पापीन वियोजन समाधान तैयार करें। भ्रूणीय दिमाग की संख्या विच्छेदित होने के आधार पर आवश्यक वियोजन समाधान की मात्रा भिन्न होगी।
    नोट: कॉर्टिकल न्यूरॉन संस्कृति के लिए, प्रति भ्रूण 1.0 एमएल पापीन समाधान तैयार करें।
    1. लगभग 3 मिनट के लिए भंवर द्वारा हाइबरनेट ई माध्यम के 1 एमसीएल प्रति पैपिन निलंबन के 20 माइक्रोन को भंग करें।
    2. पापिन के भंग होने के बाद, समाधान के प्रति 1 मिलीएल DNase I के 1 माइक्रोन जोड़ें। DNase के बाद समाधान भंवर मत करो मैं जोड़ा गया है के रूप में यह एंजाइम निष्क्रिय कर सकते हैं ।
  2. 5 मिनट के लिए 1, 000 x ग्राम पर हिप्पोकैम्पस ऊतक (चरण 2.10) युक्त सेंट्रलाइज 15 एमएल शंकु नली। सुपरनैंट निकालें और पपिन समाधान जोड़ें। कई बार उलटा करके टिश्यू को रिस् पेंड करें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, हर 10 मिनट में ऊतक को फिर से खर्च करने के लिए उलटा।
    1. यदि कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को culturing, एक नया १०० मिमी बाँझ संस्कृति पकवान के लिए सभी cortices हस्तांतरण, ध्यान से थाली से मीडिया aspirate, और ठीक कैंची या उस्तरा ब्लेड के साथ कीमा ऊतक । संस्कृति पकवान के लिए पपिन समाधान जोड़ें और एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करके 15 एमएल शंकु नली के लिए पपिन समाधान के साथ कॉर्टिकल ऊतक स्थानांतरित करें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक और एंजाइम समाधान, हर 10 मिनट आंदोलन।
  3. 30 मिनट इनक्यूबेशन के दौरान, 3 आग पॉलिश ग्लास पाश्चर पिपेट तैयार करें: 1 पूरी तरह से खुला, 1 आधा खुला, और 1 चौथाई खुला।
  4. 30 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, 15 एमएल शंकु नली 10 मिनट के लिए १२५ x ग्राम पर पचा मस्तिष्क ऊतकों युक्त अपकेंद्रित्र । एंजाइम समाधान निकालें और ताजा हाइबरनेट ई माध्यम की बराबर मात्रा के साथ बदलें।
  5. पूरी तरह से खुले पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, ऊतक 10x को ट्रिट करें। ऊतक को 2 मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें, फिर सुपरनाटेंट सेल सस्पेंशन को बाँझ 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। ऊतक में वापस हाइबरनेट ई माध्यम की एक समान मात्रा जोड़ें।
  6. आधा खुला पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, ऊतक 10x ट्राइटरेट करें। ऊतक को 2 मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें, फिर सुपरनेट सेल सस्पेंशन को पिछले चरण की तरह उसी 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। ऊतक में वापस हाइबरनेट ई माध्यम की एक समान मात्रा जोड़ें।
  7. क्वार्टर ओपन पाश्चर पिपेट, ट्राइटरेट टिश्यू 10x का उपयोग करना। ऊतक को 2 मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें, फिर सुपरनेट सेल सस्पेंशन को फिर से उसी 50 एमएल शंकु के पास स्थानांतरित करें। किसी भी शेष ऊतक को त्यागें जो अलग नहीं हुआ है।
  8. सेंट्रलाइज 50 एमएल शंकु नली जिसमें 5 मिनट के लिए 125 x g पर सेल सस्पेंशन से सुपरनैंट होता है। यदि पहले से नहीं किया जाता है, तो पॉली-डी-lysine-लेपित प्लेटों को बाँझ पानी से धोएं और अपकेंद्रित्र के दौरान पूरी तरह से आकांक्षा द्वारा तरल के सभी निशान हटा दें।
  9. अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को त्यागें और न्यूरॉन ग्रोथ मीडिया के 5 एमएल में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। ट्राइपैन ब्लू और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके लाइव कोशिकाओं को गिनें।
    1. यदि कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को culturing, कम घने कोशिकाओं और अधिक सटीक गिनती के लिए न्यूरॉन विकास मीडिया के कम से कम 10 एमएल जोड़ें।
  10. 5 x 10 5 व्यवहार्य कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर के अंतिम चढ़ाना घनत्व के लिए न्यूरॉन ग्रोथ मीडिया के साथ पतला कोशिकाओं और एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से पतला सेल निलंबन के 1 एमएल जोड़ें । 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर न्यूरॉन्स बनाए रखें।
    नोट: आमतौर पर, 1 भ्रूण माउस मस्तिष्क से हिप्पोकैम्पी, यानी, 2 हिप्पोकैम्पी, लगभग 1 x 106 व्यवहार्य कोशिकाओं उपज। यह संख्या केवल प्रयोग-योजना प्रयोजनों के लिए प्रदान की जाती है और प्रत्येक संस्कृति के लिए कोशिकाओं की गिनती के लिए एक प्रतिस्थापन नहीं माना जाना चाहिए ।
  11. प्रत्येक कुएं से मीडिया की आधी मात्रा यानी 05 एमएल को हटाकर संस्कृति के बाद दिन में विकास मीडिया को बदलें, और सुसंस्कृत कोशिकाओं को बाधित करने से बचने के लिए कुएं के किनारे ताजा मीडिया की बराबर मात्रा जोड़ें। पूरा आधा मीडिया संस्कृति की उम्र के लिए दो बार साप्ताहिक परिवर्तन ।

4. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा MHCI अभिव्यक्ति का आकलन

  1. इंटरफेरॉन बीटा (IFN) या न्यूरॉन ग्रोथ मीडिया में पतला की एक समान मात्रा को कमजोर करके उपचार तैयार करें। चूंकि मीडिया परिवर्तन एक आधा मात्रा में परिवर्तन होगा, 2x केंद्रित IFNο के साथ उपचार मीडिया तैयार करें। यानी, 100 यू/आईएफएन के एमएल के साथ 12 अच्छी प्लेट के 3 कुओं का इलाज करने के लिए, 200 यू/एमएल IFNο या मीडिया-इलाज नियंत्रण के लिए IFN diluent की समान मात्रा के साथ 1.5 एमएल तैयार करें।
  2. न्यूरॉन्स के प्रत्येक कुएं से 0.5 एमएल निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से आईएफएन के साथ या बिना न्यूरॉन ग्रोथ मीडिया के 0.5 एमएल जोड़ें। प्रयोगात्मक स्थितियों और सिग्नल अनुकूलन के आधार पर6-72 घंटे के लिए सामान्य विकास स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में इनक्यूबेट।
  3. उपचार के समय के बाद, सभी संस्कृति मीडिया को हटा दें और धीरे से एक बार ठंड न्यूरोबेसल मीडिया में पूरक (B27, एल-ग्लूटामाइन, पेन-स्ट्रेप) की कमी को धोएं।
  4. एफसी ब्लॉक के 1 μg/ml और फ्लोरोसेंट के 1 μg/ml युक्त गैर-पूरक कोल्ड न्यूरोबेसल मीडिया के 0.5 एमएल को प्रत्येक कुएं में जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट 45 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित।
  5. एंटीबॉडी युक्त मीडिया को हटा दें और ठंडे dPBS में एक बार ध्यान से धोएं। प्रत्येक कुएं में 0.5 एमएल कमरे-तापमान एंजाइम-मुक्त कोशिका वियोजन बफर जोड़ें और कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए आंदोलन करें। उल्टे ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर वियोजन के लिए देखो।
  6. एक बार कोशिकाओं को संस्कृति पकवान से अलग कर रहे हैं, प्रत्येक अच्छी तरह से FACS बफर के ०.५ एमएल जोड़ें, झुरमुट फैलाने के लिए कोशिकाओं ट्रिटेट, और प्रत्येक अच्छी तरह से कुल मात्रा व्यक्तिगत १.७ एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के लिए हस्तांतरण ।
  7. 5 मिनट के लिए 1, 000 x g पर सेंट्रलाइज। सुपरनैंट निकालें, FACS बफर के 100 माइक्रोन में सेल गोली को फिर से खर्च करें, और प्रत्येक ट्यूब की कुल मात्रा को 96 अच्छी तरह से यू-बॉटम प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करें।
  8. प्रत्येक अच्छी तरह से फिक्सेटिव रीएजेंट के 100 माइक्रोन जोड़ें। कोशिकाओं को झुरमुट और प्रकाश से संरक्षित कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट से बचने के लिए कई बार ट्रिट करें।
  9. 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट निकालें और 200 μl FACS बफर में resuspend.
  10. 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। प्रत्येक कुएं में फ्लोरेसेंट-कंजूग्ड एंटी-न्यून एंटीबॉडी (1:100 कमजोर पड़ने) वाले पर्मेबिलाइजेशन रीएजेंट के 100 माइक्रोन में सुपरनेट और रिसिपेंड को हटा दें। अच्छी तरह से मिलाएं, फिर 20 मिनट के लिए कमाल के साथ प्रकाश से संरक्षित कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  11. इनक्यूबेशन के बाद, 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सुपरनेट निकालें और 100 माइक्रोन में रीसस्टल ऑफ एफएएफएस बफर। 2x दोहराएं।
  12. अंतिम धोने के बाद, 2% पैराफॉर्मलडिहाइड के 100 माइक्रोन में कोशिकाओं को रीसुस्पेंड करें जो FACS बफर में पतला होता है। कोशिकाओं को झुरमुट से रोकने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्रकाश से संरक्षित जब तक एक प्रवाह साइटोमीटर पर पढ़ने के लिए तैयार है । 1 सप्ताह के भीतर, जितनी जल्दी हो सके नमूने पढ़ें।

5. डेटा की मात्रा निर्धारित करना और मूल्यांकन करना

  1. प्रत्येक फ्लोरोसेंट डाई के लिए मुआवजा नियंत्रण को मापें और किसी भी स्पेक्ट्रल ओवरलैप को सही करें। आदर्श मुआवजा नियंत्रण सुसंस्कृत न्यूरॉन्स कि दाग रहे हैं, केवल विरोधी MHCI के साथ दाग, और विरोधी के साथ दाग केवल NeuN शामिल हैं ।
  2. यदि संभव हो, तो प्रत्येक नमूने (कम से कम 10,000) के लिए 100,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें और एफसीएस फ़ाइलों के रूप में सहेजें।
  3. डेटा का विश्लेषण करने के लिए, उचित विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, अनुक्रमिक द्वार स्थापित करें, जैसा कि न्यून-पॉजिटिव न्यूरॉन्स के लिए चयन करने के लिए चित्र 1ए-सी में दर्शाया गया है।
    1. प्लॉट एसएससी-ए (लॉग) बनाम एफएससी-ए (रैखिक)। विश्लेषण से सेलुलर मलबे को खत्म करने के लिए सेलुलर आबादी (P1) पर एक गेट ड्रा।
    2. पी 1 सेलुलर आबादी के भीतर, प्लॉट एफएससी-एच (रैखिक) बनाम एफएससी-ए (रैखिक)। एकल सेल आबादी पर एक गेट ड्रा।
    3. एकल सेल आबादी के भीतर, प्लॉट एसएससी-ए (लॉग) बनाम न्यून (लॉग)। एक गाइड के रूप में दाग या MHCI-केवल दाग कोशिकाओं का उपयोग कर NeuN-सकारात्मक आबादी पर एक गेट ड्रा ।
    4. वाई-एक्सिस पर मोड के लिए सामान्यीकृत सेलुलर घटनाओं के साथ MHCI फ्लोरेसेंस का एक हिस्टोग्राम प्लॉट करें। एक गाइड के रूप में दाग या NeuN-केवल दाग न्यूरॉन्स का उपयोग करना, MHCI के लिए सकारात्मक प्रतिशत न्यूरॉन्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक क्षैतिज गेट आकर्षित ।
    5. एमएचसीआई के लिए सकारात्मक प्रतिशत कोशिकाओं का निर्यात करें, साथ ही सांख्यिकीय मूल्यांकन और चित्रमय ड्राइंग के लिए न्यून-सकारात्मक आबादी पर MHCI के लिए औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) ।

Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करना, हिप्पोकैम्पल ऊतक भ्रूण दिन 18 में जंम के पूर्व माउस पिल्ले से विच्छेदित किया गया था । ऊतक को एंजाइमेटिक और यांत्रिक तरीकों का उपयोग करके एक एकल कोशिका निलंबन में अलग किया गया था, फिर 12 अच्छी प्लेटों में सुसंस्कृत किया गया था जिन्हें पॉली-डी-लिसिन के साथ पूर्व-इलाज किया गया था। 7 दिनों के बाद विट्रो में, कोशिकाओं को केवल ७२ घंटे के लिए IFNο या मीडिया के १०० U/ml के साथ इलाज किया गया, जो MHCI की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया । न्यूरॉन्स MHCI के लिए सीटू में गैर एंजाइमेटिक रूप से एक ही सेल निलंबन में अलग होने से पहले दाग थे । न्यूरॉन्स को ठीक किया गया था और पार कर दिया गया था, फिर न्यूरोनल न्यूक्लिय मार्कर न्यून के लिए इंट्रासेलुलर रूप से दाग दिया गया था। नमूनों का मूल्यांकन प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था और संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। सेलुलर मलबे और डबल्स(चित्रा 1ए, बी)को बाहर करने के लिए कुल घटनाओं की अनुक्रमिक गेटिंग के माध्यम से न्यूरॉन्स की पहचान की गई थी। न्यूरॉन्स निश्चित NeuN-सकारात्मकता(चित्रा 1C)द्वारा पहचाना गया । NeuN+ कोशिकाओं को आगे एक हिस्टोग्राम पर कोशिकाओं की साजिश रचने के द्वारा MHCI के लिए विश्लेषण किया गया-y-धुरी और एक्स-एक्सिस पर एमएचसीआई फ्लोरेसेंस पर मोड को सामान्यीकृत कोशिकाओं की संख्या के साथ । एक MHCI+ गेट बिंदु पर खींचा गया था, जहां सकारात्मक और नकारात्मक चोटियों हट(चित्रा 1D)। इससे, एमएचसीआई धुंधला(चित्रा 1E)और औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) के लिए सकारात्मक प्रतिशत न्यूरॉन्स; चित्रा 1F) गणना की गई। परिणाम बताते हैं कि आईएफएन उपचार ने एमएफआई द्वारा इंगित के अनुसार, एमएचसीआई के बाह्य स्तर के साथ-साथ अभिव्यक्ति के स्तर के लिए न्यूरॉन्स के प्रतिशत को काफी हद तक बढ़ा दिया। सांख्यिकीय विश्लेषण और चित्रमय प्रतिनिधित्व व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर किया गया।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति और MHCI मात्राकरण ।
प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स आईएफएन या मीडिया के 100 यू/एमएल के साथ ही इलाज किया गया। 72 घंटे के बाद, न्यूरॉन्स प्रशांत ब्लू-संयुग्मित MHCI (1 μg/mL H2-Kb)के साथ अतिरिक्त रूप से दाग रहे थे, फिर पीई-संयुग्मित NeuN (1:100 कमजोर पड़ने) के साथ इंट्रासेलुलर लेबल । सेलुलर फ्लोरेसेंस का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था, और डेटा का विश्लेषण किया गया था। (A)कुल घटनाओं को एसएससी-ए (लॉग) बनाम एफएससी-ए (रैखिक) के रूप में प्लॉट किया गया था, और मलबे को बाहर करने के लिए कोशिकाओं (P1) को गेट किया गया था । (ख)पी 1 आबादी के भीतर, कोशिकाओं को एकल सेल आबादी को गेट करने के लिए एफएससी-एच (रैखिक) बनाम एफएससी-ए (रैखिक) के रूप में प्लॉट किया गया था । (ग)एकल कोशिका आबादी के भीतर, कोशिकाओं को एसएससी-ए (लॉग) बनाम न्यूएन-पीई (लॉग) प्लॉट किया गया था। न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए NeuN+ कोशिकाओं को गेट किया गया था। (घ)न्यूरॉन आबादी के भीतर, कोशिकाओं को वाई-एक्सिस पर मोड करने के लिए सामान्यीकृत एक्स-एक्सिस और सेल नंबरों पर MHCI-PacBlu के साथ एक हिस्टोग्राम पर प्लॉट किया गया था । MHCI धुंधला के लिए सकारात्मक न्यूरॉन्स के प्रतिशत की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक क्षैतिज गेट तैयार किया गया था । (ई)मीडिया में केवल न्यूएन+ कोशिकाओं के प्रतिशत MHCI+ की मात्रा और आईएफएन-उपचारित न्यूरॉन्स । (एफ)मीडिया में न्यून+ कोशिकाओं पर MHCI के औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) का मात्राकरण (काला) और IFNο-इलाज (लाल) न्यूरॉन्स । सांख्यिकीय महत्व की गणना अकर्पाद टी परीक्षण द्वारा की गई थी । **, पी < 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

न्यूरॉन ग्रोथ मीडिया (50 मिली)
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता स्टॉक एकाग्रता 50 मिलीलीटर के लिए
B27 पूरक 2% 100% 1.0 मिलीलीटर
एल-ग्लूटामाइन 2 mM 200 एमएमएम 0.5 मिलीलीटर
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 यू/एमएल 10,000 यू/एमएल 0.5 मिलीलीटर
न्यूरोबेसल मीडिया 48.0 मिलीलीटर
FACS बफर (500 मिलीलीटर)
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता स्टॉक एकाग्रता 500 मिलीलीटर के लिए
भ्रूण गोजातीय सीरम 2% 100% 10 मिलीलीटर
एडटा 1 mm 500 एमएमएम 1 मिलीलीटर
डीपीबीएस 489 मिलीलीटर
पापिन वियोजन समाधान
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता स्टॉक एकाग्रता 1 मिलीलीटर के लिए
पापीन निलंबन 20 यू/एमएल 1000 यू/एमएल 0.020 मिलीलीटर
DNase मैं 2.5 यू/एमएल 2500 यू/एमएल 0.001 मिलीलीटर
हाइबरनेट-ई 1.0 मिलीलीटर
नोट: पापिन वियोजन समाधान की मात्रा भ्रूणीय दिमाग की संख्या के आधार पर भिन्न होगी विच्छेदित किया जा रहा है। हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के लिए प्रति मस्तिष्क 0.5 मिलीलीटर या कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के लिए प्रति मस्तिष्क 1.0 मिलीलीटर तैयार करें।
नोट: हाइबरनेट-ई में लगभग 3 मिनट के लिए पापिन निलंबन को भंवर से जोड़कर वियोजन समाधान तैयार करें। पापिन को अच्छी तरह से भंग करने के बाद, DNase I जोड़ें। भंवर DNase मैं मत करो।

तालिका 1: मीडिया और समाधान।

Discussion

यह प्रोटोकॉल भ्रूणीय दिन 18 में जन्म के पूर्व माउस पिल्ले से प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के विच्छेदन और संस्कृति का वर्णन करता है। कृंतक से सुसंस्कृत प्राथमिक न्यूरॉन्स का उपयोग आधुनिक न्यूरोबायोलॉजी22में विकसित सबसे मौलिक पद्धतियों में से एक है । यद्यपि अमर कोशिका रेखाएं न्यूरॉन्स के कुछ पहलुओं को मॉडल कर सकती हैं, ट्यूमर-व्युत्पन्न कोशिकाओं के रूप में उनकी प्रकृति, परिभाषित अक्षों को विकसित करने में विफलता, और निरंतर सेल विभाजन संदेह उठाता है कि क्या वे वीवो23में पोस्ट-माइटोटिक न्यूरॉन्स के गुणों को ईमानदारी से पुन: रीकैपिटुलेट करते हैं। प्राथमिक न्यूरॉन्स का एक और विकल्प मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (HiPSCs) का उपयोग है। HiPSCs का उपयोग करने के लिए प्रौद्योगिकी, विशेष रूप से उन है कि रोगी व्युत्पन्न कर रहे हैं, हाल के वर्षों में तेजी से उंनत है24। हालांकि, सेल लाइनों के बीच परिवर्तनशीलता, कार्यात्मक परिपक्वता की कमी और एपिजेनेटिक प्रोफाइल25में अंतर सहित HiPSCs के साथ काम करने की अभी भी सीमाएं हैं। यद्यपि प्राथमिक कृंतक न्यूरॉन्स के न्यूनीकरण मॉडल के साथ काम करने की सीमाएं भी हैं, सुसंस्कृत न्यूरॉन्स वीवो में न्यूरॉन्स की माइटोटिक प्रकृति को बनाए रखते हैं। इसके अलावा, विशाल आणविक जीव विज्ञान उपकरण और चूहों के लिए उपलब्ध आनुवंशिक संशोधनों कई अनुप्रयोगों के लिए HiPSCs पर प्राथमिक न्यूरॉन्स के उपयोग के पक्ष में है, और माउस अध्ययन आसानी से प्रयोगात्मक आनुवंशिक प्रणाली को खोने के बिना वीवो जीव में अधिक जटिल करने के लिए अनुवाद किया जा सकता है । इन कारणों से, कई शोधकर्ता अपने शोध के प्रमुख पहलुओं, यदि थोक नहीं, तो सत्यापित करने के लिए प्राथमिक कृंतक न्यूरॉन्स का उपयोग करते हैं।

कुछ परख के लिए, मस्तिष्क पूर्व वीवो से अलगाव के बाद न्यूरॉन्स का सीधे विश्लेषण किया जा सकताहै। यह वयस्क चूहों से जुड़े प्रयोगों के लिए विशेष रूप से वांछनीय है जिन्हें विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों के अधीन किया जा सकता है या जो कई सेल प्रकारों की बातचीत पर निर्भर हो सकता है; हालांकि, ऐसे कई मुद्दे हैं जो विश्लेषण के प्रकार को सीमित करते हैं जो किए जा सकते हैं। वयस्क चूहों के दिमाग से न्यूरॉन्स का एकल कोशिका निलंबन तैयार करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि न्यूरॉन्स विशिष्ट रूप से आपस में जुड़े हुए हैं और मायलिन26से जुड़े हुए हैं । ऊतक त्रयोदश के गैर-एंजाइमेटिक तरीके ऊतक को अलग करने और कोशिका मृत्यु का कारण 10 00 00 00 00 00 000 हैं, जबकि एंजाइमेटिक तैयारी अक्सर सेल सतह एंटीजन27को क्लीव करती है। इसके अलावा, जबकि myelin भ्रूण चूहों से काफी हद तक अनुपस्थित है, इसमें वयस्क मस्तिष्क का लगभग 20% शामिल है, और व्यवहार्य कोशिका अलगाव को ख़राब कर सकता है और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण28में बाधा डाल सकता है। विकसित की गई कई तकनीकों ने अंततः अपने साइटोसोल के न्यूरॉन्स को स्ट्रिप किया और छोटे, गोल सेल निकायों को छोड़ दिया जिसमें मुख्य रूप से नाभिक29शामिल हैं। यद्यपि यह कुछ विश्लेषणों के लिए स्वीकार्य है, यह साइटोप्लाज्मिक या बाह्राश प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके अलावा, न्यूनीकरण कोशिका संस्कृति प्रणाली एक कम समय पैमाने पर विशिष्ट यंत्रवादी सवालों के परीक्षण की अनुमति देता है की तुलना में अक्सर एक वीवो प्रणाली में संभव है ।

इसके अलावा इस प्रोटोकॉल में वर्णित आईएफएन के साथ एमएचसीआई अभिव्यक्ति को औषधीय रूप से उत्तेजित करने के तरीके हैं, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा अतिरिक्त एमएचसीआई अभिव्यक्ति का मात्राकरण है। आईएफएनएनए द्वारा उत्तेजना अन्य प्रयोगात्मक स्थितियों के परीक्षण के लिए एक उपयोगी सकारात्मक नियंत्रण है, लेकिन यह ध्यान दिया जा सकता है कि IFNγ और कायनिक एसिड न्यूरॉन्स9,30में एमएचसीआई अभिव्यक्ति को भी उत्तेजित कर सकता है, जबकि टेट्रोडोटॉक्सिन एमएचसीआई अभिव्यक्ति14को कम कर देता है। एमएचसीआई अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए पिछले तरीकों पर सीटू संकरण और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण14,15,20,31पर भरोसा किया गया । जबकि एमआरएनए-आधारित परख, जैसे सीटू संकरण और क्यूआरटी-पीसीआर में, स्थानिक स्तरीय स्थानीयकरण, सेल प्रकार विशिष्टता और जीन ट्रांसक्रिप्शन के स्तर का निर्धारण कर सकते हैं, ये परख प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटीन अनुवाद या परिवहन का आकलन नहीं कर सकते हैं। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और पश्चिमी दाग विश्लेषण प्रोटीन अभिव्यक्ति और संभावित सेलुलर स्थानीयकरण में अंतर निर्धारित कर सकते हैं, लेकिन सही मात्रा में बताना मुश्किल हो सकता है । इसके अलावा, कई MHCI एंटीबॉडी परिसर की तृतीयक संरचना को पहचानते हैं, और अनुरूप परिवर्तनों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं। इस प्रकार पारगम्यीकरण या दुर्बलता की स्थिति के परिणामस्वरूप एमएचसीआई इम्यूनोरिएक्टिविटी32की हानि होती है । यहां प्रस्तुत विधि MHCI के लिए सीटू इम्यूनोस्टेटिंग में उपयोग करती है, जो अपने मूल संरचना में एंटीबॉडी द्वारा प्रोटीन की मान्यता के लिए अनुमति देती है, इसके बाद निर्धारण और पारमेबिलाइजेशन विधियों द्वारा।

मामूली संशोधनों के साथ, यहां वर्णित तरीकों का उपयोग अन्य न्यूरोनल आबादी को संस्कृति देने या ब्याज के अन्य बाह्राश प्रोटीन की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया आसान संशोधन हैं जो कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को संस्कृति के लिए बनाया जा सकता है, लेकिन यहां वर्णित तरीकों का उपयोग अन्य न्यूरोनल आबादी को संस्कृति में भी किया जा सकता है, जैसे कि स्ट्रेटल न्यूरॉन्स33। इसके अलावा, हालांकि यह प्रोटोकॉल एमएचसीआई और न्यून के इम्यूनोस्टेपिंग को निर्दिष्ट करता है, अन्य सेलुलर मार्कर को इसी तरह से पहचाना जा सकता है। सामान्य तौर पर, एक्सट्रासेलुलर मार्कर को एमएचसीआई की तरह माना जा सकता है और इंट्रासेलुलर मार्कर को न्यून की तरह माना जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सेलुलर वियोजन चरण के दौरान, अक्षानल अनुमानों को सोमा से कटे हुए हैं। क्योंकि यहां परिभाषित गेटिंग रणनीति सेलुलर मलबे को स्क्रीन करती है और न्यूरोनल न्यूक्लिय मार्कर न्यून पर केंद्रित है, प्रोटीन जो विशेष रूप से अक्षीय अनुमानों में व्यक्त किए जाते हैं, का पता नहीं लगाया जा सकता है।

हाल ही में जब तक, न्यूरॉन्स को केवल क्षति, संक्रमण, या इन विट्रो साइटोकिन उत्तेजना के जवाब में MHCI व्यक्त करने के लिए सोचा गया था ताकि साइटोटॉक्सिक सीडी 8+ टी कोशिकाओं9संलग्न करने के लिए । नए शोध ने विकास13के दौरान सिनैप्टिक कनेक्शनों को विनियमित करने में MHCI के एक और कार्य को स्पष्ट किया है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल वाइल्डटाइप सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में MHCI अभिव्यक्ति को प्रोत्साहित करने के लिए IFNο का उपयोग करता है, लेकिन इसी तरह के तरीकों का उपयोग विशिष्ट परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए विभिन्न सेलुलर उत्तेजनाओं या आनुवंशिक संशोधनों के साथ किया जा सकता है। यह विधि शोधकर्ताओं को आणविक तंत्र की जांच करने में सक्षम करेगी जो एमएचसीआई अभिव्यक्ति को विनियमित करता है, जो इन दो अलग सेलुलर कार्यों पर MHCI की विरोधाभासी भूमिका की समझ में सुधार करेगा ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईए आर00 एजी053412 (केईएफ) ने सपोर्ट किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Laboratory Supplies
100 mm sterile culture dish Fisher FB012924 Tissue Culture Supplies
15 ml Centrifuge Tubes Genesee 21-103 Laboratory Supplies
50 ml centrifuge tube Genesee 21-108 Laboratory Supplies
500 mM EDTA Invitrogen AM9260G FACS Buffer Reagent
70% Ethanol Fisher BP82031Gal Tissue Culture Supplies
96 well U-bottom plate Genesee 25-221 Flow Cytometry Supplies
B27 Gibco 17504044 Neuron Culture Reagent
Borate Buffer Thermo Scientific 28341 Tissue Culture Supplies
Borosilicate Glass Pasteur Pipette Fisher 13 678 20C Laboratory Supplies
Cell Dissociation Buffer Gibco 13 151 014 Flow Cytometry Supplies
DNase I Thermo 90083 Dissociation Solution Reagent
dPBS Gibco 14190-235 Tissue Culture Supplies
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 Dissection Tool
Dumont #7 Forceps Fine Science Tools 91197-00 Dissection Tool
Fetal Bovine Serum Gibco 26140079 Tissue Culture Supplies
Fine Forceps Fine Science Tools 91113-10 Dissection Tool
Fine Scissors Fine Science Tools 91460-11 Dissection Tool
Fix and Perm Cell Permeabilization Kit Invitrogen GAS003 Flow Cytometry Supplies
Glutamax Gibco 35050061 Neuron Culture Reagent
Hibernate-E Medium Gibco A1247601 Neuron Culture Reagent
Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher 181254 Tissue Culture Supplies
Interferon Beta PBL Assay Science 12405-1 Flow Cytometry Supplies
Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 MilliporeSigma FCMAB317PE Flow Cytometry Antibody
Neurobasal Media Gibco 21103049 Neuron Culture Reagent
Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody BioLegend 116513 Flow Cytometry Antibody
Papain Solution Worthington LS003126 Dissociation Solution Reagent
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714 Fixative
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Neuron Culture Reagent
Poly-D-Lysine Sigma P7280 Neuron Culture Reagent
Standard Pattern Forceps Fine Science Tools 91100-12 Dissection Tool
Stereo dissection microscope Swift M29TZ-SM99CL-BTW1 Dissection Tool
Surgical Scissors Fine Science Tools 91401-10 Dissection Tool
Transfer Pipets Corning 357575 Laboratory Supplies
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody BioLegend 101319 Flow Cytometry Antibody
Trypan Blue Sigma T8154-100ML Tissue Culture Supplies

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References

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Funk, K. E., Lotz, S. K. Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e61436, doi:10.3791/61436 (2020).

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