Summary
Ce protocole décrit une méthode pour la culture des neurones hippocampal primaires du cerveau embryonnaire de souris. L’expression de la classe I complexe majeure d’histocompatibilité sur la surface extracellulaire des neurones cultivés est alors évaluée par analyse cytometric d’écoulement.
Abstract
Les preuves croissantes soutiennent l’hypothèse que les interactions neuro-immunes ont un impact sur le fonctionnement du système nerveux dans des conditions homéostatiques et pathologiques. Une fonction bien étudiée de la classe I (MHCI) du complexe majeur d’histocompatibilité est la présentation des peptides cellule-dérivés au système immunitaire adaptatif, en particulier en réponse à l’infection. Plus récemment, il a été démontré que l’expression des molécules MHCI sur les neurones peut moduler les changements dépendant de l’activité de la connectivité synaptique pendant le développement normal et les troubles neurologiques. L’importance de ces fonctions pour la santé du cerveau soutient la nécessité d’un essai sensible qui détecte facilement l’expression de MHCI sur les neurones. Ici nous décrivons une méthode pour la culture primaire des neurones hippocampal murins et puis l’évaluation de l’expression de MHCI par analyse cytometric d’écoulement. L’hippocampe murin est microdisséqué des petits de souris prénatals au jour embryonnaire 18. Le tissu est dissocié en une seule suspension cellulaire à l’aide de techniques enzymatiques et mécaniques, puis cultivé dans un milieu sans sérum qui limite la croissance des cellules non neuronales. Après 7 jours in vitro, l’expression de MHCI est stimulée en traitant pharmacologiquement les cellules cultivées avec le bêta interféron. Les molécules MHCI sont marquées in situ avec un anticorps marqué par fluorescence, puis les cellules sont dissociées de manière non enzymatique en une seule suspension cellulaire. Pour confirmer l’identité neuronale, les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde, perméabilisées et marquées avec un anticorps marqué par fluorescence qui reconnaît l’antigène nucléaire neuronal NeuN. L’expression de la MHCI est ensuite quantifiée sur les neurones par analyse cytométrique en flux. Les cultures neuronales peuvent facilement être manipulées par des modifications génétiques ou des interventions pharmacologiques pour tester des hypothèses spécifiques. Avec de légères modifications, ces méthodes peuvent être utilisées pour culturer d’autres populations neuronales ou pour évaluer l’expression d’autres protéines d’intérêt.
Introduction
On pensait autrefois que le système nerveux central (SNC) était dépourvu de surveillance immunitaire, ce que l’on appelait le «1privilégié immunitaire ». Il est maintenant clair que ce privilège n’équivaut pas à l’absence absolue de composants immunitaires, mais plutôt à une régulation spécialisée qui fonctionne pour limiter les dommages associés à l’immunopathologie1. En fait, la communication entre le SNC et le système immunitaire est une conversation continue qui est nécessaire pour le développement sain du cerveau et la réponse aux infections2,3.
Les molécules majeures du complexe d’histocompatibilité de classe I (MHCI) sont des protéines transmembranaires polygéniques et polymorphes mieux connues pour leur fonction de présentation de peptides antigéniques aux lymphocytes CD8+ T lors de l’infection4. Les complexes MHCI classiques sont constitués d’une chaîne α transmembranaire et d’une chaîne légère extracellulaire, appelée β2-microglobuline. La chaîne α contient une rainure polymorphe qui lie un peptide antigénique pour la présentation5. L’expression correcte de MHCI sur la membrane extracellulaire nécessite une action coordonnée des chaperons moléculaires au niveau du réticulum endoplasmique pour assurer un repliement correct de la chaîne α et de la β2-microglobuline ainsi que la charge d’un ligand peptidique de haute affinité5. Ce n’est qu’une fois les complexes MHCI assemblés qu’ils sont exportés du réticulum endoplasmique vers la membraneplasmique 6. Lors de l’engagement du récepteur des lymphocytes T apparentés avec le complexe MHCI chargé de peptides, les lymphocytes CD8+ T négocient la destruction des cellules en libérant des granules lytiques contenant de la perforine et des granzymes ou en induisant l’apoptose par la liaison du récepteur Fas sur la membrane cellulaire cible7. De plus, les lymphocytes T CD8+ produisent des cytokines, telles que l’interféron gamma (IFNγ) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα), qui peuvent activer des mécanismes antiviraux dans les cellules infectées sans effets cytopathiques8,9. Pour de nombreux virus neurotropes, les lymphocytes T CD8+ sont nécessaires pour éliminer l’infection du SNC10,11,12.
On l’a précédemment pensé que les neurones expriment MHCI seulement dans des conditions de dommages, d’infection virale, ou avec la stimulation in vitro de cytokine. Récemment, la recherche a identifié un rôle pour l’expression neuronale de MHCI dans le remodelage synaptique et la plasticité13,14. Bien que les mécanismes précis sous-jacents à la régulation des synapses ne soient pas bien compris, les données indiquent que le niveau d’expression de la MHCI est régulé parl’activitésynaptique15,16. Une hypothèse postule que les neurones expriment le récepteur B (PirB) apparié de type immunoglobuline présynaptiquement, qui lie MHCI transynaptiquement13,17. Cette interaction initie une cascade de signalisation par PirB qui s’oppose aux voies impliquées dans le remodelage synaptique, renforçant et stabilisant ainsi la connexion synaptique17,18,19. En l’absence d’activité neuronale, l’expression de MHCI est diminuée14,et la perte de MHCI entraîne une élimination de synapse défectueuse et des circuits synaptiques mal organisés20,21.
Le test décrit ici, qui a été adapté de Chevalier et al.9,utilise l’analyse cytométrique de flux pour évaluer quantitativement l’expression extracellulaire des protéines de MHCI sur les cultures primaires des neurones de l’hippocampe murin. Ce protocole illustre les techniques initiales pour microdissécting le tissu hippocampal des chiots embryonnaires de souris. Il détaille ensuite les procédés de dissociation enzymatique et mécanique des tissus en une seule suspension cellulaire et les procédés de maintien des cultures invitro. Parce qu’ils ne se divisent pas, une fois qu’ils sont en culture, les neurones doivent être plaqués dans une parabole et une densité adaptées à leur critère expérimental. Ensuite, il décrit les étapes pour induire l’expression de MHCI avec l’interféron bêta (IFNβ), l’immunomarquage pour MHCI et le marqueur de noyaux neuronaux NeuN, et l’analyse des cellules par cytométrie de flux. Enfin, il décrit les procédures d’évaluation des données de cytométrie de flux pour identifier les neurones MHCI-positifs et quantifier le niveau de l’expression MHCI. Également notés dans ce protocole sont de petits ajustements qui peuvent être faits afin de culture des neurones corticaux en plus ou à la place des neurones hippocampiques. Ce protocole peut être facilement modifié pour tester des hypothèses spécifiques à l’aide de variations génétiques ou de traitements pharmacologiques.
Protocol
Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health et conformément aux Principes directeurs internationaux pour la recherche biomédicale impliquant des animaux. Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline du Nord à Charlotte (Protocole #19-020).
1. Se préparer à la culture
NOTA : Ces procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une armoire de biosécurité désignée pour la culture tissulaire. Voir le tableau 1 pour les médias et les solutions.
- Stériliser tous les outils de dissection en autoclavant dans des sacs de stérilisation auto-obturants.
- Préparez des stocks de travail de poly-D-lysine pour traiter les plats de culture à 12 puits.
- Dissoudre la poly-D-lysine dans 1x tampon de borate à une concentration de 100 μg/mL (10x concentré). Conserver environ 1 mL de aliquotes à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit nécessaire.
- Diluer 10x la poly-D-lysine concentrée dans le dPBS à 10 μg/mL (1x) et stériliser le filtre.
- Traiter les plaques de culture de 12 puits avec 0,5 mL par puits de 1x poly-D-lysine à température ambiante pendant au moins 1 h ou pendant la nuit pour une utilisation le lendemain. Assurez-vous que le volume de poly-D-lysine est suffisant pour couvrir complètement le fond de la zone de culture.
- Juste avant l’utilisation, retirer la poly-D-lysine de la plaque de culture, rincer 3x dans de l’eau stérile et conserver dans de l’eau stérile jusqu’à ce qu’elle soit prête à plaquer les cellules. Enlever toutes les traces de liquide par une aspiration approfondie avant de plaquer les cellules.
- Préparer les milieux de croissance des neurones et le tampon FACS. Stériliser et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. Neuron Growth Media peut être conservé pendant environ 2 wks; La mémoire tampon FACS peut être conservée pendant environ 4 wks.
2. Disséquer l’hippocampe embryonnaire
REMARQUE: Cette procédure peut être effectuée sur le paillasse car elle nécessite l’utilisation d’un stéréomicroscope pour l’élimination des méninges et la microdissection de l’hippocampe. Adhérer à une technique aseptique stricte pour minimiser la contamination potentielle.
- Euthanasier une souris femelle C57BL/6J chronométré-enceinte au jour embryonnaire 18 dans une chambre de CO2.
- Vaporisez la peau abdominale et la fourrure avec 70% d’EtOH, puis pincez la peau avec des pinces tissulaires et faites une petite incision avec des ciseaux chirurgicaux. Inciser le péritoine pour exposer les viscères et l’utérus.
- Saisissez l’utérus avec une pince à motif standard, soulevez-la hors de la cavité et coupez la connexion au mélosometrium avec de fins ciseaux. Transférer l’utérus avec des embryons dans un plat de culture en plastique stérile de 100 mm placé sur de la glace.
- À l’aide de ciseaux fins et de pinces fines, coupez soigneusement l’utérus et retirez les sacs embryonnaires pour libérer les embryons. Transférer les embryons dans une nouvelle boîte de culture en plastique stérile de 100 mm contenant du dPBS placé sur de la glace.
- Décapiter les petits embryons à l’aide de ciseaux fins et transférer les têtes vers une nouvelle boîte de culture en plastique stérile de 100 mm contenant du milieu Hibernate-E placée sur de la glace.
- Pour enlever le cerveau, tenez la tête avec une paire de pinces fines dans une main. À l’aide de dumont incurvé #7 pinces dans l’autre main, insérez la pointe de la pince à la base du crâne et pincez l’os et la peau trop-basse se déplaçant antérieurement le long de la ligne médiane sans percer le cerveau.
- À l’aide d’une pince incurvée, séparez la peau et le crâne pour exposer le cerveau. Balayez les pinces incurvées sous le cerveau du bulbe olfactif exposé au cervelet pour soulever le cerveau hors du crâne. Transférer le cerveau dans un nouveau plat de culture en plastique stérile de 100 mm contenant du milieu Hibernate-E placé sur de la glace. Répétez l’opération pour chaque cerveau.
REMARQUE: Tous les cerveaux peuvent être collectés dans un seul plat de culture, sauf s’il est nécessaire d’être séparé à des fins spécifiques à l’expérience. - Sous un microscope à dissection stéréoscopique, travailler avec un cerveau à la fois et deux paires de pinces stériles du Dumont #5, pincer les bulbes olfactifs et arracher les méninges. L’enlèvement complet des méninges est nécessaire pour éviter la contamination de culture par d’autres cellules et pour permettre davantage de dissection.
- Une fois les méninges correctement enlevées, le côté supérieur du cortex s’ouvre latéralement, ce qui exposera l’hippocampe. À l’aide de Dumont #5 pince, pincez l’hippocampe loin du cortex attaché et transférez soigneusement l’hippocampe isolé dans un tube conique stérile de 15 mL contenant 5 mL de milieu Hibernate-E sur de la glace.
- Répétez la dissection pour les deux hémisphères cérébraux pour chaque petit de souris embryonnaire et combinez tous les hippocampes dans un seul tube conique de 15 mL, à moins que cela ne soit nécessaire séparément à des fins spécifiques à l’expérience.
- Pour la culture des neurones corticaux, le cortex peut être séparé du subcortex et traité de manière identique aux neurones hippocampiques.
Remarque : à ce stade, protocole peut être suspendu. Conservez les cerveaux ou les hippocampes disséqués dans un milieu Hibernate-E complété par du B27 (2%) à 4 °C jusqu’à 1 mois, bien qu’un délai prolongé puisse compromettre le nombre de cellules viables.
- Pour la culture des neurones corticaux, le cortex peut être séparé du subcortex et traité de manière identique aux neurones hippocampiques.
3. Dissocier et cultiver les neurones de l’hippocampe
NOTA : Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une armoire de biosécurité désignée pour la culture tissulaire.
- Préparer 0,5 mL de solution de dissociation de papaïne par embryon pour la dissociation de l’hippocampe. Le volume de solution de dissociation nécessaire variera en fonction du nombre de cerveaux embryonnaires disséqués.
REMARQUE: Pour la culture de neurones corticaux, préparer 1,0 mL de solution de papaïne par embryon.- Dissoudre 20 μL de suspension de papaïne par 1 mL du milieu Hibernate E par vortex pendant environ 3 min.
- Après la dissolution de la papaïne, ajouter 1 μL de DNase I par 1 mL de la solution. Ne pas vortex la solution après DNase I a été ajouté car cela peut désactiver l’enzyme.
- Tube conique centrifugeur de 15 mL contenant du tissu hippocampique (étape 2.10) à 1 000 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et ajoutez la solution de papaïne. Ressusciter le tissu en inversant plusieurs fois. Incuber à 37 °C pendant 30 min, en s’inversant pour ressusciter le tissu toutes les 10 min.
- Si vous cultivez des neurones corticaux, transférez tous les cortex dans une nouvelle boîte de culture stérile de 100 mm, aspirez soigneusement les milieux de la plaque et hachez le tissu avec de fines ciseaux ou une lame de rasoir. Ajouter la solution de papaïne à la boîte de culture et transférer le tissu cortical avec la solution de papaïne dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette de transfert stérile. Incuber les tissus et la solution enzymatique à 37 °C pendant 30 min, en agitant toutes les 10 minutes.
- Pendant 30 min d’incubation, préparez 3 pipettes Pasteur en verre poli au feu : 1 entièrement ouverte, 1 demi-ouverte et 1 quart ouverte.
- Après l’incubation de 30 minutes, centrifuger le tube conique de 15 mL contenant des tissus cérébraux digérés à 125 x g pendant 10 min. Retirer la solution enzymatique et la remplacer par un volume égal de milieu hibernate E frais.
- À l’aide d’une pipette Pasteur entièrement ouverte, triturer le tissu 10x. Laissez le tissu se déposer pendant 2 min, puis transférez la suspension de cellules surnageantes dans un tube conique stérile de 50 mL. Rajouter un volume égal de milieu Hibernate E au tissu.
- À l’aide d’une pipette Pasteur semi-ouverte, tissu trituré 10x. Laissez le tissu se déposer pendant 2 min, puis transférez la suspension de cellules surnageantes dans le même tube conique de 50 mL que dans l’étape précédente. Rajouter un volume égal de milieu Hibernate E au tissu.
- À l’aide d’un quart ouvert pasteur pipette, tissu triturate 10x. Laissez le tissu se déposer pendant 2 min, puis transférez à nouveau la suspension de cellules surnageantes dans la même conique de 50 mL que dans les étapes précédentes. Jetez tout tissu restant qui ne s’est pas dissocié.
- Centrifuger le tube conique de 50 mL contenant le surnageant de la suspension cellulaire à 125 x g pendant 5 min. Si ce n’est pas déjà fait, laver les plaques revêtues de poly-D-lysine avec de l’eau stérile et enlever toute trace de liquide par aspiration approfondie pendant la centrifugation.
- Après centrifugation, jeter le surnageant et ressusciter la pastille cellulaire dans 5 mL de neuron Growth Media. Comptez les cellules vivantes à l’aide du bleu trypan et de l’hémocytomètre.
- Si vous cultivez des neurones corticaux, ajoutez au moins 10 mL de milieux de croissance des neurones pour des cellules moins denses et un comptage plus précis.
- Diluer les cellules avec neuron Growth Media pour une densité de placage finale de 5 x 105 cellules viables par ml et ajouter 1 mL de suspension de cellules diluées à chaque puits d’une plaque de 12 puits. Maintenir les neurones à 37 °C avec 5 % deCO2.
REMARQUE: Typiquement, les hippocampes de 1 cerveau embryonnaire de souris, c’est-à-dire 2 hippocampes, donnent environ 1 x 106 cellules viables. Ce nombre est fourni à des fins de planification expérimentale seulement et ne doit pas être considéré comme une substitution pour compter les cellules pour chaque culture. - Changer le milieu de croissance le lendemain de la culture en enlevant la moitié du volume de milieu de chaque puits, c.-à-d. 0,5 mL, et ajouter un volume égal de milieux frais sur le côté du puits pour éviter de perturber les cellules cultivées. La moitié complète des médias change deux fois par semaine pendant toute la durée de vie de la culture.
4. Évaluation de l’expression de l’ICMH par cytométrie en flux
- Préparer le traitement en diluant l’interféron bêta (IFNβ) ou un volume égal de diluant dans les milieux de croissance neuronaux. Étant donné que le changement de média sera un changement de demi-volume, préparez le milieu de traitement avec 2x IFNβ concentré. c’est-à-dire, pour traiter 3 puits d’une plaque de 12 puits avec 100 U/mL d’IFNβ, préparer 1,5 mL avec 200 U/mL d’IFNβ ou un volume égal de diluant IFNβ pour les témoins traités par les médias.
- Retirez 0,5 mL de chaque puits de neurones et ajoutez 0,5 mL de milieux de croissance neuronaux avec ou sans IFNβ à chaque puits. Incuber dans des conditions de croissance normales (37 °C, 5 % deCO2)pendant 6 à 72 h, en fonction des conditions expérimentales et de l’optimisation du signal.
- Après le temps de traitement, retirer tous les milieux de culture et laver doucement une fois dans les milieux neurobasaux froids manquant de suppléments (B27, L-glutamine, Pen-Strep).
- Ajouter 0,5 mL de milieux neurobasaux froids non supplémentés contenant 1 μg/mL de bloc Fc et 1 μg/mL d’anticorps conjugués fluorescents anti-MHCI à chaque puits. Incuber à 4 °C à l’abri de la lumière pendant 45 min.
- Retirer les milieux contenant des anticorps et laver soigneusement une fois dans le dPBS froid. Ajouter 0,5 mL de tampon de dissociation cellulaire sans enzymes à température ambiante à chaque puits et agiter pour déloger les cellules. Surveillez la dissociation à l’aide d’un microscope de culture de tissus inversés.
- Une fois les cellules détachées de la boîte de culture, ajoutez 0,5 mL de tampon FACS à chaque puits, triturez les cellules pour disperser les touffes et transférez le volume total de chaque puits dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,7 mL.
- Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant, ressuscitez la pastille cellulaire dans 100 μL de tampon FACS et transférez le volume total de chaque tube vers des puits individuels d’une plaque inférieure en U de 96 puits.
- Ajouter 100 μL de réactif fixateur à chaque puits. Triturer plusieurs fois pour éviter l’agglutination des cellules et incuber pendant 15 min à température ambiante à l’abri de la lumière.
- Centrifuger à 500 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et ressuscitez-le dans 200 μl de tampon FACS.
- Centrifuger à 500 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et le ressusciter dans 100 μL de réactif de perméabilisation contenant de l’anticorps anti-NeuN conjugué par fluorescence (dilution de 1:100) dans chaque puits. Bien mélanger, puis incuber à température ambiante à l’abri de la lumière avec bascule pendant 20 min.
- Après incubation, centrifuger à 500 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et ressuscitez-le dans 100 μL de tampon FACS. Répétez 2x.
- Après le lavage final, ressusciter les cellules dans 100 μL de paraformaldéhyde à 2 % dilué dans un tampon FACS. Bien mélanger pour empêcher les cellules de s’agglutiner. Conserver à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à ce qu’il soit prêt à lire sur un cytomètre de flux. Lire les échantillons dès que possible, dans un délai de 1 semaine.
5. Quantification et évaluation des données
- Mesurer les contrôles de compensation pour chaque colorant fluorescent et corriger tout chevauchement spectral. Les contrôles de compensation idéaux incluent les neurones cultivés qui ne sont pas souillés, souillés avec l’anti-MHCI seulement, et souillés avec l’anti-NeuN seulement.
- Si possible, enregistrez 100 000 événements pour chaque exemple (au moins 10 000) et enregistrez-les en tant que fichiers FCS.
- Pour analyser les données, à l’aide d’un logiciel d’analyse approprié, configurez des portes séquentielles, comme illustré à la figure 1A-C pour sélectionner les neurones NeuN positifs.
- Tracer SSC-A (log) vs FSC-A (linéaire). Tracez une porte sur la population cellulaire (P1) pour éliminer les débris cellulaires de l’analyse.
- Dans la population cellulaire P1, tracer FSC-H (linéaire) vs FSC-A (linéaire). Dessinez une porte sur la population unicellulaire.
- Dans la population unicellulaire, tracer SSC-A (log) vs NeuN (log). Tracez une porte sur la population NeuN-positive utilisant des cellules non souillées ou MHCI-seulement comme guide.
- Tracer un histogramme de la fluorescence MHCI avec des événements cellulaires normalisés au mode sur l’axe des y. À l’aide de neurones non colorés ou neuN uniquement comme guide, dessinez une porte horizontale pour quantifier le pourcentage de neurones positifs pour MHCI.
- Exporter les cellules en pourcentage positives pour l’ICM, ainsi que l’intensité médiane de fluorescence (IFM) de l’ICM sur la population positive à NeuN à des fins d’évaluation statistique et de dessin graphique.
Representative Results
Utilisant le procédé présenté ici, le tissu hippocampal a été disséqué des chiots prénatals de souris au jour embryonnaire 18. Le tissu a été dissocié dans une suspension simple de cellules utilisant des méthodes enzymatiques et mécaniques, puis cultivé dans 12 plats de puits qui ont été pré-traités avec de la poly-D-lysine. Après 7 jours in vitro, les cellules ont été traitées avec 100 U/mL d’IFNβ ou de milieux seulement pendant 72 h, ce qui a stimulé l’expression de MHCI. Des neurones ont été souillés in situ pour MHCI avant d’être non-enzymatically dissociés dans une suspension simple de cellules. Des neurones ont été fixés et perméabilisés, puis souillés intracellulairement pour le marqueur neuronal de noyaux NeuN. Des échantillons ont été évalués par cytometry de flux et des données ont été analysées utilisant le logiciel associé. Les neurones ont été identifiés par des points de contrôle séquentiels des événements totaux pour exclure les débris cellulaires et les doublets(figure 1A,B). Les neurones ont été définitivement identifiés par neuN-positivité (Figure 1C). NeuN+ cellules ont été plus loin analysées pour MHCI-positivité en traçant des cellules sur un histogramme avec le nombre de cellules normalisées au mode sur le Y-axe et à la fluorescence de MHCI sur le x-axe. Une grille MHCI+ a été dessinée au point où les pics positifs et négatifs divergeaient(figure 1D). À partir de là, le pourcentage de neurones positifs pour la coloration MHCI (Figure 1E) et l’intensité médiane de fluorescence (MFI; Figure 1F) ont été calculés. Les résultats montrent que le traitement IFNβ a considérablement régulé à la hausse le pourcentage de neurones positifs pour la coloration extracellulaire de l’ITM, ainsi que le niveau d’expression, comme indiqué par l’IFM. L’analyse statistique et la représentation graphique ont été effectuées à l’aide d’un logiciel statistique disponible dans le commerce.
Figure 1 : Stratégie de gating représentative et quantification de l’ICSE.
Les neurones de l’hippocampe primaire ont été traités avec 100 U/mL d’IFNβ ou de milieux seulement. Après 72 h, les neurones ont été colorés extracellulairement avec du MHCI conjugué au bleu du Pacifique (1 μg/mL H2-Kb),puis marqués intracellulairement avec du NeuN conjugué au PE (dilution de 1:100). La fluorescence cellulaire a été évaluée par l’écoulement cytometry, et des données ont été analysées. (A) Les événements totaux ont été tracés comme SSC-A (log) vs FSC-A (linéaire), et les cellules (P1) ont été fermées pour exclure les débris. (B) Dans la population P1, les cellules ont été tracées comme FSC-H (linéaire) contre FSC-A (linéaire) pour gate la population unicellulaire. (C) Dans la population unicellulaire, des cellules ont été tracées SSC-A (log) contre NeuN-PE (log). NeuN+ cellules ont été fermées pour identifier des neurones. (D) Dans la population de neurones, des cellules ont été tracées sur un histogramme avec MHCI-PacBlu sur l’axe des x et les nombres de cellules normalisés au mode sur l’axe des y. Une porte horizontale a été dessinée pour quantifier le pourcentage de neurones positifs pour la souillure de MHCI. (E) Quantification du pourcentage de MHCI+ de NeuN+ cellules dans les milieux seulement et les neurones traités par IFNβ. (F) Quantification de l’intensité médiane de fluorescence (IMF) de MHCI sur les cellules NeuN+ dans les milieux (noirs) et les neurones (rouges) traités par IFNβ. La signification statistique a été calculée par l’essai non apparié de t. **, P < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Milieux de croissance des neurones (50 ml) | |||
| Réactif | Concentration finale | Concentration des stocks | Pour 50 ml |
| Supplément B27 | 2% | 100% | 1,0 ml |
| L-glutamine | 2 mM | 200 mM | 0,5 ml |
| Pénicilline-streptomycine | 100 U/ml | 10 000 U/ml | 0,5 ml |
| Milieux neurobasaux | 48,0 ml | ||
| Tampon FACS (500 ml) | |||
| Réactif | Concentration finale | Concentration des stocks | Pour 500 ml |
| Sérum fœtal bovin | 2% | 100% | 10 ml |
| Edta | 1 mM | 500 mM | 1 ml |
| dPBS | 489 ml | ||
| Solution de dissociation de papaïne | |||
| Réactif | Concentration finale | Concentration des stocks | Pour 1 ml |
| Suspension de papaïne | 20 U/ml | 1000 U/ml | 0,020 ml |
| DNase I | 2,5 U/ml | 2500 U/ml | 0,001 ml |
| Hibernate-E | 1,0 ml | ||
| Remarque: Le volume de solution de dissociation de papaïne nécessaire variera en fonction du nombre de cerveaux embryonnaires disséqués. Préparer 0,5 ml par cerveau pour les neurones de l’hippocampe ou 1,0 ml par cerveau pour les neurones corticaux. | |||
| Remarque: Préparer la solution de dissociation envortexant la suspension de papaïne dans Hibernate-E pendant environ 3 min. Une fois la papaïne complètement dissoute, ajouter la DNase I. Ne pas vortex DNase I. | |||
Tableau 1 : Médias et solutions.
Discussion
Ce protocole décrit la dissection et la culture des neurones hippocampal primaires des chiots prénatals de souris au jour embryonnaire 18. L’utilisation de neurones primaires cultivés à partir de rongeurs est l’une des méthodologies les plus fondamentales développées en neurobiologie moderne22. Bien que les lignées cellulaires immortalisées puissent modéliser certains aspects des neurones, leur nature en tant que cellules dérivées de tumeurs, l’incapacité à développer des axones définis et la division cellulaire continue soulèvent des doutes quant à savoir si elles récapitulent fidèlement les propriétés des neurones post-mitotiques in vivo23. Une autre alternative aux neurones primaires est l’utilisation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (HiPSCs). La technologie d’utilisation des HiPSC, en particulier celles qui sont dérivées du patient, a progressé rapidement ces dernières années24. Cependant, il y a encore des limites à travailler avec les HiPSCs, y compris la variabilité entre les lignées cellulaires, le manque de maturité fonctionnelle et les différences dans les profils épigénétiques25. Bien qu’il y ait également des limites à travailler avec le modèle réductionniste des neurones primaires de rongeur, les neurones cultivés conservent la nature post-mitotique des neurones in vivo. En outre, les outils de biologie moléculaire expansifs et les modifications génétiques disponibles pour les souris favorisent l’utilisation de neurones primaires sur HiPSCs pour de nombreuses applications, et les études de souris peuvent être facilement traduites à l’organisme in vivo plus complexe sans perdre le système génétique expérimental. Pour ces raisons, de nombreux chercheurs utilisent les neurones primaires des rongeurs pour vérifier les aspects clés, sinon la majeure partie, de leurs recherches.
Pour certains dosages, les neurones peuvent être analysés directement après isolement du cerveau exvivo. Ceci est particulièrement souhaitable pour les expériences impliquant des souris adultes qui peuvent être soumises à des conditions expérimentales spécifiques ou qui peuvent dépendre d’interactions de plusieurs types de cellules; cependant, plusieurs problèmes limitent le type d’analyses qui peuvent être effectuées. Il est techniquement difficile de préparer une suspension cellulaire unique de neurones à partir du cerveau de souris adultes parce que les neurones sont interconnectés de manière unique et ensheathed par la myéline26. Les méthodes non enzymatiques de trituration tissulaire sont inefficaces pour dissocier le tissu et provoquer la mort cellulaire, tandis que les préparations enzymatiques clivent souvent les antigènes de surface cellulaire27. En outre, bien que la myéline soit largement absente des souris embryonnaires, elle représente environ 20% du cerveau adulte et peut nuire à l’isolement cellulaire viable et entraver l’analyse cytométrique en flux28. Beaucoup des techniques qui ont été développées finissent par dépouiller les neurones de leur cytosol et laisser de petits corps cellulaires arrondis qui se composent principalement de noyaux29. Bien que cela soit acceptable pour certaines analyses, cela n’est pas approprié pour quantifier l’expression des protéines cytoplasmiques ou extracellulaires. En outre, le système de culture cellulaire réductionniste permet de tester des questions mécanistes spécifiques sur une échelle de temps plus courte que celle qui est souvent possible avec un système in vivo.
Ce protocole décrit également des méthodes permettant de stimuler pharmacologiquement l’expression de la MHCI avec l’IFNβ, et la quantification de l’expression extracellulaire de la MHCI par cytométrie en flux. La stimulation par IFNβ est un témoin positif utile pour tester d’autres conditions expérimentales, mais on peut noter que l’IFNγ et l’acide kainique peuvent également stimuler l’expression de MHCI dans les neurones9,30,tandis que la tétrodotoxine diminue l’expression de MHCI14. Les méthodes précédentes de détection de l’expression de la MHCI reposaient sur l’hybridation in situ et l’analyse immunohistochimique14,15,20,31. Bien que les tests basés sur l’ARNm, tels que l’hybridation in situ et la qRT-PCR, puissent déterminer la localisation spatio-temporelle, la spécificité du type de cellule et les niveaux de transcription des gènes, ces tests ne peuvent pas évaluer la traduction ou le transport des protéines vers la membrane plasmique. L’analyse d’Immunohistochemical et occidentale de tache peut déterminer des différences dans l’expression de protéine et la localisation potentiellement cellulaire mais peut être difficile à quantifier avec précision. En outre, beaucoup d’anticorps de MHCI identifient le complex' structure tertiaire de s, et sont fortement sensibles aux changements conformationnels. Ainsi les conditions de perméabilisation ou de dénaturation entraînent une perte d’immunoréactivité MHCI32. La méthode présentée ici emploie immunostaining in situ pour MHCI, qui tient compte de l’identification de la protéine par l’anticorps dans sa conformation indigène, suivie des méthodes de fixation et de perméabilisation.
Avec de légères modifications, les méthodes décrites ici peuvent être utilisées pour la culture d’autres populations neuronales ou pour évaluer l’expression d’autres protéines extracellulaires d’intérêt. Notons dans ce protocole des modifications faciles qui peuvent être apportées afin de culturer des neurones corticaux, mais les méthodes décrites ici peuvent également être utilisées pour la culture d’autres populations neuronales, telles que les neurones striatal33. En outre, bien que ce protocole spécifie immunostaining de MHCI et de NeuN, d’autres marqueurs cellulaires peuvent être identifiés d’une manière semblable. En général, les marqueurs extracellulaires peuvent être traités comme MHCI et les marqueurs intracellulaires peuvent être traités comme NeuN. Cependant, il convient de noter que pendant l’étape de dissociation cellulaire, les projections axonales sont sectionné du soma. Étant donné que la stratégie de gating définie ici filtre les débris cellulaires et se concentre sur le marqueur neuronal des noyaux NeuN, les protéines qui sont exprimées exclusivement dans les projections axonales peuvent ne pas être détectées.
Jusqu’à récemment, on pensait que les neurones exprimaient la MHCI uniquement en réponse à des dommages, à une infection ou à une stimulation in vitro des cytokines afin d’engager les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques9. De nouvelles recherches ont élucidé une autre fonction de l’ICM dans la régulation des connexions synaptiques au cours du développement13. Le protocole décrit ici utilise IFNβ pour stimuler l’expression de la MHCI dans les neurones cultivés de type sauvage, mais des méthodes similaires peuvent être utilisées avec une variété de stimuli cellulaires ou de modifications génétiques pour tester des hypothèses spécifiques. Cette méthode permettra aux chercheurs d’étudier les mécanismes moléculaires qui régulent l’expression de la MHCI, ce qui améliorera la compréhension du rôle dichotomique de la MHCI sur ces deux fonctions cellulaires distinctes.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NIA R00 AG053412 (KEF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Laboratory Supplies |
| 100 mm sterile culture dish | Fisher | FB012924 | Tissue Culture Supplies |
| 15 ml Centrifuge Tubes | Genesee | 21-103 | Laboratory Supplies |
| 50 ml centrifuge tube | Genesee | 21-108 | Laboratory Supplies |
| 500 mM EDTA | Invitrogen | AM9260G | FACS Buffer Reagent |
| 70% Ethanol | Fisher | BP82031Gal | Tissue Culture Supplies |
| 96 well U-bottom plate | Genesee | 25-221 | Flow Cytometry Supplies |
| B27 | Gibco | 17504044 | Neuron Culture Reagent |
| Borate Buffer | Thermo Scientific | 28341 | Tissue Culture Supplies |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13 678 20C | Laboratory Supplies |
| Cell Dissociation Buffer | Gibco | 13 151 014 | Flow Cytometry Supplies |
| DNase I | Thermo | 90083 | Dissociation Solution Reagent |
| dPBS | Gibco | 14190-235 | Tissue Culture Supplies |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dissection Tool |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | Dissection Tool |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Tissue Culture Supplies |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Dissection Tool |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | Dissection Tool |
| Fix and Perm Cell Permeabilization Kit | Invitrogen | GAS003 | Flow Cytometry Supplies |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Neuron Culture Reagent |
| Hibernate-E Medium | Gibco | A1247601 | Neuron Culture Reagent |
| Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher | 181254 | Tissue Culture Supplies |
| Interferon Beta | PBL Assay Science | 12405-1 | Flow Cytometry Supplies |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 | MilliporeSigma | FCMAB317PE | Flow Cytometry Antibody |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | Neuron Culture Reagent |
| Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody | BioLegend | 116513 | Flow Cytometry Antibody |
| Papain Solution | Worthington | LS003126 | Dissociation Solution Reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Fixative |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Neuron Culture Reagent |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | Neuron Culture Reagent |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | Dissection Tool |
| Stereo dissection microscope | Swift | M29TZ-SM99CL-BTW1 | Dissection Tool |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91401-10 | Dissection Tool |
| Transfer Pipets | Corning | 357575 | Laboratory Supplies |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 101319 | Flow Cytometry Antibody |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-100ML | Tissue Culture Supplies |
References
- Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. What is immune privilege (not). Trends in Immunology. 28 (1), 12-18 (2007).
- Morimoto, K., Nakajima, K. Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System. Frontiers in Neuroscience. 13, 916 (2019).
- Klein, R. S., et al. Neuroinflammation During RNA Viral Infections. Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).
- Janeway, C. A. The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation. Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).
- Peaper, D. R., Cresswell, P. Regulation of MHC class I assembly and peptide binding. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).
- Donaldson, J. G., Williams, D. B. Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules. Traffic. 10 (12), Copenhagen, Denmark. 1745-1752 (2009).
- Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. T cell-mediated cytotoxicity. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. , (2001).
- Guidotti, L. G., Chisari, F. V. Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response. Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).
- Chevalier, G., et al. Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection. PLoS Pathogens. 7 (11), 1002393 (2011).
- Shrestha, B., Diamond, M. S. Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection. Journal of Virology. 78 (15), 8312-8321 (2004).
- Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells. Virology. 449, 235-243 (2014).
- Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection. Journal of Virology. 77 (4), 2775-2778 (2003).
- Shatz, C. J. MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity. Neuron. 64 (1), 40-45 (2009).
- Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity. Neuron. 21 (3), 505-520 (1998).
- Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (16), 6828-6833 (2007).
- Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16999-17004 (2010).
- Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex. Science. 313 (5794), New York, N.Y. 1795-1800 (2006).
- Atwal, J. K., et al. PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration. Science. 322 (5903), New York, N.Y. 967-970 (2008).
- Takai, T. Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition. Immunology. 115 (4), 433-440 (2005).
- Lee, H., et al. Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db. Nature. 509 (7499), 195-200 (2014).
- Ribic, A., et al. Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey. Behavioral and Brain Functions. 7, 1 (2011).
- Sahu, M. P., Nikkilä, O., Lågas, S., Kolehmainen, S., Castrén, E. Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex. Neuronal Signaling. 3 (2), (2019).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
- Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (4), 165431 (2020).
- Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease. Cells, Tissues, Organs. 205 (5-6), 331-349 (2018).
- Ho, H., et al. A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159 (2018).
- Panchision, D. M., et al. Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Snaidero, N., Simons, M.
- Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 356-367 (2017).
- Lv, D., et al. Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling. PLoS One. 10 (8), 0135223 (2015).
- Barco, A., et al. Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture. Neuron. 48 (1), 123-137 (2005).
- Glynn, M. W., et al. MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections. Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons. Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).
