Summary
Vi utviklet en metode for å oppdage Phytophthora capsici zoospores i vannkilder ved hjelp av en filterpapir DNA ekstraksjon metode kombinert med en loop-mediert isothermal forsterkning (LAMP) analyse som kan analyseres i feltet eller i laboratoriet.
Abstract
Phytophthora capsici er et ødeleggende oomycete patogen som påvirker mange viktige solanaceous og cucurbit avlinger forårsaker betydelige økonomiske tap i vegetabilsk produksjon årlig. Phytophthora capsici er jordbåren og et vedvarende problem i vegetabilske felt på grunn av sine langvarige overlevelsesstrukturer (oospores og klamydospores) som motstår forvitring og nedbrytning. Den viktigste metoden for spredning er gjennom produksjon av dyrespores, som er encellede, flagellated sporer som kan svømme gjennom tynne filmer av vann tilstede på overflater eller i vannfylte jordporer og kan akkumuleres i pytter og dammer. Derfor kan vanningsdammer være en kilde til patogenet og de første punktene av sykdomsutbrudd. Påvisning av P. capsici i vanning vanning vann er vanskelig å bruke tradisjonelle kulturbaserte metoder fordi andre mikroorganismer tilstede i miljøet, for eksempel Pythium spp., vanligvis overgrow P. capsici gjør det umulig å oppdage. For å bestemme tilstedeværelsen av P. capsici sporer i vannkilder (vanning vann, avrenning, etc.), utviklet vi en håndpumpebasert filterpapir (8-10 μm) metode som fanger patogenets sporer (zoospores) og brukes senere til å forsterke patogenets DNA gjennom en ny loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) analyse designet for den spesifikke forsterkningen av P. capsici. Denne metoden kan forsterke og oppdage DNA fra en konsentrasjon så lavt som 1,2 x 102 zoospores / ml, som er 40 ganger mer følsom enn konvensjonell PCR. Ingen kryssforsterkning ble oppnådd ved testing av nært beslektede arter. LAMP ble også utført ved hjelp av en kolorimetrisk LAMP master mix fargestoff, viser resultater som kan leses med det blotte øye for rask deteksjon på stedet. Denne protokollen kan tilpasses andre patogener som bor, akkumuleres eller spres via forurensede vanningssystemer.
Introduction
Resirkulering av vann i gårder og barnehager blir stadig mer populært på grunn av økningen i vannkostnader og miljøhensyn bak vannforbruket. Mange vanningsmetoder er utviklet for dyrkere for å redusere spredningen og forekomsten av plantesykdom. Uavhengig av kilden til vannet (vanning eller nedbør), genereres avrenning, og mange grønnsaks- og barnehagedyrkere har en dam å samle og resirkulere avrenning1. Dette skaper et reservoar for mulig patogenakkumulering som favoriserer spredningen av patogener når resirkulert vann brukes til å vanneavlinger 2,,3,,4. Oomycete plante patogener spesielt dra nytte av denne praksisen som zoospores vil akkumuleres i vann og den primære dispersive spore er selvmotil, men krever overflatevann5,,6,,7. Phytophthora capsici er et oomycete patogen som påvirker et betydelig antall solanaceous og cucurbit avlinger på forskjellige måter8. Ofte er symptomene demping av frøplanter, rot og kroneråte; Men i avlinger som agurk, squash, melon, gresskar, vannmelon, aubergine og pepper, kan hele avlinger gå tapt på grunn av fruktråte9. Selv om det finnes kjente metoder for å oppdage dette plantepatogenet, krever de fleste en infeksjon som allerede har funnet sted, noe som er for sent for at forebyggende soppmidler har en betydelig effekt10.
Den tradisjonelle metoden for å teste vanningsvann for deteksjon og diagnose av målrettede mikroorganismer er en foreldet tilnærming når hastighet og følsomhet er avgjørende for suksess og lønnsom avlingsproduksjon11,,12. Plantevev utsatt for det målrettede patogenet (f.eks. aubergine for P. capsici) er festet til en modifisert felle som er suspendert i en vanningsdam i lengre periode før den fjernes og inspiseres for infeksjon. Prøver fra plantevevet blir deretter belagt på halvselektive medier (PARPH) og inkubert for kulturvekst, deretter utføres morfologisk identifikasjon ved hjelp av et sammensatt mikroskop13. Det finnes andre lignende deteksjonsmetoder for andre plantepatogener ved hjelp av selektive medier og plating små mengder forurenset vann før sub-culturing14,15. Disse metodene krever alt fra 2 til 6 uker, flere runder med sub-culturing for å isolere organismen, og erfaring på Phytophthora diagnostikk for å kunne gjenkjenne de viktigste morfologiske tegnene til hver art. Disse tradisjonelle metodene fungerer ikke godt for påvisning av vanningsvann forurenset av P. capsici på grunn av faktorer som interferens av andre mikroorganismer som også finnes i vannkildene. Noen raskt voksende mikroorganismer som Pythium spp. og vannbårne bakterier kan overgrow på platen gjør P. capsici undetectable16,17.
Formålet med denne studien var å utvikle en sensitiv og spesifikk molekylær metode som kan brukes i både felt- og laboratorieinnstillinger for å oppdage P. capsici zoospores i vanningsvann. Protokollen inkluderer utvikling av en ny loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) primer satt i stand til å spesifikt forsterke P. capsici, basert på en 1121-base par (bp) fragment av P. capsici18,19. En tidligere utviklet LAMP primer fra Dong et al. (2015) ble brukt i forhold til analysen som ble utviklet for denne studien20.
LAMP-analysen er en relativt ny form for molekylær deteksjon som har vist seg å være raskere, følsom og spesifikk enn konvensjonell polymerasekjedereaksjon (PCR)21. Generelt kan ikke konvensjonelle PCR-analyser oppdages under 500 kopier (1,25 pg/μL); I motsetning har tidligere studier vist at følsomheten til LAMP kan være 10 til 1000 ganger høyere enn konvensjonell PCR og kan lett oppdage selv 1 fg / μL genomisk DNA22,23. I tillegg kan analysen utføres raskt (ofte i 30 min) og på stedet (i feltet) ved hjelp av en bærbar varmeblokk for forsterkning og et kolorimetrisk fargestoff som endrer farge for en positiv prøve (fjerne behovet for elektroforese). I denne studien sammenlignet vi følsomheten til PCR- og LAMP-analyser ved hjelp av en filterekstraksjonsmetode. Den foreslåtte deteksjonsmetoden gjør det mulig for forskere og utvidelsesmidler å enkelt oppdage tilstedeværelsen av P. capsici sporer fra forskjellige vannkilder på mindre enn to timer. Analysen er bevist å være mer følsom enn konvensjonell PCR og ble validert in situ ved å oppdage tilstedeværelsen av patogenet i vanningsvannet som brukes av en dyrker. Denne påvisningsmetoden vil tillate dyrkere å estimere tilstedeværelsen og befolkningstettheten til patogenet i ulike vannkilder som brukes til vanning, og forhindrer ødeleggende utbrudd og økonomiske tap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. På stedet påvisning av Phytophthora capsici fra vanning vanning vann ved hjelp av bærbar loop-mediert isotermisk forsterkning
- Sette opp pumpen og filteret
- Fest en filtreringskolbe til et rør som er koblet til en håndpumpe, slik at når pumpen er aktivert, trekkes luft inn gjennom munnen på filtreringskolben.
- Monter Buchner-trakten i gummiproppen til munningen av filtreringsflasken og monter det passende størrelsesfilterpapiret i Buchner-trakten slik at luft trekkes gjennom filterpapiret. Filterpapiret skal ha en retensjonsstørrelse på 15 μm.
MERK: Filterpapiret må passe til kantene på Buchner-trakten slik at minimalt vann vil strømme rundt filterpapiret.
- Vannprøvetaking og filtrering
- Ta vannprøver fra den målrettede kilden. Vann kan ha små mengder rusk, men ikke betydelig sediment eller jord.
- Hell opptil 1000 ml testvann over filterpapiret som er plassert inne i Buchner-trakten sakte nok til å forhindre overløp, mens håndpumpen (eller vakuumet) brukes til å lage en suge for å trekke vannet gjennom.
MERK: Det er ingen minimumsmengde vann som kan testes ved hjelp av denne metoden, og selv om det er minst 50 ml foreslått, er 1000 ml det maksimale for denne metoden. - Bruk tang, fjern filterpapiret fra Buchner-trakten og kutt det i små biter med steril saks. Tilsett så mange stykker (8-12) som kan senkes ned i mengden ekstraksjonsbuffer (400 μL for magnetisk perlebasert ekstraksjon) som kreves av protokollen i et 1,5 ml rør. Lagre gjenværende biter av filterpapir til behandling etter at det første settet er hentet ut.
- Vortex eller på annen måte røre bitene av filterpapir og ekstraksjonsbuffer i 10 s hvert minutt i 5 min. Deretter, ved hjelp av tang, fjerne filterpapiret miste så lite av ekstraksjon buffer som mulig. Gjenta dette trinnet med de gjenværende bitene av filterpapir til alle delene er virvlet /opphisset og gjennomvåt i ekstraksjonsbufferen.
- Magnetisk perlebasert ekstraksjon av DNA fra filterpapir
- Til 1,5 ml røret (som nå inneholder ca. 200-300 μL ekstraksjonsbuffer), tilsett 20 μL proteinase K og 10 μL på 10 ng/μL RNase.
- Inkuber ved romtemperatur i 15 min, vortex eller rist røret hver 3 min.
- Tilsett 500 μL magnetiske perler med bindingsbufferen til prøven og bland godt ved å riste. Deretter inkubere i 5 min ved romtemperatur.
- Plasser røret i magnetseparatorstativet i 2 min til alle perler er trukket til magneten. Fjern og kast overnatanten.
- Fjern røret fra magnetskilletegnet. Tilsett 500 μL vaskebuffer 1 og re-suspendere perler ved å riste røret kraftig. Vent til 30 s og plasser deretter røret tilbake i magnetseparatoren. Vent i 2 min til alle perler er trukket mot magneten før du fjerner og kaster overnatanten.
MERK: Når du venter på at de magnetiske perlene skal magnetiseres til separatoren, anbefaler vi at du inverterer røret, som kan løsne magnetiske perler som sitter fast i hetten og sidene av røret og resultere i at et større antall perler blir festet. - Gjenta trinn 1.3.5 med 500 μL vaskebuffer 2.
- Gjenta trinn 1.3.5 med 500 μL på 80% etanol.
- Lufttørk den magnetiske perlepelleten i 15 min ved romtemperatur (18-27 °C) med lokket åpent. Hvis temperaturen ikke tillater det, inkuber i en hanskehånd med hetten åpen i 15 min.
- Fjern røret fra magnetskilletegnet. Tilsett 50 μL elutionbuffer og re-suspendere perlene ved å pipettere opp og ned i 1 min.
- Plasser røret tilbake i en magnetisk separator. Vent 2 min før du overfører supernatanten uten å forstyrre perlene til et eget rør for DNA-lagring.
MERK: Her kan eksperimentet settes på pause før du går videre. Ekstrahert DNA skal oppbevares på is eller i en -20 °C fryser.
- Anvendelse av nyutviklet LAMP-analyse
- Klargjør LAMP primer mix med 0,2 μM av hver F3 og B3 primer, 0,8 μM av hver Loop-F og Loop-B primer, og 1,6 μM av hver FIP og BIP primer (tabell 2).
- Tilsett følgende LAMP-løsning i ett enkelt PCR-rør, eller til hvert enkelt rør i 8-rørstrimmelen: 2,5 μL primerblanding (trinn 1.4.1), 12,5 μL LAVA LAMP master mix, 1 μL av ekstrahert DNA og 9 μL ddH2O. Det totale volumet er 25 μL.
MERK: Hvis du bruker det bærbare forsterkningsinstrumentet (f.eks. Genie III) med fargestoff (f.eks. Warmstart), se pkt. 2.4.2- 2.4.3. - Angi to rør som positive og negative kontroller. For den positive kontrollen, bruk enten en kontroll levert av LAVA LAMP-settet, eller en kjent positiv DNA-prøve. For den negative kontrollen, bruk ddH2O. For begge, erstatte 1 μL av ekstrahert DNA for 1 μL av den positive kontrollen eller ddH2O.
- Sett prøvene i en varmeblokk (eller bærbarforsterkningsinstrument) satt til 64 °C i 45 min.
MERK: Andre ekstraksjonsmetoder kan brukes her i stedet for magnetisk perlebasert ekstraksjon. CTAB og et kommersielt DNA-avsugssett ble begge testet med hell ved hjelp av standardprotokollene og erstattet filterpapirbitene forplanteprøven 24,25. Resultatene ble sammenlignet i tabell 2. Hvis konsentrasjonen av DNA kan kvantifiseres, bruk mellom 1-10 ng genomisk DNA.
- Visualisering av resultater
- Hvis de utføres i en laboratorieinnstilling, kan du vise forsterkningsproduktene ved å laste 5 μL av hver prøve i en 1% agarose gel, kjøre dem i en gelelektroforesemaskin og forestille dem i en UV-bildemaskin.
- Hvis et fargestoff (f.eks. Warmstart) ble brukt, kan du se fargeendringen for å bestemme resultatene som positive eller negative.
- Hvis et bærbart forsterkningsinstrument (f.eks. Genie III) ble brukt, kan du vise forsterkningsgrafen på skjermen for å fastslå resultatene.
- Anvendelse av tidligere utviklet PCR-analyse
MERK: Hvis du bruker en vanlig PCR-analyse, forblir trinn 1-3 de samme, og følgende trinn skal brukes i stedet for trinn 1.4 og 1.5.- Tilsett 1 μL av hver DNA-ekstraksjon til individuelle rør som inneholder følgende komponenter: 12,5 μL grønn PCR-masterblanding, 9,5 μL ddH2O og 1 μL fremover- og revers primere (tabell 2).
- Spinn ned hver prøve ved hjelp av en mikrocentrifuge og plasser rør i en termisk cycler.
- Bruk følgende termiske syklusinnstillinger i henhold til tidligere publikasjoner: 94 °C i 5 min, 30 sykluser med denning ved 94 °C i 30 s, gløde ved 54 °C i 30 s, forlengelse ved 72 °C i 1 min, og endelig forlengelse ved 72 °C i 10 min.
- Kjør produktet i en 1% agarose gel. Vær oppmerksom på tilstedeværelsen av bånd under UV-lys der positive reaksjoner vil ha en båndstørrelse på ~ 508 bp.
- Tradisjonell metode for deteksjon
MERK: Det finnes flere metoder for selektiv plating for patogendeteksjon, og følgende er en generell protokoll for P. capsici.- Først få en sunn aubergine frukt (en utsatt vert for P. capsici) og overflaten sterilisere ved å vaske fruktoverflaten med 70% isopropylalkohol.
- Legg auberginefrukten i melkekasser med en flyteenhet (polyetylenskum eller annet) og distribuer i vanningsdammer. Fest hver agnfelle til et enkelt punkt og la fellene i vannbeholderen (resirkulert vanningsvann) i minst 7 dager eller til fruktråte symptomer observeres. Samle frukten og transportere den til laboratoriet.
- Skyll og tørk frukten i en steril hette før du fjerner små biter av infisert vev og legg dem på en tallerken parph medium endret med 25 mg / L pentachloronitrobenzene, 0,0005% pimaricin, 250 mg / L ampicillin, 10 mg / L rifampicin og 50 mg / L hymexazol. Inkuber plater ved 25 °C i 5 dager.
- Vis plater under et sammensatt mikroskop for tradisjonell morfologisk identifikasjon 4 dager etter isolasjon.
2. Bestemme deteksjonsgrensen for zoosporekonsentrasjon
- Gjør zoospore suspensjon
- Inkuber P. capsici på V8 agar (100 ml V8 juice, 900 ml ddH2O, 1 g CaCO3) plater i 1 uke ved 26 °C. Flere plater kan brukes til å få en større mengde dyrespor suspensjon.
- Inkuber platene under kontinuerlig lys ved romtemperatur i 3 dager for å stimulere sporulering.
- Oversvømme platene ved å tilsette 15 ml ddH2O til hver plate og legg dem i et 4 °C kjøleskap i 25 min. Deretter går du tilbake til romtemperatur i 30 min.
- Agitate plater for å løsne zoospores og pipette løsningen i en enkelt 50 ml rør fra alle platene.
- For å oppnå et nøyaktig estimat av zoosporekonsentrasjon, tilsett 10 μL av sporesuspensjonen på et hemocytometer og observer under et mikroskop for å telle dyrespor og estimere den gjennomsnittlige konsentrasjonen.
- Seriell fortynning
- Tilsett 1 ml av sporfjæringen og 9 ml ddH2O i et separat rør. Gjenta dette trinnet for så mange 10-ganger fortynninger som ønsket.
- Sporeløsninger sendes deretter inn for DNA-ekstraksjon basert på den forrige protokollen ved hjelp av filtreringsmetoden.
MERK: Hvis det er ønskelig med et større volum suspensjon, dobler du volumet: 2 ml sporfjæring og 18 ml ddH2O.
- Påvisning av konsentrasjonsgrense for dyrespore
- Evaluer spordeteksjonsgrensen ved å kjøre hver seriell fortynning individuelt gjennom analysen til klart positive resultater ikke lenger observeres. Når den endelige fortynningen er oppnådd, fortynnes med en faktor på 2 (4,8 til 2,4 i dette eksemplet) og kjører analysen igjen for å få en mer nøyaktig deteksjonsgrense.
- Utvikling og optimalisering av LAMP-metoden
MERK: LAMPe primere ble designet basert på et 1121-base par (bp) fragment av P. capsici (Li et al.19) som vist i supplerende figur 2.- Hvis kolorimetrisk fargestoff (f.eks. Varmstart) brukes, bruk følgende oppløsning: 2,5 μL primerblanding, 12,5 μL kolorekmetrisk fargestoff, 0,5 μL grønt fluorescerende fargestoff, 1 μL ekstrahert DNA og 8,5 μL ddH2O. Det totale volumet er 25 μL.
- Når du bruker det bærbare forsterkningsinstrumentet med LAVALAMP mastermix, har du et første trinn på 95 °C i 3 min som anbefalt av produsenten, men dette er ikke nødvendig. Et siste glødetrinn er ikke nødvendig for å observere fargeendrings- eller forsterkningsgrafen. Ikke kjør et warmstart-trinn hvis det kommersielle fargestoffet skal brukes.
- Vis LAMP-analyse resulterer i en av følgende metoder: kjør prøver på en 1% agarose gel eller se ved hjelp av en UV-bildemaskin med det blotte øye eller visning på Genie III sanntidsforsterkningsskjermen.
- Optimaliser temperaturen på LAMP-analysen ved hjelp av det bærbare forsterkningsinstrumentet og analysert ved hjelp av sanntidsforsterkningsgrafen for hastighet og følsomhetsnivå. Kjør prøver med unike temperaturer for å bestemme den raskeste forsterkningen med det høyeste følsomhetsnivået.
- Bestem deteksjonsgrensen for LAMP-analysen som er utviklet ved å lage en seriell fortynning av ekstrahert DNA (som med sporsuspensjon i trinn 2.2.1) og opprettholde reaksjonsforhold som tidligere beskrevet for LAMP-reaksjonen for hver fortynning.
- Bestemmelse og sammenligning av deteksjonsgrense med konvensjonell PCR-metode
- Bruk DNA ekstrahert i trinn i avsnitt 1.3 for å sammenligne deteksjonsnivået til konvensjonell PCR med LAMP-analysen.
- Tilsett 1 μL DNA i et PCR-rør som inneholdt 1 μL av både forover og bakover PCR primere (tabell 2),12,5 μL grønn PCR Mastermix og 9,5 μL ddH2O for totalt 25 μL.
- Forsterk prøver i en termisk cycler ved hjelp av følgende forhold: 94 °C i 5 min, 30 sykluser med denning ved 94 °C i 30 s, gløde ved 54 °C i 30 s, forlengelse ved 72 °C i 1 min, og endelig forlengelse ved 72 °C i 10 min.
- Kjør prøver i en elektroforesemaskin på en 1% agarose gel og se på en UV-bildemaskin. Den unntatte båndstørrelsen var 508 bp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optimalisering av LAMP-metoden
I denne studien oppdaget vi tilstedeværelsen av Phytophthora capsici i vanningsvann ved hjelp av en bærbar sløyfemediert isotermisk forsterkning (LAMP) analyse. Først ble den foreslåtte LAMP-analysen optimalisert ved å teste forskjellige LAMP-primerkonsentrasjoner [F3, B3 (0,1–0,5 μM hver); LF, LB (0,5–1,0 μM hver) og FIP, BIP (0,8–2,4 μM hver)], varigheter (30–70 min) og temperaturer (55–70 °C). Den endelige LAMP primerblandingen som ble brukt i denne studien var: 0,2 μM av hver F3- og B3-primer, 0,8 μM av hver Loop-F- og Loop-B-primer, 1,6 μM av hver FIP- og BIP-primer. Optimalisering av reaksjonstemperatur ble utført i det bærbare forsterkningsinstrumentet (f.eks. Genie III) ved å bestemme hvilken temperatur som utførte den raskeste reaksjonen uten ytterligere negativ forsterkning. Den optimale temperaturen ble bekreftet å være 64 °C (data vises ikke). Den optimale tiden for å kjøre analysen ved 64 °C var 45 min, da de laveste konsentrasjonene som var positive for deteksjon (1,2 x 102 sporer/ml) fortsatt forsterket med 40 min, mens høyere konsentrasjoner forsterket ved 20 min (figur 2D). De forsterkede LAMP-produktene ble ytterligere observert på 1% agarose gel farget med en nukleinsyre flekk for å bekrefte forsterkning. Alle reaksjonene ble gjentatt minst tre ganger.
Isolater av P. capsici ble tatt fra Tennessee, Florida og Georgia og ble sendt til samme protokoll som er beskrevet i metodene. Alle prøver av P. capsici isolater ble forsterket med hell i alle kjøringer av analysen (figur 3).
Deteksjons- og sensitivitetstesting av Phytophthora capsici i vanningsvann ved hjelp av bærbar LAMP-analyse
Vi standardiserte denne filterpapirbaserte LAMP-metoden under laboratorieforhold ved hjelp av en seriell fortynning av P. capsicispor suspensjoner (figur 1). Seriell fortynninger ble laget av en P. capsici spore suspensjon starter på 4,8 x 104 zoospores / ml og kjøre med LAMP analyse i triplicate. Sporekonsentrasjoner er vist i stedet for DNA-konsentrasjon på grunn av metoden som er involvert for DNA-ekstraksjon. CTAB DNA-ekstraksjon av den høyeste sporekonsentrasjonen var 4,5 ng/μL målt ved Nanodrop, og den magnetiske perlen DNA-ekstraksjonsprotokollen ga 3,8 ng/μL26. Det nydesignede LAMP-primersettet kunne oppdage en konsentrasjon så lavt som 1,2 x 102 sporer/ml (figur 2B, 2C og 2D) med alle ekstraksjonsmetoder. Følsomheten som vises i forsterkningsgrafen på det bærbare forsterkningsinstrumentet var identisk med det som vises i UV-bildet uten ekstra følsomhet. Den samme seriell fortynning ble kjørt i en LAMP-reaksjon ved hjelp av det kolorimetriske fargestoffet for å bestemme følsomhetsnivået for det blotte øye for feltdeteksjon. Den laveste observerbare konsentrasjonen var 4,8 x 103 sporer/ml (figur 2C).
For å evaluere muligheten for denne analysen ved hjelp av virkelige prøver, ble vannprøver samlet inn fra syv dammer som brukes til kommersiell grønnsaksproduksjon i Tift County, Georgia (Tabell 1, Figur 5og Supplerende figur 1). Av de 7 dammer viste 3 positive LAMP-resultater (P1, P4 og P6) (figur 6A, 6B og 6C). Disse resultatene tyder på at den bærbare filterpapirbaserte LAMP-metoden kan være svært nyttig for påvisning av patogenet selv med lav zoosporekonsentrasjon. Dette demonstrerer lampens anvendelighet som en mer følsom deteksjonsanalyse enn PCR for screening av vanningsvannkontaminering av P. capsici.
Komparativ analyse av ulike metoder: Tradisjonell baiting, konvensjonell PCR og den bærbare LAMP-baserte analysen
For å sammenligne deteksjonsfølsomheten til LAMP med konvensjonell PCR, ble DNA ekstrahert fra seriell fortynning av spore suspensjoner kjørt i en PCR-reaksjon. Resultatene viste at konvensjonell PCR var 40x mindre følsom enn LAMP, bare i stand til å oppdage en zoospore konsentrasjon så lavt som 4,8 x 103 sporer / ml (figur 2A). I tillegg ble DNA-prøvene hentet fra filtrert vanningsdamvann testet ved hjelp av konvensjonell PCR, og bare en av de tre positive prøvene (P4) ble vellykket forsterket som forventet båndstørrelse pluss betydelige forurenser som resulterte i noen smøring og uspesifiserende bånd (figur 6D). Tabell 3 viser forskjellene mellom registreringsmetoder ved hjelp av slike variabler som tid, kostnader, følsomhet og forberedelse som kreves. LAMP var den billigste metoden blant disse tre metodene, og det var også den raskeste, alt fra 30-60 min for forsterkning (DNA-ekstraksjon ekskludert). Konvensjonell PCR varierte fra 120-180 min for forsterkning (DNA-ekstraksjon ekskludert).
Til slutt, for å bestemme spesifisiteten av primere, prøver av nært beslektede oomycete patogener (Phytophthora sansomeana, Phytophthora sojae, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora palmivora, Pythium ultimum var. ultimum, Phytopythium vexans, Phytopythium helicoides, og Pythium aphanidermatum) ble oppnådd, DNA ble ekstrahert ved hjelp av samme protokoll for konsistens og evaluert av den nye LAMP-analysen med en positiv og negativ kontroll (Figur 4) for å bestemme spesifisitet av primerne. Alle ikke-målprøver var negative ved hjelp av den optimaliserte 64 °C i 45 min. Dette ble observert på sanntidsforsterkningsgrafen og avbildet på en 1% agarose gel under UV-lys.
Figur 1: Diagram som viser de forskjellige trinnene som er involvert i Phytophthora capsici fra en seriell fortynning av en konsentrert spor suspensjon under laboratorieforhold. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Laboratorieoptimalisering av grensen for påvisning av Phytophthora capsici. (A)Konvensjonell PCR analyse ble utført ved hjelp av spesifikke P. capsici primere på seriell fortynning faktorer og visualisert på 1% agarose gel. 1, Stige; henholdsvis 2-7, 4,8 x10 4,4,8 x10 3,4,8 x 102,2,4 x 102,1,2 x10 2 sporer/ml og 7, negativ vannkontroll. (B) LAMP analyse seriell fortynning faktorer visualisert på 1% agarose gel. 1-6, en avtagende spore konsentrasjon: 4,8 x 104, 4,8 x 103,4,8 x 102,2,4 x 102, 1,2 x 102 sporer / ml, og 7, negativ vannkontroll. (C) LAMP-resultater visualisert ved hjelp av det kolorimetriske fargestoffet. 1-6, en avtagende spore konsentrasjon: 4,8 x 104, 4,8 x 103,4,8 x 102,2,4 x 102, 1,2 x 102 sporer / ml, og 7, negativ vannkontroll. (D) LAMP-resultater visualisert på forsterkningsgrafen. Rød = 4,8 x 104, Mørkeblå = 4,8 x 103,Oransje = 4,8 x 102, Lyseblå = 2,4 x 102, Grønn = 1,2 x 102 sporer / ml, Pink = Negativ kontroll (andre fytophthora arter), Gul = ddH2O. (E) En standardkurve som viser kvantifisering av verdiene som vises i sanntidsresultatene. Ln (spore count) vises på X-aksen, og minutter til forsterkning på Y-aksen. (F) LAMP analyse med publisert primer (Dong et al. 2015) på serielle fortynningsfaktorer visualisert på 1% agarose gel. 1-6, en avtagende spore konsentrasjon: 4,8 x 104, 4,8 x 103,4,8 x 102,2,4 x 102, 1,2 x 102 sporer / ml, og 7, negativ vannkontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forsterkning av P. capsici DNA fra ulike steder. (A) LAMPe resultater visualisert på 1% agarose gel. 1, PC_TN1; 2, PC_TN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2; N, Negativ kontroll. Prøve 1 og 2 ble isolert fra TN; prøver 3 og 4 isolert fra FL; prøver 5 og 6 ble isolert fra GA. (B) Resultatene visualisert ved hjelp av det kolorimetriske fargestoffet. 1, PC_TN1; 2, PCTN2; 3, PC_FL1; 4,PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2. (C) Resultater visualisert på forsterkningsgrafen. Rød, PC_TN1; Oransje, PCTN2; Gul, PC_FL1; Grønn, PC_FL2; Mørk blå, PC_GA1; Lys blå, PC_GA2; Rosa, negativ kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Spesifisitetsbestemmelse av LAMP-analyse ved hjelp av DNA fra ikke-målarter P. capsici. (A) LAMP analysereaksjon med relaterte ikke-målarter på agarose gel og visualisert på 1% agarose gel. L, Stige; 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Fytopythium vexans; 7, Negativ kontroll; 8, Phytophthora capsica. (B) LAMP resultater visualisert ved hjelp av den kolorimetriske fargestoff. 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Phytophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Fytopythium vexans; 7, Negativ kontroll; 8, Phytophthora capsici (C) LAMP resultater visualisert på forsterkning grafen. Rød = Phytophthora capcisi, alle andre ikke-mål arter prøver ble ikke forsterket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bilder som viser prøvetaking og behandling av resirkulert vann for påvisning av Phytophthora capsici i feltet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Resultater fra påvisning av Phytophthora capsici i vanningsvannkilder. AA) Agarose gel viser resultater fra LAMP forsterkning av testet vann fra syv gård i Sør-Georgia. Eksempelnavn fra venstre til høyre: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Negativ kontroll, N. (B) LAMP-resultater visualisert ved hjelp av warmstart colorimetric fargestoff av feltprøver: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Negativ kontroll, N. (C) Resultater fra LAMP forsterkning av feltprøver ved hjelp av graf. Rød: P1, Grønn: P2, Lilla: P3, Gul: P4, Blå: P5, Oransje: P6, Rosa: P7, Negativ kontroll, N. (D) Agarose gel som viser konvensjonelle PCR-resultater av forsterkningen ved hjelp av spesifikke primere PC-1/PC-2 (merk enn bare ett nettsted testet positivt i forhold til tre i LAMP). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn på dam | Fylke, delstat | Mål avlinger for vanning | PCR-deteksjon | LAMPE-deteksjon | Sykdomshistorie (Y/N) |
| P1 (andre personer) | Tift, GA | Grønnsaker og grønnsaker | | + | N |
| P2 (andre personer) | Tift, GA | Grønnsaker og grønnsaker | - | - | N |
| P3 (andre personer) | Tift, GA | Grønnsaker og grønnsaker | - | - | N |
| P4 | Tift, GA | Grønnsaker og grønnsaker | + | + | N |
| P5 (andre personer) | Tift, GA | Grønnsaker og grønnsaker | - | - | N |
| P6 | Tift, GA | Grønnsaker og grønnsaker | - | + | N |
| P7 | Tift, GA | Grønnsaker og grønnsaker | - | - | N |
Tabell 1: Påvisning av vanningsvann fra Southern GA.
| Primer type | Primer navn | Sekvens 5'-3' | Kilde | ||
| Lampe | 2009– 2015: 100 000 | TGTGTGTGTTCGATCACA | Denne studien | ||
| 3000-000 000 000 0 | TTTTTGCGTGCGTCCAGA | Denne studien | |||
| PCA3-FIP | GACACCAAGCACTCGTACTOGTTTTTACAATTGTGCAGAGGGAGGA | Denne studien | |||
| PCA3-BIP | AGAACGAGTATTCGGCGGCGTTTTGAAAAAGGACCACCCCCG | Denne studien | |||
| PCA3-LF | TGTCGAATGGATTTGCGATCTT | Denne studien | |||
| PCA3-LB | ATACGCAGGTCATTTGACTGAC | Denne studien | |||
| Pcr | P.P.P.-P.-P.-- | GTCTTGTACCCTATCATGGCG | Zhang et al., 2006 | ||
| Pc-2 | CGCCACAGIGAAAAGCATT | Zhang et al., 2006 | |||
Tabell 2: Primere som brukes i denne studien.
| Parametere | Tradisjonelle | Konvensjonell PCR | Lampe |
| Følsomhet | Na | 4,8 X 102 sporer/ml | 1,2 X 102 sporer/ml |
| Tid | 2 uker eller lenger | 2-3 timer (ikke inkludert DNA-ekstraksjon) | 30 min - 1 time (ikke inkludert DNA-ekstraksjon) |
| Forberedelse | • Oppretting av medier • Plating og isolasjon og • Utforme en felle |
• Sporsamling ved hjelp av filterpapir • DNA-ekstraksjon og • PCR-analyse |
• Sporsamling ved hjelp av filterpapir • DNA-ekstraksjon og • LAMP-analyse |
| Materialer | • Autoklav • Medier og plater • Inkubasjonsrom • Strømningshette • Aubergine • Melk kasse |
• Termisk cycler • Agar gel • Gel Doc |
• Varmeblokk eller • Genie III |
| Kostnad | $ 5,00 per felle | $ 0,60 per reaksjon | $ 0,75 per reaksjon |
Tabell 3: Sammenligning av metoder for påvisning av P. capsici.
Supplerende figur 1: Plassering av Tift County, GA og prøver av vanningsvann tatt fra ulike steder fra staten. Positive prøver ble vist som røde prikker. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfigur 2: Design av LAMP primer sett. Piler viser retning av hvordan primere leses. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Testing av vanning vann for fytopathogens er et avgjørende skritt for dyrkere ved hjelp av vanning dammer og resirkulert vann27. Vanning dammer gir et reservoar og avlsmiljø for en rekke fytopatogener som overflødig vanning vanning vann er rettet fra feltet til dammen bærer med seg noen patogener som kan ha vært tilstede 16,27. Den tradisjonelle metoden for påvisning av plantepatogener i en stor vannkilde er å sette en agn for patogenet ved hjelp av mottakelig vertsvev (f.eks. frukt, blader) suspendert i dammen og vente på at en infeksjon skal finne sted, fjern deretter frukten / bladene og bekreft diagnosen med mikroskopi ellermolekylære metoder 13,14. Disse metodene begrenser på grunn av hvor lang tid det tar å kjøre deteksjonstesten (2 uker eller lenger), og arbeids- og utstyret som kreves. I tillegg kreves lang erfaring og kunnskap i visuell diagnose, patogenmorfologi og taksonomi for nøyaktige resultater. Molekylære teknikker som PCR, qPCR og DNA hybridisering krever betydelig mindre tid (3-4 h) enn de tradisjonelle metoder for deteksjon; De krever imidlertid dyrt utstyr og en laboratorieinnstilling. I tillegg tillater disse teknikkene ikke behandling av store mengder vann. Serologiske analyser også, kommer til kort i deres deteksjonsevne på grunn av ikke-målrettede positive reaksjoner, og ingen artsspesifikke analyser for fytophthora arter er utviklet. Loop-mediert isotermisk forsterkning (LAMP) har nylig blitt brukt som en diagnoseteknikk på stedet for rask og følsom påvisning av flere patogener, da analysen bare krever en enkelt temperatur i stedet for en termisk cycler28,29. LAMP kan kjøres i feltet ved hjelp av et kolorimetrisk fargestoff for visuell bekreftelse eller bruk av en forsterkningsmaskin i sanntid for resultater på mindre enn en time30.
Målet med dette eksperimentet var å utvikle en rask og følsom metode for å oppdage tilstedeværelsen av Phytophthora capsici i vannkilder enten på stedet eller i et laboratorium. For å øke hastigheten på deteksjon og for å bekjempe begrensningene til de tidligere nevnte metodene for å oppdage P. capsici i vanningsvann, designet vi en metode ved hjelp av filterpapir for å fange sporene og trekke ut deres DNA fra et større volum vann. Etter at sporer ble fanget ved hjelp av filterpapirteknikken og DNA ble ekstrahert, ble tilstedeværelsen av patogenet bekreftet basert på et nydesignet LAMP-primersett som er spesifikt for P. capsici. Deteksjonsfølsomhet og spesifisitet ble sammenlignet med LAMP og PCR. I alle 3 replikeringer og med alle zoosporekonsentrasjonene var LAMP en raskere og mer følsom deteksjonsmetode (tabell 3). Denne metoden er ikke begrenset ved å ha et lite prøvevolum som tradisjonelle metoder, da denne metoden kan testes opptil 1 l vann om gangen, noe som øker sjansene for patogendeteksjon. Det ble bemerket i testing at helle vanning vanning vann sakte gjennom Buchner trakten med en hastighet på ikke mer enn 40 ml per sekund økt spore fangst evne av filterpapir.
For å validere deteksjonsprotokollen ble det også tatt vannprøver fra feltet der P. capsici var til stede (Supplerende figur 1) for å teste den utformede metoden med et praktisk scenario. Av de 7 gårdene som ble testet, var 3 positive for tilstedeværelsen av P. capsici ved hjelp av LAMP-analysen (figur 6A-6C), mens bare én gård var positiv ved bruk av den konvensjonelle PCR-analysen (figur 6D), som viser LAMP som en mer følsom analyse for denne metoden for testing av vanningsvann. Selv om denne filterbaserte LAMP-analysen kunne oppdage DNA fra en konsentrasjon så lavt som 1,2 x 102 zoospores / ml som var betydelig mindre enn den opprinnelige følsomheten til denne analysen (0,01 ng genomisk DNA tilsvarende ~ 5 sporer) med ufiltrert zoospore suspensjon. Den forrige LAMP-analysen fra Dong et. al. (2015)20 ble kjørt på samme seriell fortynning og følsomhetsnivået var det samme (figur 2F). Nivået på deteksjon for en PCR-analyse med ufiltrert sporeløsning har også vist et høyere nivå av deteksjon (tilsvarende ~ 10 sporer) som var svært lik de tidligere PCR-basertefunnene 10. Sporedeteksjonsgrensen for den tradisjonelle baiting metoden for deteksjon ble ikke sjekket som en enkelt spore kan forårsake infeksjon avhengig av dens individuelle evne. Den reduserte følsomheten som finnes i både LAMP- og PCR-analysene skyldes sannsynligvis noen sporer som strømmer gjennom eller rundt filterpapiret, eller når det er festet til filterpapiret, ikke kan ekstraheres med 100% effektivitet. Likevel kan dette nye LAMP- og filtersystemet behandle og analysere et mye høyere volum vann enn tidligere metoder og gir et høyere nivå av spesifisitet og hastighet for in-field deteksjon.
Av ekstraksjonsmetodene som ble brukt, var magnetisk perlebasert ekstraksjon den raskeste og krevde ikke bruk av eksterne maskiner som en perlebeater eller sentrifuge som gjør det nyttig for in-field ekstraksjoner og komplimenterer den bærbare funksjonen til LAMP-analysen. Den CTAB-baserte metoden ga den høyeste konsentrasjonen av DNA, men tok lengst tid, mens det kommersielle plante-DNA-ekstraksjonssettet (f.eks. DNeasy) var nummer to i både tid som kreves og DNA-konsentrasjonen ervervet.
Med både CTAB og det kommersielle anlegget DNA ekstraksjon kit, under homogenisering av filterpapir ble det bemerket at homogenisering var mer vellykket og ga en høyere konsentrasjon hvis CTAB løsning (eller ekstraksjon buffer) ble lagt til røret med biter av filterpapir før perle slo eller hånd homogenisering startet. Perleslag ble gjort 3 ganger i ett minutt hver, men vortexing og agitating røret mellom hver runde var nødvendig for fullstendig homogenisering i alle utvinningsmetoder. Viktigere, filterpapiret er gjenstand for å bli sittende fast på sidene eller bunnen av røret, så det er viktig å sørge for at filterpapiret er av veggene slik at det blir homogenisert.
Den totale tiden som kreves for forsterkning er 90-120 min og kan enkelt gjøres i feltet for diagnose på stedet. Denne filtermetoden er også utformet for å filtrere betydelige mengder vann for å øke mulige sjanser for påvisning av patogenet. Denne metoden gjelder også for mange patogener som kan akkumuleres i en vannkilde, spesielt slekter som Pythium, Phytophthora, Fusariumog bakterier; den eneste endringen som kreves vil være utviklingen av en like spesifikk LAMP primer sett for målrettet patogen30.
En betydelig utgang av dette arbeidet er utviklingen av en svært følsom og rask filterpapirbasert LAMP-analyse for påvisning av P. capsici i vanningsvannkilder. Vi forventer at denne studien vil føre til en økning i bevisstheten om forurensning av resirkulert vanningsvann, til slutt forbedre forvaltningen av Phytophthora assosierte sykdommer, og dermed redusere produksjonskostnadene og øke avlingsutbyttet. Slik informasjon er svært nødvendig for å forbedre vegetabilsk produksjon bærekraft og øke lønnsomheten av vegetabilske produksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre eller noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet fikk økonomisk støtte fra Georgia Commodity Commission for Vegetables prosjekt ID # FP00016659. Forfatterne takker Dr. Pingsheng Ji, University of Georgia og Dr. Anne Dorrance, Ohio State University for å gi rene kulturer av Phytophthora spp. Vi takker også Li Wang og Deloris Veney for deres tekniske hjelp gjennom hele studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
