Summary

نموذج Xenograft المستمدة من المريض للتشوه الوريدي

Published: June 15, 2020
doi:

Summary

نقدم بروتوكول مفصل لتوليد نموذج مورين xenograft من التشوه الوريدي. ويستند هذا النموذج على الحقن تحت الجلد من الخلايا البطانية المستمدة من المريض التي تحتوي على فرط تفعيل 12 و / أو الطفرات الجينية PIK3CA. Xenograft الآفات تُلخيّص عن كثب السمات الهدولوجية للأنسجة المريض VM.

Abstract

التشوه الوريدي (VM) هو شذوذ الأوعية الدموية التي تنشأ عن ضعف التنمية من الشبكة الوريدية مما أدى إلى الأوردة المتوسعة والمختلة وظيفيا في كثير من الأحيان. الغرض من هذه المقالة هو أن تصف بعناية إنشاء نموذج مورين xenograft الذي يحاكي VM الإنسان وقادرة على عكس عدم تجانس المريض. تم تحديد فرط تفعيل غير موروثة (الجسدية) TEK (TIE2) و PIK3CA الطفرات في الخلايا البطانية (EC) باعتبارها المحركات الرئيسية لتوسيع الأوعية المرضية في VM. يصف البروتوكول التالي عزل وتنقية وتوسع EC المستمدة من المريض التعبير عن متحولة TIE2 و / أو PIK3CA. يتم حقن هذه EC تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران الوثيميكية المناعية لتوليد قنوات الأوعية الدموية ectatic. الآفات المتولدة مع TIE2 أو PIK3CA-متحولة EC هي الأوعية الدموية بشكل واضح في غضون 7\u20129 أيام من الحقن وتكتل السمات الهدولوجية للأنسجة المريض VM. هذا النموذج Xenograft VM يوفر منصة موثوق بها للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي تقود تشكيل الجهاز الظاهري والتوسع. وبالإضافة إلى ذلك، سيكون هذا النموذج مفيدة للدراسات الترجمية اختبار فعالية المرشحين المخدرات رواية في منع التوسع السفينة غير طبيعية ينظر في VM الإنسان.

Introduction

العيوب في تطور الأوعية الدموية هي السبب الكامن وراء العديد من الأمراض بما في ذلك التشوهات الوريدية (VM). VM هو مرض خلقي يتميز بتشكل غير طبيعي وتوسع الأوردة1. وقد حددت الدراسات الهامة على أنسجة الجهاز الظاهري والخلايا البطانية (EC) اكتساب من الطفرات وظيفة في اثنين من الجينات: TEK، الذي يشفّر مستقبلات كيناز التيروزين TIE2، وPIK3CA، الذي يشفّر p110α (الوحدة الفرعية الحفازة) isoform PI3 كيناز (PI3K)2،3،4،5. هذه الطفرات الجسدية تؤدي إلى تنشيط فرط مستقل لليغانند من مسارات إشارة أوعية / النمو الرئيسية ، بما في ذلك PI3K / AKT ، مما أدى إلى الأوردة المتوسعة3. وعلى الرغم من هذه الاكتشافات الجينية الهامة، فإن الآليات الخلوية والجزيئية اللاحقة التي تؤدي إلى تكوين الأوعية الدموية غير الطبيعية وتشكيل قنوات الأوعية الدموية الموسعة لا تزال غير مفهومة تماماً.

خلال تولد الأوعية الدموية الطبيعية والمرضية، تنبت أوعية جديدة من شبكة الأوعية الدموية الموجودة من قبل و EC تخضع سلسلة من العمليات الخلوية الهامة بما في ذلك الانتشار والهجرة وإعادة عرض المصفوفة خارج الخلية (ECM) وتشكيل التجويف6. ثنائي وثلاثي الأبعاد (2D/3D) في الثقافات في المختبر EC هي أدوات هامة للتحقيق في كل من هذه الخصائص الخلوية بشكل فردي. ومع ذلك، هناك طلب واضح لنموذج الماوس الذي يلخص تضخم الأوعية المرضية داخل البيئة الصغيرة المضيفة مع توفير منصة فعالة للتقييم قبل السريري للأدوية المستهدفة للبحوث الانتقالية.

وحتى الآن، لم يتم الإبلاغ عن نموذج مورين معدل وراثياً لـ VM مرتبط بطفرات اكتساب الوظيفة من 11 إلى 100. تعتمد نماذج الماوس VM الحالية المعدلة على التعبير في كل مكان أو مقيد بالأنسجة من الطفرة النشطة PIK3CA p.H1047R3،5. هذه الحيوانات المعدلة وراثيا توفر رؤية كبيرة في الجسم كله أو الأنسجة آثار محددة من هذه النقطة الساخنة PIK3CA الطفرة. الحد من هذه النماذج هو تشكيل شبكة الأوعية الدموية المرضية للغاية مما أدى إلى الفتك المبكر. وبالتالي ، فإن هذه النماذج الماوس لا تعكس تماما حدوث متقطع من الأحداث الطفرة والطبيعة المترجمة من أمراض VM.

على العكس من ذلك ، تعتمد نماذج xenograft المستمدة من المريض على زرع أو حقن الأنسجة المرضية أو الخلايا المشتقة من المرضى إلى الفئران المناعية7. نماذج Xenograft هي أداة قوية لتوسيع المعرفة حول تطور المرض واكتشاف وكلاء علاجية جديدة8. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الخلايا المشتقة من المريض يسمح للعلماء بتكبيل التغايرية الطفرة لدراسة طيف الأنماط الظاهرية للمريض.

هنا، ونحن وصف بروتوكول حيث يتم حقن المرضى المستمدة VM EC التي تعبر عن شكل متحولة نشطة من TIE2 و /أو PIK3CA تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران عارية athymic. يتم تعليق الخلايا الوعائية عن طريق الحقن في إطار ECM من أجل تعزيز تولد الأوعية الدموية كما هو موضح في النماذج السابقة xenograft الأوعية الدموية9,10,11. تخضع هذه VM EC لتحولات morphogenesi كبيرة وتولد أوعية مرضية موسعة ومُلّقة في غياب الخلايا الداعمة. يوفر نموذج xenograft الموصوف لـ VM منصة فعالة للتقييم قبل الكلينيكي للأدوية المستهدفة لقدرتها على منع التوسع غير المنضبط في تجويف التجويف.

Protocol

تم الحصول على عينات أنسجة المريض من المشاركين بعد موافقة مستنيرة من جمع ومستودع عينات الأنسجة والبيانات من المرضى الذين يعانون من الأورام والشذوذ الوعائي بموجب مجلس مراجعة مؤسسية معتمد (IRB) لكل سياسات مؤسسية في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال (CCHMC) ومعهد السرطان وأمراض الدم وبمواف?…

Representative Results

يصف هذا البروتوكول عملية توليد نموذج مورين xenograft من VM على أساس الحقن تحت الجلد من EC المستمدة من المريض في الجزء الخلفي من الفئران العارية المناعية. يمكن حصادها مستعمرة الخلايا البطانية في غضون 4 أسابيع بعد عزل الخلايا الأولية من أنسجة الجهاز الظاهري أو الدم الآفة(الشكل 1A، B). في الي…

Discussion

هنا، نحن وصف طريقة لتوليد نموذج xenograft المستمدة من المريض من VM. يقدم هذا النموذج مورين نظام ممتاز يسمح للباحثين بالحصول على فهم أعمق لتوسيع التجويف المرضي وسيكون له دور فعال في تطوير علاجات أكثر فعالية واستهدافًا لعلاج VM. هذا يمكن تكييفها بسهولة للتحقيق في أنواع أخرى من الشذوذ الوعائي مثل ا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويود المؤلفون أن يشكروا بحيرات نورا على التدقيق اللغوي. وقد تم دعم البحوث التي تم الإبلاغ عنها في هذه المخطوطة من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم، تحت رقم الجائزة R01 HL117952 (E.B.)، وهي جزء من المعاهد الوطنية للصحة. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحده ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males Envigo 069(nu)/070(nu/+) Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) Vector Laboratories B-1065 Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) Thermo Fisher 974106 Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA) BSA A7906-50MG Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) Sigma C7902-500G Cell culture
Caliper Electron Microscopy Sciences 50996491 Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) Life Technologies 11155D EC separation
Cell strainer (100 μM) Greiner 542000 Cell culture
Collagenase A Roche 10103578001 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL) Greiner 07 000 241 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL) Greiner 07 000 239 Cell culture
Coplin staining jar Ted Pella 21029 Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm) Fisher Scientific 12545E Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) Vector Laboratories SK-4105 Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-027-CV Cell culture
DynaMag-2 Life Technologies 12321D EC separation
Ear punch VWR 10806-286 Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0) Life Technologies 15575-020 Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) Lonza CC-3162 Cell culture
Eosin Y (alcohol-based) Thermo Scientific 71211 Histological anlaysis
Ethanol Decon Labs 2716 Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone GE Healthcare SH30910.03 Cell culture
Filter tip 1,250 μL MidSci AV1250-H Multiple steps
Filter tip 20 μL VWR 10017-064 Multiple steps
Filter tip 200 μL VWR 10017-068 Multiple steps
Formalin buffered solution (10%) Sigma F04586 Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable) SKC FILMS DHCN015 Cell culture
Hematoxylin Vector Hematoxylin H-3401 Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) Sigma FC010-10MG Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) Sigma H1009 Histological anlaysis
ImageJ Software Analysis
Isoflurane, USP Akorn Animal Health 59399-106-01 Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) Sigma M1880-500G Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) Corning 356237 Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL) VWR 87003-294 EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) Fisher Scientific 1255015-CS Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles Becton Dickinson (BD) BD305115 Subcutaneous injection
Normal horse serum Vector Laboratories S-2000 Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) Corning 30-009-CI Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount) Vector Laboratories H-5000 Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain Thomas Scientific 3431F55 EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3994 Cell culture
Scale VWR 65500-202 Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml) VWR 89130-898 Cell culture
Serological pipettes (5ml) VWR 89130-896 Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma 223530 Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC Vector Laboratories SA-5004 Cell culture
Syringe (60ml) BD Biosciences 309653 Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM) Corning 431219 Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock) Becton Dickinson (BD) BD-309628 Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) Greiner 664160 Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm) Greiner 639160 Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm Eppendorf 30701119 Cell culture
Tris-base (Trizma base) Sigma T6066 Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %) Life Technologies 15250061 Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) Corning 25-052-Cl Cell culture
Tween-20 Biorad 170-6531 Histological anlaysis
Wheaton bottle VWR 16159-798 Cell culture
Xylenes Fisher Scientific X3P-1GAL Histological anlaysis

References

  1. Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
  2. Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
  3. Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
  4. Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
  5. Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
  6. Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
  7. Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
  8. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
  9. Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
  10. Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
  11. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
  12. Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
  13. Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
  14. Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
  15. Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
  16. Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
  17. Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).

Play Video

Cite This Article
Schrenk, S., Goines, J., Boscolo, E. A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation. J. Vis. Exp. (160), e61501, doi:10.3791/61501 (2020).

View Video