Summary
Мы представляем подробный протокол для создания murine xenograft модель венозной мальформации. Эта модель основана на подкожной инъекции эндотелиальных клеток, полученных пациентом, содержащих гиперактивные мутации генов TIE2 и/или PIK3CA. Поражения ксенотрансплантата тесно резюмируют гистопатологические особенности ткани пациента VM.
Abstract
Венозная мальформация (ВМ) является сосудистой аномалией, которая возникает в результате нарушения развития венозной сети, что приводит к расширенным и часто дисфункциональным венам. Цель этой статьи состоит в том, чтобы тщательно описать создание модели ксенотрансплантата murine, которая имитирует человеческий VM и способна отражать неоднородность пациента. Гиперактивные ненаследуемые (соматические) мутации ТЭК (TIE2) и ПИК3КА в эндотелиальных клетках (ЭК) определены в качестве основных факторов расширения патологических сосудов в ВМ. В следующем протоколе описывается изоляция, очистка и расширение ЕК, полученной пациентом, выражают мутант TIE2 и/или PIK3CA. Эти EC вводятся подкожно в спину иммунодефицитных атимических мышей для генерации эктатических сосудистых каналов. Поражения, генерируемые TIE2 или PIK3CA-мутантом EC, заметно сосудизируются в течение 7-20129 дней после инъекции и подытося гистопатологические особенности ткани пациента VM. Эта модель Ксенотрансплантата VM обеспечивает надежную платформу для исследования клеточных и молекулярных механизмов, движущих образованием и расширением VM. Кроме того, эта модель будет иметь важное значение для трансляционных исследований тестирования эффективности новых кандидатов наркотиков в предотвращении аномального расширения сосудов видели в человеке VM.
Introduction
Дефекты в развитии сосудов являются основной причиной многих заболеваний, включая венозную мальформацию (ВМ). ВМ является врожденным заболеванием, характеризующимся аномальным морфогенезом и расширениемвен 1. Важные исследования на ткани VM и эндотелиальных клеток (EC) определили усиления функции мутаций в двух генах: ТЭК, который кодирует рецептор тирозинкиназы TIE2, и PIK3CA, который кодирует p110 "(каталитический субъединица) изоформ PI3-киназы (PI3K)2,3,4.5 Эти соматические мутации приводят к лиганд-независимой гипер-активации ключевых ангиогенных/рост сигнальных путей, включая PI3K/AKT, что приводит к расширенным эстатическимвенам 3. Несмотря на эти важные генетические открытия, последующие клеточные и молекулярные механизмы, запускающие аномальный ангиогенез и образование увеличенных сосудистых каналов, до сих пор не до конца изучены.
Во время нормального и патологического ангиогенеза, новые сосуды прорастают из уже существующей сосудистой сети и EC проходят последовательность важных клеточных процессов, включая пролиферацию, миграцию, внеклеточную матрицу (ECM) ремоделирование и образованиелюмена 6. Двух- и трехмерные (2D/3D) культуры in vitro EC являются важными инструментами для исследования каждого из этих клеточных свойств в отдельности. Тем не менее, существует явный спрос на модель мыши, резюмируемую расширение патологических сосудов в рамках микроокноронности хозяина, обеспечивая при этом эффективную платформу для доклинческой оценки целевых препаратов для трансляционных исследований.
До настоящего времени не сообщалось о трансгенной модели murine VM, связанной с мутациями усиления функции TIE2. Текущие трансгенные модели мышей VM опираются на повсеместное или ограниченное в тканях выражение активизировавшейся мутации PIK3CA p.H1047R3,5. Эти трансгенные животные дают значительное представление о воздействии этой мутации PIK3CA на все тело или ткани. Ограничением этих моделей является формирование высоко патологической сосудистой сети, приводящей к ранней летальности. Таким образом, эти мышиные модели не в полной мере отражают спорадическое возникновение мутационных явлений и локализованный характер патологии ВМ.
Напротив, модели ксенотрансплантата, полученные пациентом, основаны на трансплантации или инъекции патологических тканей или клеток, полученных от пациентов в иммунодефицитныхмышей 7. Ксенотрансплантат модели являются мощным инструментом для расширения знаний о развитии болезни и открытие новых терапевтическихагентов 8. Кроме того, использование клеток, полученных пациентами, позволяет ученым резюмировать неоднородность мутаций для изучения спектра фенотипов пациентов.
Здесь мы описываем протокол, в котором полученные пациентом VM EC, которые выражают мутант constitutively-активную форму TIE2 и/или PIK3CA вводятся подкожно в задней части атимических обнаженных мышей. Инъекционные сосудистые клетки подвешиваются в рамках ЭКМ для содействия ангиогенезу, как описано в предыдущих сосудистых моделях ксенотрансплантата9,,10,,11. Эти ВМ EC проходят значительный морфогенез и генерируют увеличенные, проникнутые патологические сосуды при отсутствии поддерживающих клеток. Описанная ксенотрансплантатная модель ВМ обеспечивает эффективную платформу для доклинческой оценки целевых препаратов на их способность препятствовать неконтролируемому расширению люмена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы тканей пациентов были получены от участников после информированного согласия от сбора и хранения образцов тканей и данных от пациентов с опухолями и сосудистыми аномалиями в соответствии с утвержденным Институциональным советом по обзору (IRB) в рамках институциональной политики в Медицинском центре детской больницы Цинциннати (CCHMC), Институте рака и заболеваний крови и с одобрения Комитета по клиническим исследованиям. Все процедуры, описанные ниже, были рассмотрены и одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных CCHMC.
1. Подготовка материалов и фондовых решений
- Подготовка полной эндотелиальной среды роста клеток (EGM)
- Дополнение эндотелиальной базальной среды (EBM) со следующими факторами роста, присутствующими в комплекте (см. Таблицу материалов ):фактор роста фибробласта человека -бета (hFGF-я), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), Long Arg3 Инсулин-как фактор роста - I (R3-IGF-I), аскорбиновая кислота, эпидермальный фактор роста (EGF), гентамицин сульфат и амфотерицин-B, и гепарин. Добавьте 1% раствор пенициллина/стрептомицина/L-глютамина (PSG) и 20% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не рекомендуем добавлять гидрокортизон. - Стерильный фильтр раствор под капотом ламинарного потока через 0,2 мкм бутылки верхний фильтр в автоклав стеклянной бутылке и aliquot средств массовой информации в 50 мл конических трубок и хранить при 4 градусов по Цельсию до недели или при -20 градусов по Цельсию на срок до одного года.
- Дополнение эндотелиальной базальной среды (EBM) со следующими факторами роста, присутствующими в комплекте (см. Таблицу материалов ):фактор роста фибробласта человека -бета (hFGF-я), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), Long Arg3 Инсулин-как фактор роста - I (R3-IGF-I), аскорбиновая кислота, эпидермальный фактор роста (EGF), гентамицин сульфат и амфотерицин-B, и гепарин. Добавьте 1% раствор пенициллина/стрептомицина/L-глютамина (PSG) и 20% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS).
- Подготовка коллагеназы фондовый раствор
- Подготовка 50 мг/ мл коллагеназы фондовый раствор в 1x фосфат буфера солевого раствора (PBS).
- Стерильный фильтр раствор под капотом ламинарного потока с фильтром 0,2 мкм и шприцем, и хранить 100 йл aliquots при -20 градусов по Цельсию.
- Подготовка среды сбора тканей (Buffer A)
- Приготовьте растворбульонаCa 2 '/Mg2' путем добавления 0,927 г дигидрата хлорида кальция (CaCl2.2H2O) и 1 г г г гептагидрата сульфата магния (MgSO4.7H2O) до 500 мл дистиллированной воды. Стерильный фильтр решения через 0,2 мкм бутылки верхний фильтр в автоклав стеклянной бутылке и хранить при комнатной температуре (RT).
- Дополнение Dulbecco Модифицированный Eagle Medium (DMEM) с 10% Ca2"/Mg2" решение и 2% FBS.
- Стерильный фильтр раствор под капотом ламинарного потока с фильтром 0,2 мкм и шприцем и хранить aliquots 5 мл при -20 градусов по Цельсию.
- Фибронектиновое покрытие тканевых пластин культуры
- Подготовка буфера покрытия (Buffer B) путем растворения 5,3 г карбоната натрия (Na2CO3; 0.1 M) в 500 мл деионизированной воды. Отрегулируйте рН буфера до 9,4 с использованием 1 М соляной кислоты (HCl). Фильтр под капотом потока ламинара через фильтр верхней бутылки 0,2 мкм в автоклав стеклянную бутылку и хранить на RT.
- Для покрытия пипетка 2 мл/5 мл/10 мл буфера B на 60 мм/100 мм/145 мм пластины культуры ткани, соответственно. Добавьте 1 мкг/см2 раствора очищенного белка плазмы человека и аккуратно распределите жидкость по пластине.
- Инкубационая пластина при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 в течение 20 мин.
- Аспират Буфер B и мыть пластину с PBS до культивирования клеток.
2. Изоляция эндотелиальных клеток из ткани пациента VM
- Изоляция ЕС от твердой ткани VM
ПРИМЕЧАНИЕ: VM ткани resected путем debulkingхирургии 12,13 в соответствии с протоколом IRB утвержденных.- Вымойте VM ткани (вес образца ткани обычно колеблется от 0,5 г до 1,5 г) в 5% PSG в PBS.
- Передача ткани в 100 мм клеточной культуры блюдо, фарш ткани образца на мелкие кусочки с помощью стерильных хирургических инструментов вскрытия, и передать в 50 мл конической трубки.
- Добавьте 100 л коллагеназы стокового раствора в 5 мл буфера А для окончательной концентрации 1 мг/мл, затем добавьте это в ткань и перемешайте рубленую ткань при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, встряхивая содержимое каждые 5 минут.
- Тщательно измельчите переваренную ткань в RT с помощью 6 мм гладкой поверхности молоть шлифовальной машины в 50 мл конической трубки.
- Продолжайте тщательно молоть переваренной ткани с помощью пестика при добавлении 5 мл холодного PBS дополняется 0,5% бычьего альбумин сыворотки (BSA) и 2% PSG. Повторите этот шаг четыре раза.
- Фильтр раствор через 100 мкм ситечко клеток в 50 мл конической трубки для удаления фрагментов тканей.
- Центрифуга клеточной подвески в течение 5 мин при 400 х г на RT. Продолжить шаг 2,3.
- Изоляция ВМ ЭК от пораженной крови, полученной в результате склеротерапии пациента
- Получить человека VM поражения крови от склеротерапии в соответствии с протоколом IRB утвержденных.
- Разбавленная пораженная кровь (объем образца обычно колеблется от 0,5 мл до 5 мл) в PBS до конечного объема 40 мл.
- Центрифуга клеточной подвески в течение 5 мин при 200 х г на RT.
- Начальное покрытие ячейки
- Откажитесь от супернатанта и повторно посовелайте одноклеточную гранулу в 1 мл EGM.
- Добавьте 9 мл полного EGM на фибронектин покрытием (1 мкг/см2) 100 мм пластин и семян 1 мл клеточной подвески.
- Инкубационные клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненной атмосфере 5% CO2.
- Каждый день удалите 2 мл мультимедиа и добавьте 2 мл стерильной фильтрованной FBS.
- Как только клеточные культуры достигают слияния 40-u201250% изменить средний для завершения EGM. Это обычно занимает от 2'u20123 недель для клеток, чтобы достичь этого слияния.
- Ежедневно наблюдайте за появлением колоний ЕС. Они могут быть признаны по их типичной "булыжник-как" морфология (рисунок 1A). В каждой выборке отображаются между 3-20125 EC-колониями.
- Изменение среды через день в течение еще 5'u20127 дней, пока отдельные колонии ЕС начинают касаться друг друга.
- Ручная изоляция отдельных колоний ЕС
- Чтобы собрать колонии ЕС, мыть пластину с 5 мл PBS и вручную аспирировать с серологическим пипеткой.
- Возьмите пластину к микроскопу и круг местах нескольких колоний ЕС с помощью маркировки перо как на крышке и дне, прежде чем вернуть его в ламинарный капюшон потока.
- Отсоедините колонии ЕС путем трубопроводного раствора 50 МКЛ из 0,05% трипсина-ЭДТА на отмеченных участках.
- Используя небольшой сотовый скребок или наконечник пипетки, аккуратно соскрепайте клетки с тарелки.
- Наклоните пластину до ближайшего края и промойте 1 мл EGM на отмеченную область и соберите ячейки.
- Подсчитайте количество ячеек с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
- Плита собранных колоний ЕС при плотности 1 х 104 клеток/см2 на фибронектин покрытием (1 мкг/см2) клеточной культуры блюда, содержащие свежие EGM. На следующий день измените средний для завершения EGM.
- Изменение среды для завершения EGM через день в течение 2'u20123 недель, пока клетки не достигнут 80% слияния.
- Трипсинизировать EC с 2 мл предварительно разогретого 0,05% трипсина-ЭДТА на 100 мм блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин и нейтрализовать трипсин, добавив 4 мл EGM.
- Соберите подвеску клетки в одну коническую трубку 15 мл и центрифугу при 400 x g в RT в течение 5 минут. Аспиратировать сверхнатантные и повторное течение клеток в 2 мл EGM.
- Подсчитайте количество ячеек с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Типичные числа клеток, полученных являются 1 х10 6 клеток на 60 мм пластины культуры клеток или 2 х10 6 клеток на 100 мм пластины культуры ткани.
- Пеллет клеток центрифугации на 400 х г на RT в течение 5 мин и аспирировать супернатант. Приступайте к шагу 3.2.1.
3. Эндотелиальный отбор клеток и расширение
- Подготовка противо-CD31-спряженных магнитных бусин
- Вихрь флакон, содержащий анти-CD31-конъюгированных магнитных бусин для 30 с. Количество необходимых бусин 8 х 106 бусин/2 х 106 клеток.
- Вымойте нужное количество анти-CD31-конъюгированных магнитных бусин с 1 мл раствора для мытья, содержащего 0,1% BSA в PBS в 1,5 мл микроцентрифуг трубки.
- Поместите трубку микроцентрифуга в магнит изоляции клеток в течение 1 мин.
- Аспирировать супернатант и повторить шаг стирки.
- Эндотелиальная очистка клеток и покрытие
- Гранулы повторного производства клеток, полученные в 2.4.12 в 500 йл раствора для мытья, содержащего 0,1% BSA в PBS.
- Добавьте клеточный раствор в микроцентрифугную трубку, содержащую магнитные бусы, и тщательно будем повторно использоваться.
- Инкубировать в течение 20 минут при 4 градусов по Цельсию с нежным наклоном.
- Добавьте 500 МЛ 0,1% BSA в PBS и хорошо перемешайте.
- Поместите трубку на магнит изоляции клеток в течение 1 мин.
- Аккуратно аспирировать всю жидкость, которая содержит CD31-отрицательную долю клеток, не касаясь бисера.
- Вымойте шарик гранулы, содержащие CD31-положительной фракции клеток с 1 мл 0,1% BSA в PBS и повторить магнитное разделение.
- Повторите стирку и магнитное разделение шаг как минимум в 3 раза, чтобы очистить CD31-положительной фракции клеток.
- Resuspend очищенные эндотелиальные клетки в 15 мл конической трубки и спина вниз в течение 5 мин при 400 х г на RT.
- Удалить супернатант и повторное течение ячейки гранулы в 1 мл EGM.
- Добавьте 9 мл полного EGM на фибронектин покрытием (1 мкг/см2) 100 мм пластин и семян 1 мл клеточной подвески. Обратите внимание, что некоторые магнитные бусины по-прежнему прикреплены к клеткам в этом первом шаге посева. Большинство бусин смываются во время расширения клеток, но небольшое количество бисера может сохраняться в ранних проходах.
- Инкубационные клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненной атмосфере 5% CO2.
- Изменение среды через день, пока клетки не достигнут 80% слияния(рисунок 1B).
- Расширение эндотелиальных клеток
- Как только клетки достигают 80% слияния, отсоедините с 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА на 100 мм блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
- Нейтрализуй трипсин, добавив 4 мл EGM и соберите клетки в одну коническую трубку 15 мл.
- Центрифуга при 400 x g в RT в течение 5 мин.
- Аспирировать сверхнатантные, повторное течение клеток в 2 мл EGM, и подсчитать количество клеток с гемоцитометром или автоматизированного подсчета клеток.
- Семенные клетки с плотностью 1 х 104 клетки/см2 в 145 мм фибронектин покрытием (1 мкг/см2) пластины культуры ткани.
- Продолжайте прохождение ячеек до тех пор, пока не будет выполнен желаемый номер ячейки. Учти, что в культуре ткани диаметром 145 мм содержится около 8-20129 х 106 клеток, а количество необходимых клеток составляет 2,5 х 106 клеток на инъекцию. Только клетки между проходом 3 и 8 должны быть рассмотрены для ксенотрансплантата.
4. Протокол ксенотрансплантата, полученный пациентом VM
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы используем 5'u20126 неделю, мужской иммунодефицит, athymic обнаженной Foxn1ню мышей.
Все процедуры для животных должны быть одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC).
- Подготовка материалов за день до инъекции
- Предварительно холод шприцы, иглы, и пипетки советы в -20 градусов по Цельсию морозильник на ночь.
- Медленно оттаивать мембрану подвала внеклеточной матрицы (BMEM) на ночь на ведро со льдом размещены при 4 градусов по Цельсию, чтобы избежать повышенной вязкости геля.
- Подготовка клеточной суспензии к инъекциям
- Трипсинизировать EC с 5 мл предварительно разогретого 0,05% трипсина-ЭДТА на 145 мм блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
- Нейтрализуй трипсин, добавив 5 мл EGM и соберите клетки в одну коническую трубку 15 мл.
- Центрифуга при 400 x g в RT в течение 5 мин.
- Аспирировать сверхнатантные, повторно использовать клетки в 3 мл EGM, и подсчитать количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированной счетчика клеток.
- Определите общее количество клеток, необходимых для всех запланированных инъекций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое количество клеток составляет 2,5 х 106 клеток на инъекцию. В общей сложности 2 инъекции, как правило, выполняются в каждой мыши для технических дубликатов. Необходимо рассчитать 10% превышение количества клеток, чтобы учесть потери при передаче в шприц. - Перенесите объем, содержащий расчетный номер клетки, в новую коническую трубку 50 мл и гранулированные клетки путем центрифугации при 400 x g в RT в течение 5 минут.
- Аспирировать супернатант, оставляя небольшой объем (около 50'u201270 L), чтобы ослабить гранулы.
- Подготовка шприца
- Рассчитайте избыточный объем в 20 йл/инъекцию с учетом потерь при переводе в шприц. Повторное использование клеточной гранулы с 220 МЛ БМЭМ на инъекцию на льду. Инъекционный объем клеточной суспензии будет 200 МКЛ за поражение.
- Смешайте подвеску клетки тщательно на льду, чтобы получить однородную подвеску клетки и избежать создания пузырьков.
- Используя 1 мл пипетки и 1 мл шприца, одновременно трубят BMEM-клеточной смеси в шприц открытия всасывающей силой, потянув поршень шприца.
- Luer блокировки 26G х 5/8 дюйма стерильной иглы к шприцу и держать подготовленные шприцы плашмя на льду до инъекции.
- Подкожная инъекция в мышь
- Обезболить мышей с 5% изофлюран / кислородной смеси со скоростью потока 1 л / мин с помощью изофлюран испарителя. Обеспечить надлежащее сеяние животных (например, безответственность на щипать щипец). Поддерживайте анестезию через непрерывное администрирование 1,5% изофлюран/кислород, поставляемый через носовой конус.
- Поместите мышей на живот, подвергая задней области, где прививки будет происходить и дезинфицировать область инъекций с 70% этанола.
- Аккуратно свернуть подготовленный шприц, чтобы повторно использовать любые урегулированные клетки. Флик пузыри иглы конце шприца и изгнать небольшой объем клеточной подвески для обеспечения удаления всех пузырьков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Две инъекции могут быть выполнены для каждой мыши - на левой и правой стороне мыши назад. - Pinch и создать "палатка-как" структура с помощью большого пальца и указательного пальца и вставить иглу подкожно прямо под кожей. Убедитесь, что игла только глубокой кожи, выпустив ущипнул кожи для предотвращения инъекций в мышечную ткань.
- Держа иглу под углом 45 градусов, тщательно ввишайте 200 мкл клеточной подвески, чтобы создать небольшую сферическую массу(рисунок 1С).
- Запись веса мыши с шкалой, ухо теги мыши, и вернуться в клетку.
- Мониторинг мышей после сеяния, чтобы убедиться, что они возвращаются к нормальной деятельности.
- Мониторинг роста поражений
- Используя калипер, измерьте длину и ширину каждой вилки(рисунок 1D).
- Замеры документов через день вплоть до сбора поражений.
5. Сбор и обработка тканей
- Euthanize мышей 9 дней после имплантации в камере CO2 и проверить жизненно важные признаки, чтобы подтвердить смерть. Выполните вывих шейки матки на мышах в качестве вторичного метода усыпляния мыши.
- Урожай ксенотрансплантата поражения / штепсельной вилки с фланга мыши путем вскрытия с помощью хирургических типсов и ножниц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы предотвратить разрыв заполненных кровью сосудов в штепсельной вилке, важно, чтобы избежать прикосновения к вилке поражения с инструментами вскрытия и оставить чрезмерно окружающие ткани, такие как кожа прилагается к вилке. - Погрузите повторное поражение в PBS для мытья.
- Настройка камеры сцены с камерой. Выравнивание штепсельной вилки на разделольную доску с линейкой. Возьмите изображение всех пробок для записи валовой васкулярности поражений (Рисунок 1E).
- Исправить пробки, погружаясь в 10% формалин ночь на RT.
- Вымойте пробки в PBS на следующий день и переместить их в 70% этанола.
- Процесс поражения пробки для встраивания парафина (патологическое ядро).
6. Раздел поражения
- Используйте микротом, чтобы вырезать 5 мкм разделов из собранных поражений мурина на положительно заряженных слайдов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующего анализа, разделы в центре штепсельной вилки (около 50'u201270 мкм в ткани) имеют важное значение. - Растопить парафин при 60 градусах Цельсия за 1 ч до окрашивания.
- Де-парафинизировать и повторно гидратировать ткани последовательно под капотом потока химического дыма. Таким образом, инкубировать слайд в ксилен в течение 10 мин, 100% этанола (EtOH) в течение 5 мин, 90% EtOH в течение 3 мин, и 80% EtOH в течение 3 мин.
- Промыть горку в дейонизированной воде в течение 5 минут.
7. Гематоксилин и эозин (Н И Е)
- Инкубационые секции в гематоксилине в течение 2 мин.
- Поместите слайды в окрашивание банку и промыть в раковине устойчивый поток водопроводной воды, пока вода не будет ясной.
- Де-гидрат слайды путем инкубации тканей последовательно в 70% EtOH в течение 1 мин, 80% EtOH в течение 1 мин, 90% EtOH в течение 1 мин, 100% EtOH в течение 1 мин, и свежие 100% EtOH в течение 1 мин.
- Пятна разделов в Eosin Y для 30 с.
- Промыть свежим 100% EtOH, пока решение не будет ясным.
- Инкубационный слайд в ксиленах в течение 2 мин. Пусть слайды сухие в течение 5'u201210 мин под капотом дыма.
- Обойтись капли постоянных, не-aqueous монтажа среды над ксенотрансплантами разделов и место coverslip на вершине.
- Разрешить слайды высохнуть на ночь перед изображением.
8. Иммуногистохимия
- Подготовка антигена поиска буфера (Tris-EDTA) путем взвешивания 0,6 г Tris-базы и 1 мл 0,5 М EDTA до 500 мл деионизированной воды. Отрегулируйте рН до 9.0 с помощью 1 M HCl. Добавьте 250 МКЛ Tween-20.
- Инкубировать де-парафинизированные слайды тканей (как получено в шаге 6.2'u20126.3) в стакане с буфером поиска антигена, помешивая на нагревательном блоке, в течение 20 минут при 95 градусов по Цельсию.
- Снимите стакан с нагревательного блока, дайте раствору остыть до 35 градусов по Цельсию, затем промойте в PBS в течение 3 минут.
- Блок тканей разделов в 5% нормальной сыворотки лошади в PBS в течение 30 минут на RT.
- Подготовка биотинилированных Ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) рабочий раствор путем разбавления 20 мкг / мл биотинилированных UEA-I в 5% нормальной сыворотки лошади в PBS.
- Pipet 50'u2012100 ЗЛ рабочего решения UEA-I на секцию и инкубировать в течение 1 ч на RT в увлажняющей камере.
- Вымойте слайды два раза в PBS в течение 3 минут.
- Утолить слайд разделы в 3% перекиси водорода в течение 5 мин на RT.
- Вымойте слайды два раза в PBS в течение 3 минут.
- Приготовьте 5 мкг/мл стрептавидина хрена пероксидаса, конъюгированных в 5% нормальной конной сыворотки в PBS.
- Pipet 50'u2012100 L на каждой ткани слайд и инкубировать в течение 1 ч на RT в увлажняющей камере.
- Вымойте слайды два раза в PBS в течение 3 минут.
- Приготовьте решение 3,3'Diaminobenzidine (DAB) в соответствии с инструкциями производителя и добавьте 50-2012100 йл на секцию.
- Инкубационые секции в течение 10-201215 мин, проверка и мониторинг развития пятен каждые 2'u20125 мин.
- Вымойте слайды три раза в PBS в течение 3 минут.
- Добавить каплю гематоксилина и инкубировать в течение 3 мин.
- Поместите слайды в окрашивание банку и промыть в раковине устойчивый поток водопроводной воды, пока вода не будет ясной.
- Последовательно инкубировать слайд в 80% EtOH в течение 1 мин, 90% EtOH в течение 1 мин, 100% EtOH в течение 1 мин, и ксилена в течение 2 мин.
- Пусть слайды сухие в течение 5'u201210 мин под капотом дыма.
- Обойтись капли постоянных, не-aqueous монтажа среды над ксенотрансплантами разделов и место coverslip на вершине.
- Разрешить слайды высохнуть на ночь перед изображением.
9. Анализ сосудистых каналов, полученных человеком
ПРИМЕЧАНИЕ: Васкулярность поражений ВМ количественно измеряется путем измерения сосудистой области и плотности сосудов. Только UEA-I положительные, полученные человеком сосудистые каналы рассматриваются для количественной оценки.
- Сделай от четырех до пяти изображений на секцию поражения с ярким полевым микроскопом при увеличении в 20 раз (поля высокой мощности (HPF). Возьмите HPF изображения в X-самолет шаблон в разделе поражения, чтобы избежать перекрытия(рисунок 1F-H). Включите планку масштаба на сделанных снимках.
- Откройте изображения HPF в изображении J Open(Файл Калибруйте пиксели бара масштаба следующим образом. Используйте инструмент прямой линии и перейдите планку масштаба. Чтобы преобразовать измеренные пиксели в мм, Set scaleнажмите на Analyze
- Нажмите на анализ и установите измерения и выберите область и добавьте к наложению.
- Измерьте общую площадь поля в HPF с помощью анализа. Сохраните это измерение для количественной оценки в шаге 9.8.
- Используя инструмент для выбора от руки, вручную наметите UEA-Iи сосудистые каналы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сосудистый канал определяется как любая область,+ которая выровнена с UEA-I - EC, которые могут содержать клетки крови. - Нажмите на анализ и меру количественной оценки изложенной области UEA-I и сосудистой области(мм 2/ HPF).+
- Повторите это измерение для всех пяти HPF, принятых в пределах одной вилки.
- Средняя общая площадь сосудов всех пяти HPF. Полученная сосудистая область на HPF впоследствии делится на область поля HPF(в мм 2, шаг 9.5) и выражается в процентах (%).
- Для количественной оценки плотности сосудов подсчитайте количество принятых UEA-I+ и сосудистых каналов каждого взятого HPF. Плотность сосудов – это среднее количество+ сосудистых каналов UEA-I, подсчитанных в области HPF (сосуды/мм2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает процесс генерации мурин ксенотрансплантата модели VM на основе подкожной инъекции пациента полученных EC в спину иммунодефицитных обнаженных мышей. Эндотелиальные клеточные колонии могут быть собраны в течение 4 недель после первоначальной изоляции клеток от ткани VM или пораженной крови(рисунок 1A,B). На следующий день после инъекции, ксенотрансплантат поражения штепсельная вилка охватывает площадь поверхности около 80'u2012100 мм2. В наших руках, поражения пробки с TIE2/PIK3CA-мутант EC заметно васкуляризированы и проникнуты в течение 7'u20129 дней от инъекции 14,15 (Рисунок 1C-E). Тем не менее, степень роста поражения является переменной и отражается на пациента и выборки неоднородности.
Поражения пробки тесно резюмировать гистопатологические особенности ткани человека VM: увеличенные сосудистые каналы выстроились тонким слоем эндотелиальных клеток (Рисунок 1F'u2012H). Эти сосудистые структуры обычно содержат эритроциты, подтверждающие функциональные анастомозы с сосудами мыши-хозяина (рисунок1F'u2012H). Иммуногистохимическое окрашивание с использованием человеческого специфического лектина UEA-I может подтвердить, что клетки, выстилающие сосудистые поражения, получены из имплантированных клеток человека, а не из сосудовмыши (рисунок 1H). Схема, обобщающая шаги от изоляции VM-EC до вскрытия вилки поражения, представлена на рисунке 2.
Рисунок 1: Результаты представительов.
(A) Представитель изображения первичной смешанной клеточной культуры через три недели после изоляции от ткани VM до выбора ЕС. Типичная эндотелиальная клеточная колония (ЕС) и загрязняющий фибробласт (FB). (B) Изображение очищенной (CD31 бисер-выбор) эндотелиальной клеточной культуры из ткани, полученной пациентом VM. Шкала бар 200 мкм. (C) Поражение будет образовывать сферическую структуру. Васкуляризация видна благодаря синеватому цвету кожи обнаженных мышей. (D)Dashed линии показывают, как размер поражения перекодируется путем измерения длины (L) и ширины (W) с помощью калипера. (E) Фото заметно васкуляризированных, ксенотрансплантат поражения explant в день 9. Масштабная планка - 1 см.(F)Представительное изображение секции вилки поражения. Узор x-plane, в котором для количественной оценки делается пять изображений высокого силового поля, указывается белыми разбитыми коробками. Шкала бар 1000 мкм. (G'u2012H) Представитель изображения VM поражения штепсельной вилки разделов. (G)Гематоксилин и эозин окрашивания и (H) иммуногистохимии человека конкретных лектин UEA-I. Масштабная планка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схема рабочего процесса для создания ксенотрансплантата VM, полученного пациентом.
(A) Эндотелиальные клетки, изолированные от пациента VM поражения твердых тканей или поражения крови покрына и, когда 80% слияние достигнуто, выбираются анти CD31-конъюгированных иммуномагнитных бусин и расширены. (B) Для подкожной инъекции ЕС, на день 0, кожа на задней стороне мыши ущипнул с помощью указательного пальца и большого пальца, чтобы создать палатку, как структура. Поражения измеряются в день 1, а затем через день (красные стрелки) с помощью калипера через экспериментальный день 9. Поражения рассекают и обрабатывают для гистологического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем метод создания ксенотрансплантатной модели VM, полученной пациентом. Эта модель murine представляет отличную систему, которая позволяет исследователям получить более глубокое понимание расширения патологического люмена и будет играть важную роль в разработке более эффективных и целенаправленных методов лечения ВМ. Это может быть легко адаптирована для исследования других типов сосудистых аномалий, таких как капиллярная лимфатическая венозная мальформация16. Есть несколько шагов, которые имеют решающее значение для успешного поколения воспроизводимых сосудистых поражений. Во-первых, эндотелиальные клетки, полученные пациентом, должны быть чистыми (без присутствия других типов клеток) и расти в геометрической прогрессии во время инъекции. Загрязнение фибробластов или других мезенхимальных не-EC может быть легко распознается удлиненной морфологии. В редких случаях, вполне возможно, что даже после очистки с использованием анти-CD31 антитела конъюгированных магнитных бусин, небольшое количество не-EC остаются в культуре. Эти культуры требуют дальнейшей очистки с эндотелиальными маркерами поверхности клеток. В качестве альтернативного подхода возможно одноклеточное клональное расширение эндотелиальных клеток. Это позволит вновь заостраить однородность мутанта-ЕС, поскольку все клетки в рамках одной культуры будут происходить из одной клетки. Тем не менее, этот подход не рекомендуется для ЕК, полученного из VM, поскольку клетки, как правило, доводят свои возможности распространения и преобразуются в стариный фенотип после отрывков 9'u201210. Очень важно использовать клетки между проходами 3'u20128 для экспериментов с ксенотрансплантом и не проход клеток за день до инъекции.
Модель ксенотрансплантата может быть изменена для исследования других сосудистых аномалий, несущих различные активационые мутации. Кроме того, поскольку образцы тканей пациента трудно получить доступ для некоторых лабораторий, модель ксенотрансплантата может быть адаптирована с помощью ЭК, таких как эндотелиальные клетки пуповинной крови человека (HUVEC), генетически модифицированные, чтобы выразить мутацию/с, как известно, вызывают дисфункциональныйрост сосудов 15,17.
Количество клеток, рекомендованных для инъекций в ксенотрансплантате, составляет 2,5х 10 6 клеток/200 МКЛ БМЭМ. Однако, если количество клеток недостаточно, можно либо уменьшить количество инъекций на одно животное до одного, либо уменьшить объем инъекций до минимума 100 МКЛ. Для последнего, однако, важно поддерживать соотношение плотности клеток, например, 1,25 х 106 клеток/100 йл BMEM. При работе с BMEM, все шаги должны быть выполнены на льду, чтобы избежать затвердевания клеточной подвески перед инъекцией. Во время инъекции, важно, и что игла вставляется под углом 45 "прямо под кожей и вдали от мышечной ткани, как инъекционные в мышцы препятствует воспроизводимости поражения и делает поражение вскрытия трудно. В общей сложности две инъекции могут быть выполнены на каждой мыши- один справа и один на левой стороне каждого животного. Вторая инъекция в той же мыши может служить в качестве технической репликации. Больше инъекций на спине не рекомендуется, как поражения растут с течением времени и может мешать друг другу. Для статистического анализа в доклинических исследованиях, сравнивая ксенотрансплантные пробки обработанных (только для транспортных средств) мышей, мы рекомендуем использовать как минимум 5 животных (10 ксенотрансплантных пробок) в одной исследовательской группе. При наличии второй инъекции можно было бы использовать в качестве "внутреннего контроля" с использованием немутантных EC. Мы использовали первичные немутантные EC, такие как HUVEC, в качестве контроля и показали, что эти клетки образуют незначительное количество небольшихканалов 14,15. Кроме того, в этих HUVEC контроля поражения пробки, мы заметили проникновение мурина полученных сосудистых каналов в вилку после дня 9. Если экспериментальная конструкция требует более длительного времени инкубации, эти проникающие каналы могут быть легко исключены из анализа путем окрашивания для человека конкретных маркеров, таких как человека конкретных CD31 антитела или Ulex europaeus agglutinin I (UEA-I), который не пересекает реагировать с помощью мыши.
Для того, чтобы поражение не стало бременем для здоровья и благополучия животных важно наблюдать размер поражения, записывать вес мыши ежедневно, и обратить внимание на любые побочные осложнения, такие как кровотечение и кровоподтеки. Если объем поражения превышает 500мм 3,эксперимент должен быть прекращен.
Когда сосудистые поражения увеличены и проникнуты, крайнее внимание должно быть уделено во время вскрытия, чтобы избежать разрыва поражения. Важно, чтобы избежать прикосновения поражения штепсельной вилки с инструментами вскрытия и оставить чрезмерно окружающие ткани (например, кожа) прилагается к вилке. Это предотвращает коллапс сосудистых структур в ксенотрансплантатной вилке, которая будет мешать точному анализу.
Наконец, чтобы сохранить консистенцию, важно, чтобы первоначальный гистологический анализ начинается в центре вилки (около 50 х 201270 мкм в ткани), а не в приграничных районах, где anastomosing мыши сосуды могут присутствовать. Настоятельно рекомендуется испачкать секции тканей с человеком конкретных МАРКЕР ЕС, таких как UEA-I или альтернативные человека конкретных антител, которые не будут перекрестно реагировать с мышью, с тем чтобы подтвердить, что сосудистые структуры формируются человека, полученных ЕС, а не вторжение мыши ЕС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов для раскрытия информации.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Нора озер для корректирования. Исследования, о них сообщается в этой рукописи, были поддержаны Национальным институтом сердца, легких и крови под номером R01 HL117952 (E.B.), в составе Национальных институтов здравоохранения. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
- Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
- Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
- Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
- Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
- Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
- Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
- Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
- Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
- Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
- Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
- Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
- Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).
