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Immunology and Infection

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में कैंडिडा एल्बिकान हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक पूर्व वीवो परख

Published: July 1, 2020 doi: 10.3791/61488
Automatic Translation
1, 2, 3
1College of Veterinary Medicine, Midwestern University, 2Masters in Biomedical Science Program, College of Graduate Studies, Midwestern University, 3Department of Pathology and Population Medicine, College of Veterinary Medicine, Midwestern University

Summary

इस अध्ययन में आंत समरूप अर्क और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग का उपयोग करके वर्णित पूर्व वीवो परख जीआई पथ में कैंडिडा एल्बिकान के हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस की जांच करने के लिए एक उपन्यास विधि का प्रतिनिधित्व करती है। इस विधि का उपयोग आंत में मॉर्फोजेनेटिक संक्रमण को विनियमित करने वाले पर्यावरणीय संकेतों की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ में कैंडिडा एल्बिकान हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को विभिन्न पर्यावरणीय संकेतों द्वारा कसकर नियंत्रित किया जाता है, और इस अवसरवादी कवक रोगजनक के प्रसार और रोगजनकता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, वीवो में जीआई ट्रैक्ट में फंगल हाइफा की कल्पना करने के तरीके चुनौतीपूर्ण हैं जो इस मॉर्फोजेनेसिस प्रक्रिया को नियंत्रित करने में पर्यावरणीय संकेतों की समझ को सीमित करते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल आंत समरूप अर्क में हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस के दृश्य के लिए एक उपन्यास पूर्व वीवो विधि को दर्शाता है। एक पूर्व वीवो परख का उपयोग करना, इस अध्ययन से पता चलता है कि एंटीबायोटिक इलाज चूहों से cecal सामग्री, लेकिन अनुपचारित नियंत्रण चूहों से नहीं, आंत सामग्री में सी एल्बिकान हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को बढ़ावा देने । इसके अलावा, एंटीबायोटिक-इलाज चूहों से सीकल सामग्री के लिए आंत मेटाबोलाइट्स के विशिष्ट समूहों को जोड़ने से हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पूर्व वीवो को नियंत्रित करता है। एक साथ लिया गया, यह प्रोटोकॉल जीआई ट्रैक्ट में सी एल्बिकन हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाले पर्यावरणीय संकेतों की पहचान करने और जांच करने के लिए एक उपन्यास विधि का प्रतिनिधित्व करता है।

Introduction

कैंडिडा एल्बिकान एक अवसरवादी, बहुरूपी फंगल रोगजनक है जो सामान्य रूप से अनुकूल होता है, लेकिन इम्यूनोसमझित व्यक्तियों1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13में जीवन-धमकी भरे संक्रमण पैदा करने में सक्षम एक उग्र रूप में एक रूपात्मक परिवर्तन से गुजरना पड़ सकता है। सी एल्बिकैन प्रणालीगत नोसोकोमियल संक्रमणों का एक प्रमुख कारण है, जिसमें एंटीफंगल उपचार 2, 14,15के साथभी 40\u201260%मृत्यु दर है। हालांकि सी एल्बिकन महिला प्रजनन प्रणाली16, 17सहित विभिन्न मेजबान निकस में रहता है, स्वस्थ व्यक्तियों की मौखिक गुहा18 और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ19,20,अधिकांश प्रणालीगत संक्रमण जीआई पथ से उत्पन्न होते हैं और इसके अलावा, प्रणालीगत संक्रमण के स्रोत की पुष्टि अक्सर जीआई ट्रैक्ट21, 22,23,24, 25,26,27,28,29,30, 31,33,33,34से की जाती है । जीआई पथ में सी एल्बिकान रोगजनकता कारकों की एक विस्तृत श्रृंखला से प्रभावित होती है; हालांकि, उग्रता के लिए आवश्यक एक प्रमुख विशेषता खमीर कोशिका आकृति विज्ञान से उग्र हाइथल सेल आकृति विज्ञान 35,36,37,38,39,40,41,42,43,44में संक्रमण है । संक्रमण के दौरान जीआई पथ सेसी एल्बिकान अटैचमेंट और प्रसार अत्यधिक एक अनुकूल खमीर से उग्र हाइफा में संक्रमण करने की क्षमता से जुड़ा हुआ है, जिससे कवक को आक्रामक रोग44,45, 46, 47,48,49,50, 50,52,53होता है।

आंत में कई कारक, जिनमें एन-एसिटिलग्लूकोसामाइन शामिल हैं, सी एल्बिकानद्वारा हाइफाल गठन को विनियमित करते हैं। इसलिए , जीआई पथ54 , 55,56में इस फंगल रोगजनक के हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस के बारे में ज्ञान में अंतर को कम करना महत्वपूर्ण है । हाल के साक्ष्य ों से पता चलता है कि विभिन्न आंत मेटाबॉलिज् म विट्रो57 , 58,59,60में सी एल्बिकान के हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को अलग तरह सेनियंत्रितकरते हैं। हालांकि, तकनीकी बाधाओं के मुद्दों को मौजूद है जब वीवो आंत के नमूनों में सी एल्बिकन हाइफाई गठन का अध्ययन करने का प्रयास, विशेष रूप से खमीर और हाइफाई कोशिकाओं और हाइफल विकास के मात्रात्मक विश्लेषण को धुंधला करना। जीआई पथ में सी एल्बिकैन हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को समझने के लिए, फंगल हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पर मेटाबोलाइट्स के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए चूहों से समरूप आंत सामग्री के घुलनशील अर्क का उपयोग करके एक पूर्व वीवो विधि विकसित की गई थी। चूहों से आंत के नमूनों का उपयोग करना जो प्रतिरोधी हैं और सी एल्बिकन जीआई संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील हैं, यह विधि जीआई ट्रैक्ट में फंगल हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पर मेटाबोलाइट्स, एंटीबायोटिक्स और ज़ेनोबायोटिक्स के प्रभाव की पहचान करने और अध्ययन करने में मदद करेगी।

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल मिडवेस्टर्न विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित के रूप में५७से पहले वर्णित थे । मिडवेस्टर्न विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति ने #2894 MWU IACUC प्रोटोकॉल के तहत इस अध्ययन को मंजूरी दी । MWU पशु देखभाल नीतियां मानवीय देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग और पशु कल्याण अधिनियम (AWA) में निर्धारित नीतियों पर सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा (PHS) नीति का पालन करें ।

1. चूहों अध्ययन मानक प्रोटोकॉल

  1. पुरुष और महिला C57BL/6J चूहों का उपयोग करें कम से छह सप्ताह पुराने । उन्हें सेफोपेराज़ोन (0.5 मिलीग्राम/एमएल) के साथ या बिना बाँझ पानी के साथ पूरक करें।
    1. सह 5 के समूहों में घर चूहों, प्रत्येक पिंजरे या तो सभी पुरुष या सभी महिला चूहों युक्त के साथ । चूहों मानक माउस चाउ और पानी (एक 400 मिलीएल बोतल के माध्यम से) हर समय प्रदान करें।
    2. भोजन और पानी के स्तर को सुनिश्चित करने के लिए दैनिक पिंजरों की जांच करें, और संकट के संकेतों के लिए चूहों की जांच करें।
  2. पानी को हर 48 घंटे में सेफ़ोपेजोन से बदलें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पिंजरे की फीडिंग बोतलों में शेष पानी की परवाह किए बिना ताजा एंटीबायोटिक प्रदान किया जा रहा है।
  3. सेफोपेराज़ोन उपचार के 5\u20127 दिनों के बाद, स्थापित आईएसीयूसी प्रोटोकॉल को देखते हुए सीओ2 एस्फिक्सेशन के माध्यम से चूहों को इच्छामृत्यु दें। सर्वाइकल अपभ्रंश के माध्यम से मौत की पुष्टि करें।
  4. ऑटोक्लेव-निष्फल तेज समाप्त कैंची और ऑटोक्लेव-निष्फल संदंश का उपयोग कर चूहों को विच्छेदन करें।
    1. इच्छामृत्यु के बाद, सभी अंगों को पिन करके जानवर को विच्छेदन सतह पर सुरक्षित करें जैसे कि पेट उजागर हो।
    2. विच्छेदन के दौरान संदंश, कैंची, या आंत वर्गों से चिपके रहने से फर को रोकने के लिए 70% इथेनॉल के साथ पेट क्षेत्र स्प्रे करें।
    3. चुटकी और पेट के आधार पर त्वचा के एक वर्ग उठाने के लिए संदंश का प्रयोग करें और कैंची का उपयोग कर त्वचा और अंतर्निहित प्रावरणी के माध्यम से एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए । सेकम या आंतों की दीवार को पंचर करने से बचने के लिए यह चीरा लगाते समय बहुत ध्यान रखें।
    4. रिब पिंजरे के लिए इस कटौती का विस्तार, आंशिक रूप से पेरिटोनियल गुहा को उजागर । दोनों तरफ प्रारंभिक चीरा के बिंदु पर शुरू एक कटौती ऊपर और पार्श्व विस्तार करें ।
    5. इन फ्लैप्स को बाद में खींचें और पेरिटोनियल गुहा को पूरी तरह से बेनकाब करने के लिए विच्छेदन सतह पर पिन करें।
  5. प्रत्येक खंड से आंत सामग्री की सबसे बड़ी मात्रा का संग्रह सुनिश्चित करने के लिए पेट से बेहतर और बड़ी आंत के डिस्टल क्षेत्र में कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करते हुए, संदंश का उपयोग करके जीआई ट्रैक्ट निकालें।
  6. जीआई ट्रैक्ट को हटाते समय, व्यक्तिगत घटकों को टूटने से बचने का ध्यान रखें। पेट, छोटी आंत, सीकम और बड़ी आंत को व्यक्तिगत रूप से अपने समीपस्थ और डिस्टल सिरों पर कैंची का उपयोग करके अलग करें।
  7. प्रत्येक खंड से प्रत्येक आंत सामग्री के संग्रह के लिए, कैंची का उपयोग कर प्रत्येक खंड के डिस्टल अंत में एक चीरा करें, इसके बाद मैन्युअल रूप से आंत की सामग्री को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में निष्कासित कर दिया गया है।
  8. पूर्व वीवो परख के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर आंत सामग्री स्टोर करें।

2. खमीर निकालने की तैयारी-पेप्टोन-डेक्सट्रोस (वाईपीडी) आगर प्लेटें

  1. एक 1 एल ग्लास बोतल में 25 ग्राम खमीर निकालने पेप्टोन-डेक्सट्रोस शोरबा पाउडर, 10 ग्राम एगर और अल्ट्रापुरे पानी को 500 एमएल की अंतिम मात्रा में जोड़ें।
  2. मीडिया को स्टरलाइज करने के लिए तरल चक्र पर 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव।
  3. एक लैमिनार फ्लो हुड के तहत, एक बाँझ पेट्री प्लेट में आगर मीडिया के लगभग 20 एमएल डालें। आगर मीडिया के 500 एमएल में लगभग 25 प्लेटें निकलनी चाहिए।
  4. उपयोग के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें स्टोर करें।

3. हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस परख के लिए पूर्व वीवो प्रेप

  1. लकीर एक YPD आगर प्लेट पर सी एल्बिकन SC5314 की एक ताजा संस्कृति और 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट ।
  2. रातोंरात उगाए जाने वाले सी एल्बिकान SC5314 संस्कृति से दो से तीन मध्यम आकार की व्यक्तिगत कॉलोनियों को चुनें और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें।
  3. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से जमे हुए आंत सामग्री को पुनः प्राप्त करें और 25 डिग्री सेल्सियस पर गल जाएं।
  4. एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में आंत सामग्री के बारे में 150 मिलीग्राम वजन।
  5. पीबीएस के 150 माइक्रोन के साथ आंत सामग्री को फिर से निलंबित करें (आंत सामग्री और पीबीएस मात्रा अनुपात के लिए 1:1 वजन पर)।
  6. आंत की सामग्री को समरूप बनाने और लगभग एक मिनट तक कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति देने के लिए 30 एस के लिए उच्च गति पर भंवर।
  7. 3 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर समरूपता को अपकेंद्रित्र करें।
  8. सुपरनैंट को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  9. सुपरनैंट में सभी मलबे को हटाने के लिए 3.7 और 3.8 चरणों को दोहराएं।
  10. इस सुपरनैंट के लिए ऊपर तैयार सी एल्बिकान SC5314 इनोकुलम के 10 माइक्रोल जोड़ें
  11. 4 से 5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।

4. हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस परख के लिए आंत समरूप अर्क में मेटाबोलाइट्स का एक्सोजेनस इसके अलावा

  1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से जमे हुए आंत सामग्री को पुनः प्राप्त करें और पीबीएस में 1:1 अनुपात (वजन: मात्रा) पर फिर से निलंबित कर दिया।
  2. आंत सामग्री और पीबीएस मिश्रण में आंत मेटाबोलाइट्स की वांछित एकाग्रता जोड़ें।
  3. मेटाबोलाइट्स युक्त आंत की सामग्री को समरूप बनाने के लिए 30 एस के लिए उच्च गति पर भंवर और लगभग 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति देते हैं।
  4. 3 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर समरूपता को अपकेंद्रित्र करें।
  5. सुपरनैंट को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। सुपरनैंट में सभी मलबे को हटाने के लिए चरण 4.4 और 4.5 दोहराएं।
  6. इस सुपरनेट के ऊपर तैयार सी एल्बिकान SC5314 इनोकुलम के 10 माइक्रोन जोड़ें। 4 से 5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।

5. सी एल्बिकैन मॉर्फोजेनेसिस परख (इम्यूनोदाता और इमेजिंग)

  1. 2 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें और पिपटिंग के माध्यम से सुपरनेट को त्यागें।
  2. 15 मिनट के लिए 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 100 माइक्रोन में नमूनों को ठीक करें।
  3. 2 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और पिपटिंग के माध्यम से सुपरनैट को त्यागें।
  4. पीबीएस के 1 एमएल के साथ दो बार नमूनों को धोएं। नमूनों को धोने के लिए, पीबीएस में गोली को धीरे से पाइपिंग करके फिर से निलंबित करें। नमूना भंवर न करें क्योंकि इससे हाइफाल संरचनाओं को नुकसान पहुंच सकता है। पुनः निलंबन के बाद, 2 मिनट के लिए 1000 x g पर अपकेंद्रित्र करें और पिपटिंग के माध्यम से सुपरनेट को त्यागें।
  5. 30 मिनट के लिए पॉलीक्लोनल सी एल्बिकन एंटीबॉडी (1:100 कमजोर पड़ने) युक्त पीबीएस के 100 माइक्रोन में कमरे के तापमान पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  6. पीबीएस के 1 एमएल के साथ तीन बार नमूनों को धोएं।
    नोट: फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग करते समय, यह सिफारिश की जाती है कि फोटो ब्लीचिंग से बचने और नमूना दीर्घायु में सुधार करने के लिए सभी कमजोर पड़ने और धोने के कदम मंद प्रकाश में किए जाएं।
  7. पीबीएस के 100 माइक्रोन में 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों को इनक्यूबेट करें जिसमें एंटी-रैबिट आईजीजी एलेक्साफ्लूर 488 एंटीबॉडी 1:500 कमजोर पड़ने पर है। फोटो ब्लीचिंग से बचने के लिए अंधेरे दराज या कमरे में इनक्यूबेशन करें।
  8. पीबीएस के 1 एमएल के साथ तीन बार नमूनों को धोएं।
  9. पीबीएस के 100 माइक्रोन में नमूनों को फिर से निलंबित करें और इमेजिंग के लिए 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें।
    नोट: जब छवि नहीं किया जा रहा है, यह सिफारिश की है कि ९६ अच्छी तरह से थाली एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे फोटो विरंजन से बचने के लिए किया जाता है ।
  10. फ्लोरेसेंस इमेजिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 20x और 40x उद्देश्य लेंस का उपयोग करके छवि कवक कोशिकाएं। फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) फिल्टर (एक्सट्रवेंशन वेवलेथ 470/40 और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 525/50) का प्रयोग करें।

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Representative Results

थंगामानी प्रयोगशाला60 से पिछले निष्कर्षों के साथ इन परिणामों से संकेत मिलता है कि जब सी एल्बिकान पेट, छोटी आंतों और अनुपचारित नियंत्रण और एंटीबायोटिक उपचारित चूहों की बड़ी आंतों से लिए गए आंत समरूप अर्क में पूर्व वीवो उगाया जाता है, तो सी एल्बिकान आम तौर पर खमीर आकृति विज्ञान(चित्रा 1B)के साथ विकसित होता है। हालांकि, जब एंटीबायोटिक-इलाज चूहों से सीकल निकालने में उगाया जाता है, तो सी एल्बिकन आसानी से मॉर्फोजेनेसिस से गुजरता है, जिसके परिणामस्वरूप खमीर और हाइफाई रूपों(चित्रा 1 बी)वाले नमूने होते हैं; यह नियंत्रण चूहों में नहीं होता है। यह पिछले परिणामों का समर्थन करता है, जिसने एंटीबायोटिक-इलाज सेकल अर्क में उगाए गए नमूनों में हाइफाई रूपों में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई, लेकिन किसी अन्य एंटीबायोटिक-इलाज आंत अर्क60में नहीं। इन परिणामों से पता चलता है कि एंटीबायोटिक उपचार सीकल वातावरण में परिवर्तन का कारण बनता है, जो सी एल्बिकान के हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करता है। इसके अतिरिक्त, केवल सेकम में देखा गया इस फेनोटाइप के विशिष्ट स्थानीयकरण से यह भी पता चलता है कि ये हाइप-प्रचार करने वाली स्थितियां आवश्यक रूप से जीआई पथ में मौजूद नहीं हो सकती हैं, बल्कि इसके बजाय पोषक तत्वों, मेटाबोलाइट्स और अन्य अज्ञात अणुओं की उपलब्धता के आधार पर जीआई ट्रैक्ट के विशिष्ट खंडों तक सीमित हैं।

चूंकि एंटीबायोटिक-इलाज चूहों का सीकल अर्क सी एल्बिकैन57, 58, 59, 60के मॉर्फोजेनेसिस को बढ़ावा देता है, इसलिए हमने जांच की कि क्या आंत मेटाबोलाइट्स (पिछले इन विट्रो अध्ययनों से पहचाने गए) के चयनित समूह के बहिर्जात जोड़ (पिछले इन विट्रो अध्ययनों से पहचाने जाते हैं) सेफ-इलाज चूहों की सीकल सामग्री सी एल्बिकन्स एक्स वीवो को प्रभावित करेगी। थंगामानी प्रयोगशाला द्वारा किए गए पिछले काम में अनुपचारित और एंटीबायोटिक-इलाज चूहों से निकाले गए सेकल सामग्री समरूप के मेटाबोलोमिक्स प्रोफाइल की विशेषता है, एंटीबायोटिक-उपचार के परिणामस्वरूप विभिन्न मेटाबोलाइट्स की बहुतायत में महत्वपूर्ण परिवर्तनों का खुलासा किया गया है- विशेष रूप से, माध्यमिक पित्त एसिड की बहुतायत में कमी आई और कार्बोहाइड्रेट की बहुतायत60में वृद्धि हुई। इसके अलावा, इस अध्ययन में यह पहचान की गई है कि माध्यमिक पित्त एसिड और कार्बोक्सिलिक एसिड हाइफाई विकास को रोकते हैं, जबकि ग्लूकोज सहित कार्बोहाइड्रेट, विट्रो60में सी एल्बिकान के हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को बढ़ावा देते हैं। परिणामों से संकेत मिलता है कि डिऑक्सीकोलिक एसिड (डीसीए, 0.5 मिलीग्राम/एमएल), लिथोकोकोलोलिक एसिड (एलसीए,) युक्त निरोधात्मक आंत मेटाबोलाइट्स के एक पूल को वापस जोड़ना 0.1 मिलीग्राम/एमएल), पामिटिक एसिड (0.1 मिलीग्राम/एमएल), पी-टॉलीलेसिटिक एसिड (0.1 मिलीग्राम/एमएल), सेबसिक एसिड (0.5 मिलीग्राम/एमएल), 2 -मिथाइलब्यूटिरिक एसिड (0.5 मिलीग्राम/एमएल), और लैक्टिक एसिड (5 मिलीग्राम/एमएल) सेफ-इलाज चूहों के सेकल होमोजेनेट को पूरी तरह से हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पूर्व वीवो को बाधित करता है। दूसरी ओर, सेफ-इलाज चूहों के सीकल समरूप के लिए ग्लूकोज (1 मिलीग्राम/एमएल) के बहिर्जात जोड़ ने एक बड़े पैमाने पर हाइफाल विकास पूर्व वीवो(चित्रा 2B) दिखाया। सामूहिक रूप से, इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि आंत मेटाबोलाइट्स के अलावा सेफ-इलाज चूहों के सेकल समरूप में वापस सी एल्बिकान के मॉर्फोजेनेसिस को नियंत्रित करता है, इस प्रकार पिछले इन विट्रो निष्कर्षों की पुष्टि करता है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि आंत मेटाबोलाइट्स सी एल्बिकन के हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और जीन लक्ष्यों को समझते हैं और इन मेटाबोलाइट्स द्वारा संग्राहक रास्ते को संकेत देते हैं, सी एल्बिकान संक्रमण को रोकने और उनका इलाज करने के लिए नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों के विकास में सहायता करेंगे।

Figure 1
चित्रा 1: पूर्व वीवो परख आंत सामग्री में सी एल्बिकान हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पर सेफोपेराजोन उपचार के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए। (A)प्रोटोकॉल योजनाबद्ध रूपरेखा। (ख)एंटीबायोटिक-उपचारित (शीर्ष पैनल) और गैर-उपचारित (नीचे पैनल) आंत की सामग्री पेट, छोटी आंतों, सीक्यूम्स और C57BL/6J चूहों की बड़ी आंतों से ली गई थी । सी एल्बिकैन SC5314 के साथ टीका लगाने वाली आंत की सामग्री को 4 \u20125 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया था और सी एल्बिकान एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। कोशिकाओं को 40x आवर्धन पर चित्रित किया गया था । प्रतिनिधि छवियों को यहां दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सी एल्बिकान पूर्व वीवो के हाइफे गठन पर सेफ-इलाज चूहों से सीकल सामग्री के लिए आंत मेटाबोलाइट्स के एक्सोजेनस इसके अलावा। (A)प्रोटोकॉल योजनाबद्ध रूपरेखा। (B)डीसीए (0.5 मिलीग्राम/एमएल), एलसीए (0.1 मिलीग्राम/एमएल), पामिटिक एसिड (0.1 मिलीग्राम/एमएल), पी-टॉलेसिटिक एसिड (0.1 मिलीग्राम/एमएल), सेबसिक एसिड (0.5 मिलीग्राम/एमएल) युक्त निरोधात्मक आंत मेटाबोलाइट्स पूल; 2-मिथाइलब्यूटिरिक एसिड (०.५ मिलीग्राम/एमएल), और लैक्टिक एसिड (5 मिलीग्राम/एमएल) या ग्लूकोज (1 मिलीग्राम/एमएल) को वापस सीईएफ-इलाज चूहों की सीकल सामग्री में जोड़ा गया, अच्छी तरह से मिश्रित और 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड करने के लिए एक्स वीवो हाइफे परख । सी एल्बिकैन SC5314 के साथ टीका लगाने वाली सेकल सामग्री को 4\u20125 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया था और सी एल्बिकान एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। कोशिकाओं को 40x आवर्धन पर चित्रित किया गया था । प्रतिनिधि छवियों को यहां दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां वर्णित विधि जीआई पथ में सी एल्बिकान हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पर एंटीबायोटिक, आहार, ज़ेनोबायोटिक और चिकित्सीय प्रभावों के प्रभाव की जांच करने का एक उपन्यास तरीका प्रस्तुत करती है। चूंकि अधिकांश प्रणालीगत संक्रमण जीआईट्रैक्ट21,22, 23,23, 24,25,26,27,28, 29,30, 31,32,33,34 से उत्पन्न होते हैं और हाइफा गठन एक गंभीर उग्रता कारक है जो सी के प्रसार को बढ़ावा देता है। जीआई ट्रैक्ट से एल्बिकान, जीआई ट्रैक्ट में इस मॉर्फोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाले कारकों को समझना रोगजनन तंत्र के बारे में ज्ञान का विस्तार करेगा और उपन्यास उपचार विकल्पों की पहचान करेगा।

जबकि यहां प्रस्तुत विधि अपेक्षाकृत सरल है, नीचे चर्चा की गई कुछ कदमों को महत्वपूर्ण और महत्वपूर्ण के रूप में पहचाना गया था। (i) सी एल्बिकन का प्रारंभिक इनोकुलम कवक के विकास और हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस दोनों के लिए अनुमति देने के लिए इष्टतम होना चाहिए । आंत समरूप अर्क में पोषक तत्वों की सीमित उपलब्धता के साथ, इनोकुलम की उच्च मात्रा फंगल विकास और मॉर्फोजेनेसिस प्रक्रिया को काफी कम कर सकती है। हालांकि, विभिन्न नैदानिक आइसोलित्स और उपभेदों की वृद्धि परिवर्तनीय होने की संभावना है, इस प्रकार विशिष्ट सी एल्बिकान आइसोले के लिए इनोकुलम और इनक्यूबेशन समय का अनुकूलन आवश्यक है। (ii) आंत समरूप अर्क तैयार करते समय कई अपकेंद्रित्र कदम ों को यथासंभव आंत की सामग्री में मलबे को हटाने के लिए महत्वपूर्ण पाया गया । (iii) अपकेंद्री की अपेक्षाकृत कम गति (हाइफाल संरचनाओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए) के कारण, इस प्रोटोकॉल में इम्यूनोस्टेपिंग कदमों के दौरान सेल हानि से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए ।

जीआई ट्रैक्ट में फंगल हाइफा की कल्पना करने के लिए वैकल्पिक तरीकों का उपयोग अतीत में किया गया है, जिसमें प्रत्येक विधि से जुड़े कुछ फायदे और सीमाएं हैं। जीआई पथ में फंगल हाइफा की कल्पना करने के लिए सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट का उपयोग करके एक अपेक्षाकृत उल्लेखनीय विधि हाल ही में एट अल61,62द्वारा प्रदर्शित की गई है। यह वर्तमान में जीआई पथ में सीधे सी एल्बिकन हाइफाए का पता लगाने के लिए उपलब्ध वीवो विधि में एक आशाजनक है, हालांकि इस प्रोटोकॉल की जटिलता इसे तेजी से, बड़े पैमाने पर प्रारंभिक स्क्रीनिंग अध्ययनों के अनुकूल बनाना मुश्किल बनाती है। जीआई ट्रैक्ट में सी एल्बिकन यीस्ट और हाइफाई रूपों को महत्वपूर्ण बनाने के लिए अतीत में पारंपरिक हिस्टोपैथोलॉजी विधियों का भी उपयोग किया गया है। हालांकि, बुनियादी हिस्टोपैथोलॉजी के साथ फंगल कोशिकाओं का अवलोकन और इमेजिंग, और हेमटॉक्सीलिन और इओसिन (एच/ई) दाग चुनौतीपूर्ण बने हुए हैं, क्योंकि कई मानक निर्धारण विधियों में जीआई ट्रैक्ट नमूनों की म्यूकोसल परत को बाधित करने की क्षमता होती है, अक्सर प्रक्रिया में हाइफल संरचनाओं को नुकसान पहुंचाते हैं और संक्रमण63, 64,65,666के दौरान हाइफल सेल आकृति विज्ञान की सापेक्ष बहुतायत पर विरोधाभासी रिपोर्ट का नेतृत्व करते हैं। इस समस्या को हल करने के लिए प्रसंस्करण के दौरान हाइफाई को नुकसान से बचने के लिए यह विधि विकसित की गई थी। इसके अलावा, ऊतक एक्सप्लांट का उपयोग पूर्व वीवो जैविक स्थितियों की जांच करने के तरीके के रूप में किया गया है, हालांकि ये विधियां आम तौर पर सी एल्बिकान67के पालन या आक्रमण क्षमता की जांच के लिए केंद्रित और उपयोगी होती हैं, लेकिन वे आम तौर पर अधिकांश मेटाबोलोमिक्स और माइक्रोबायोम घटकों को भी बाहर कर देते हैं जो वीवो रोगजनकों में योगदान देते हैं। यद्यपि यहां वर्णित पूर्व वीवो प्रोटोकॉल वीवो जीआई वातावरण में पूरी तरह से नकल नहीं करता है जैसा कि पहले61,62वर्णित है, यह कृत्रिम विकास स्थितियों का उपयोग करके इन विट्रो विधियों की तुलना में आंत के वातावरण में सी एल्बिकान मुठभेड़ों के निकटतम संभव स्थितियों को प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग बुनियादी स्क्रीनिंग परख के लिए किया जा सकता है ताकि सी एल्बिकान हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पर जीआई ट्रैक्ट में पर्यावरणीय संकेतों के प्रभाव की पहचान की जा सके। यह विधि छोटे अणु अवरोधकों, उपन्यास एंटीमाइकोटिक्स और मेटाबोलाइट्स सहित यौगिकों के बड़े समूहों के लिए हाइफाल विकास के लिए तेजी से जांच करने की अनुमति देती है, और इसका उपयोग चिकित्सीय उपचारों की स्क्रीनिंग या प्रणालीगत रोग के लिए जोखिम कारकों की पहचान करने में किया जा सकता है। चूंकि सी एल्बिकन जीआई पथ में उपनिवेश करते हैं, इसलिए यह प्रोटोकॉल जीआई ट्रैक्ट के विशिष्ट खंडों में मौजूद पर्यावरणीय संकेतों की पहचान करने में और सहायता करेगा जो एंटीबायोटिक्स, कीमोथेटिक एजेंटों और मधुमेह मेलिटस सहित मेटाबोलिक विकारों वाले रोगियों में हाइफाल मॉर्मोजेनेसिस को नियंत्रित करते हैं। अंततः यहां वर्णित विधि सी एल्बिकान में हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस के त्वरित लक्षण वर्णन के लिए एक तरह से पर्यावरणीय कारकों की एक विस्तृत श्रृंखला पर अनुमति देती है जो वर्तमान इन विट्रो विधियों की तुलना में अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक है और वीवो विधियों में वर्तमान की तुलना में काफी तेज और अधिक संसाधन कुशल है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या हितों के अन्य संघर्ष नहीं हैं ।

Acknowledgments

लेखक मिडवेस्टर्न यूनिवर्सिटी सेलुलर और मॉलिक्यूलर कोर रिसर्च फैसिलिटी से संसाधनों और समर्थन को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 - 10 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-454 Misc
100 - 1000 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-400 Misc
20 - 200 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-451 Misc
2-methylbutyric acid Sigma 193070-25G hyphal-inhibitory compound
488 goat anti-rabbit IgG Invitrogen (Fisher) A11008 IF Staining secondary ab
Agar Fisher BP1423-500 YPD agar component
Automated Imaging Microscope Keyence BZX700
Candida Albicans Antibody Invitrogen (Fisher) PA1-27158 IF Staining primary ab
cefoperazone Cayman 16113 antibiotic
deoxycholic acid Sigma 30960 hyphal-inhibitory compound
D-Glucose Fisher D16-500 hyphal-promoting compound
forceps Fisher 08-885
lactic acid Alfa Aesar AAAL13242-06 hyphal-inhibitory compound
lithocholic acid Sigma L6250-10G hyphal-inhibitory compound
palmitic acid Sigma P5585-10G hyphal-inhibitory compound
Paraformaldehyde Alfa Aesar A11313 IF Staining fixative
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x Alfa Aesar J62692 PBS component
p-tolylacetic acid SCBT sc-257959 hyphal-inhibitory compound
sebacic acid Sigma 283258-250G hyphal-inhibitory compound
sharp ended scissors Fisher 28301
sterile Milli-Q water N/A N/A Misc
YPD Broth BD Biosciences 242810 YPD agar component

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 161 कैंडिडा एल्बिकान,हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पूर्व वीवो परख ग्लूकोज माध्यमिक पित्त एसिड और जीआई ट्रैक्ट
गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में <em>कैंडिडा एल्बिकान</em> हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक पूर्व वीवो परख
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Monasky, R., Villa, S., Thangamani,… More

Monasky, R., Villa, S., Thangamani, S. An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract. J. Vis. Exp. (161), e61488, doi:10.3791/61488 (2020).

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