Die Isolierung einzelner Kerne beruht auf der Dissoziation und der Waschmittel-basierten Permeabilisierung der Zellmembran, Schritte, die optimiert werden müssen und anfällig für die Einführung technischer Artefakte sind. Wir zeigen ein Waschmittel- und enzymfreies Protokoll zur schnellen Isolierung intakter Kerne direkt aus dem gesamten Gewebe, das Kerne liefert, die für Single-Nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) oder ATAC-seq geeignet sind.
Hochdurchsatz-Transkriptom und Epigenom-Profilierung erfordert die Vorbereitung einer Einzelzell- oder Einzelkernsuspension. Die Vorbereitung der Suspension mit intakten Zellen oder Kernen beinhaltet Dissoziation und Permeabilisierung, Schritte, die unerwünschte Geräusche und unerwünschte Schäden verursachen können. Insbesondere bestimmte Zelltypen wie Neuronen sind schwierig, sich in einzelne Zellen zu dissoziieren. Darüber hinaus erfordert die Permeabilisierung der Zellmembran zur Freisetzung von Kernen eine Optimierung durch Versuch und Irrtum, die zeitaufwändig, arbeitsintensiv und finanziell nicht lebensfähig sein kann. Um die Robustheit und Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung für die Hochdurchsatzsequenzierung zu verbessern, beschreiben wir eine schnelle enzym- und waschmittelfreie säulenbasierte Kernisolationsmethode. Das Protokoll ermöglicht eine effiziente Isolierung der Kerne aus dem gesamten Zebrafischhirn innerhalb von 20 Minuten. Die isolierten Kerne zeigen eine intakte Kernmorphologie und eine geringe Neigung zur Aggregation. Darüber hinaus ermöglicht die Durchflusszytometrie die Anreicherung und Clearance von Zellablagerungen für die nachgeschaltete Anwendung. Das Protokoll, das an Weichteilen und kultivierten Zellen arbeiten soll, bietet eine einfache und zugängliche Methode zur Probenvorbereitung, die für die Profilerstellung mit hohem Durchsatz verwendet werden kann, wodurch die Schritte vereinfacht werden, die für erfolgreiche Single-Nuklei-RNA-Seq- und ATAC-seq-Experimente erforderlich sind.
Single-Cell RNA-seq (scRNA-Seq) und ATAC-seq sind vielseitige Werkzeuge, um komplexe biologische Systeme mit einzelliger Auflösung zu untersuchen. Sie werden häufig genutzt, um Zellsubtypen und -zue), Gennetzwerke und zelluläre Heterogenität zu definieren. Voraussetzung für die Durchführung von scRNA-seq ist die Herstellung einer einzelzelligen Suspension durch Gewebedissoziation. Aufgrund der Variation der extrazellulären Matrixzusammensetzung und der mechanischen Eigenschaften erfordern einzelne Gewebe eine Optimierung des Dissoziationsprotokolls zur Herstellung einer einzelzelligen Suspension.
Die Dissoziation von Geweben in einzelne Zellen beinhaltet in der Regel die Behandlung mit Verdauungsenzymen, einschließlich Kollagennase, Dispase oder Trypsin, bei 37 °C1,2,3,4. Da die Transkriptionsmaschinerie bei 37 °C aktiv bleibt, kann die enzymatische Dissoziation mRNA-Expressionsartefakte und Rauschen5,6einführen. Insbesondere kann eine längere Inkubation stressempfindliche Gene und Hitzeschockreaktionen auf ungleichmäßige Weise auslösen – was zu technischen Variabilitätimexperimenten führt7.
Ein weiterer Nachteil der Erzeugung einer Einzelzellsuspension ist die Schwierigkeit, lebensfähige und intakte Zelltypen mit komplexen Morphologien zu erhalten. Insbesondere Neuronen, Adipozyten und Podozyten sind eine Herausforderung,8,9,10,11zu isolieren. Zum Beispiel demonstrierten Wu und Kollegen das Fehlen von glomerulären Podozyten in scRNA-Profilen einer erwachsenen Mausniere12. Ähnliche nicht optimale Beobachtungen wurden in Bezug auf die Wiederherstellung von miteinander verbundenen Neuronen aus Hirngewebe8,13,14gemacht. Zusammenfassend kann die Dissoziation, dass Dissoziationsprotokolle eine Erkennungsverzerrung in Richtung einer leichter zu dissoziierenden Zelltypen einführen können, was zu einer falschen Darstellung der zellulären Architektur des Organs führt.
Um das technische Rauschen und die Verzerrung zu überwinden, die während der Probenvorbereitung in scRNA-Seq. eingeführt werden, bietet die Isolierung und Profilierung des Kerns eine attraktive Alternative. Da die kerntechnische Morphologie zwischen verschiedenen Zelltypen ähnlich ist, umgeht die Isolierung der Kerne das Problem der Isolierung intakter und lebensfähiger Zellen mit komplexen Morphologien. So zeigten Wu und Kollegen eine erfolgreiche Profilierung von glomerulären Podozyten mit dem Single-Nucleus RNA-Seq. (snRNA-Seq.) einer erwachsenen Mausniere, die in scRNA-Seq12fehlte. Faszinierenderweise haben vergleichende Studien zwischen einzelliger und singlenucleus RNA-seq eine Abnahme der Induktion von Stress- und Hitzeschock-Antwort-Genen mit snRNA-Seq12nahegelegt. Die Studien deuten ferner auf eine hohe Korrelation zwischen den genenden Genen hin, die durch die beiden Methoden nachgewiesen wurden. Eine aktuelle Studie über menschliche Mikroglia konnte jedoch keine genetische Aktivierung bei der Alzheimer-Krankheit erkennen15. Somit ist snRNA-Seq in bestimmten Kontexten eine geeignete Alternative für scRNA-Seq16,17. Darüber hinaus kann die nukleare Isolierung für einzellige ATAC-Seq. genutzt werden, die Informationen über die Regionen von Offenem Chromatin in einzelnen Zellen liefert.
Das Protokoll zur Kernisolierung umfasst drei Hauptschritte: i) Lyse der Zellmembran auf Detergenzienbasis, um den Zellkern freizusetzen; ii) Gewebehomogenisierung mit einem Dounce Homogenisator; und iii) Anreicherung von Kernen und Entfernung von Zellablagerungen mittels Gradientenzentrifugation oder Durchflusszytometrie18,19,20,21,22. Dabei hängen die ersten beiden Schritte vom Gewebetyp ab und müssen empirisch optimiert werden. Mildes Reinigungsmittel führt zu einem partiellen Bruch der Zellmembran und ineffizientem Abruf von Kernen aus dem Gewebe23. Auf der anderen Seite führt ein hohes Waschmittelniveau und harte Homogenisierung zum Bruch der Kernmembran und deren Verlust24,25. Ruptured-Kerne neigen weiter dazu, sich zu verklumpen und Aggregate zu bilden, die, wenn sie nicht entfernt werden, zu Artefakten im nachgeschalteten Profilierungsexperiment führen können.
Um die Probleme im Zusammenhang mit der Reinigungsmitteloptimierung für die Kernisolierung zu umgehen, führen wir ein Protokoll ein, um intakte Kerne von frischen Proben mit einer waschmittelfreien und spinspaltenbasierten Methode zu isolieren. Das Protokoll liefert Kerne aus dem ganzen Organ innerhalb von 20 Minuten, was die Induktion der artefaktischen Transkription begrenzt. Die isolierten Kerne können mit FACS für Single-Nuclei RNA-Seq. und ATAC-seq angereichert werden, was eine einfache und universelle Methode bietet, die eine robuste und reproduzierbare Hochdurchsatzprofilierung ermöglicht.
Die Profilierung des Transkriptoms und des Epigenoms in einer einzelzelligen Auflösung hat die Untersuchung biologischer Systeme revolutioniert. Studien zur Auflösung einer einzelnen Zelle für ein festes Gewebe hängen von der Dissoziation des Organs in einzelne Zellen oder Kerne ab. Dissoziation ist ein destruktives Verfahren, das technische Artefakte einführen kann, die die Entwicklung einer genauen Darstellung des Systems5,6verhindern können. Zum Beispiel kann enzymatische Dissoziation Zellen mit komplexen Morphologien, wie Neuronen oder Podozyten, schädigen und die Expression von Stress und Hitzeschock-Antwort-Genen7,12induzieren. Zusätzlich kann die Verwendung von Reinigungsmittel während der Dissoziation die Kernmembran brechen und zur Aggregation23,25führen. Daher ist die Optimierung der Dissoziation, um eine Einzelzell- oder Kernsuspension von höchster Qualität zu erhalten, von größter Bedeutung für den Erfolg von Hochdurchsatz-Profiling-Experimenten.
Hier zeigen wir eine waschmittel- und enzymfreie Kernisolationsmethode, die die Extraktion intakter Kerne aus dem Zebrafischhirn in weniger als 20 Minuten ermöglicht. Das Protokoll liefert Kerne mit typischer Morphologie und robuster Integrität (Abbildung 2). Aus einem einzelnen Zebrafisch-Gehirn mit einem Gewicht von 6 mg ergibt das Protokoll insgesamt 60.000 Kerne, die durch eine Hämozytometerzahl bestimmt werden. Die isolierten Kerne können für mehrere nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden, einschließlich snRNA-seq, ATAC-seq und Immunostaining. Die isolierten Kerne können Kreuzkontaminationen aus zytoplasmatischen Fraktionen umfassen, insbesondere aus Komponenten von endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien. Für Hochdurchsatz-Profiling-Experimente wird dringend die Clearance von Zellablagerungen, insbesondere Mitochondrien, empfohlen. Die Durchflusszytometrie (Abbildung 3) bietet eine praktikable Option für die Reinigung von Kernen. Alternativ kann der Saccharosegradient auch zur Beseitigung von Schmutz verwendet werden.
Das Protokoll wurde an der Schilddrüse der Maus getestet (Daten nicht gezeigt) und liefert Ähnliche Ergebnisse wie Zebrafisch-Gehirngewebe. Insgesamt bietet das Protokoll eine robuste, reproduzierbare und universelle Methode zur Herstellung einer Einzelkernsuspension, die dazu beiträgt, die Logistik für Profiling-Experimente mit hohem Durchsatz zu vereinfachen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Mitgliedern des Labors von Dr. Sabine Costagliola und Singh für die Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde vom Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS unter der Grant-Nummer 34772792 – MISU an S.P.S. unterstützt.
Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |