Summary
Presentiamo un protocollo dettagliato per generare un modello murine xenograft di malformazione venosa. Questo modello si basa sull'iniezione sottocutanea di cellule endoteliali derivate dal paziente contenenti mutazioni genetiche TIE2 e/o PIK3CA iper-attivanti. Le lesioni dello Xenotrapianto ricapitolano da vicino le caratteristiche istopatologiche del tessuto del paziente VM.
Abstract
La malformazione venosa (VM) è un'anomalia vascolare che deriva dallo sviluppo alterato della rete venosa con conseguente venatura dilatata e spesso disfunzionale. Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere attentamente la creazione di un modello murine xenograft che imita vm umano ed è in grado di riflettere l'eterogeneità del paziente. Le mutazioni TEK (TIE2) e PIK3CA non ereditarie iper-attivanti nelle cellule endoteliali (EC) sono state identificate come i principali fattori di allargamento della nave patologica nella VM. Il seguente protocollo descrive l'isolamento, la purificazione e l'espansione della EC derivata dal paziente che esprime il TIE2 mutante e/o PIK3CA. Questi CE vengono iniettati sottocutaneamente nella parte posteriore dei topi atimici immunodeficienti per generare canali vascolari ectatici. Le lesioni generate con LA CE mutante TIE2 o PIK3CA sono visibilmente vascolarizzate entro 7-u20129 giorni dall'iniezione e ricapitolano le caratteristiche istopatologiche del tessuto del paziente vm. Questo modello di xenotrapianto VM fornisce una piattaforma affidabile per studiare i meccanismi cellulari e molecolari che guidano la formazione e l'espansione delle macchine virtuali. Inoltre, questo modello sarà strumentale per gli studi traslazionali che testano l'efficacia dei nuovi candidati ai farmaci per prevenire l'allargamento anormale delle navi visto nella VM umana.
Introduction
I difetti nello sviluppo della vascolatura sono la causa alla base di molte malattie, tra cui la malformazione venosa (VM). Vm è una malattia congenita caratterizzata da morfogenesi anormale ed espansione delle vene1. Importanti studi sul tessuto della macchina virtuale e sulle cellule endoteliali (EC) hanno identificato mutazioni di guadagno di funzione in due geni: TEK, che codifica il recettore della chinasi della tirosina TIE2, e PIK3CA, che codifica l'isoforma di p110 (sottounità catalitica) di PI3-chinasi (PI3K)2,3,4,5. Queste mutazioni somatiche si trasgrede in un'iperattivazione indipendente dal ligando delle vie di segnalazione chiave angiogenica/crescita, compreso il PI3K/AKT, con conseguente vene ectatiche dilatate3. Nonostante queste importanti scoperte genetiche, i successivi meccanismi cellulari e molecolari che innescano l'angiogenesi anormale e la formazione di canali vascolari allargati non sono ancora pienamente compresi.
Durante l'angiogenesi normale e patologica, i nuovi vasi provengono da una rete vascolare preesistente e la CE subisce una sequenza di importanti processi cellulari tra cui la proliferazione, la migrazione, il rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) e la formazione del lume6. Le colture in vitro bidimensionali (2D/3D) della CE sono strumenti importanti per studiare ciascuna di queste proprietà cellulari singolarmente. Tuttavia, vi è una chiara richiesta di un modello murino che ricapitoli l'allargamento patologico delle navi all'interno del microambiente dell'ospite, fornendo al contempo una piattaforma efficiente per la valutazione preclinica di farmaci mirati per la ricerca traslazionale.
Fino ad oggi, non è stato segnalato un modello murino transgenico di VM associato a mutazioni di guadagno di funzione TIE2. Gli attuali modelli di topo VM transgenici si basano sull'espressione onnipresente o limitata ai tessuti della mutazione attiva PIK3CA p.H1047R3,5. Questi animali transgenici forniscono informazioni significative sugli effetti specifici di tutto il corpo o dei tessuti di questa mutazione hotspot PIK3CA. La limitazione di questi modelli è la formazione di una rete vascolare altamente patologica con conseguente precoce letalità. Pertanto, questi modelli murini non riflettono pienamente l'occorrenza sporadica di eventi mutazionali e la natura localizzata della patologia della macchina virtuale.
Al contrario, i modelli di xenotrapianto derivati dal paziente si basano sul trapianto o sull'iniezione di tessuto patologico o cellule derivate dai pazienti in topi immunodeficienti7. I modelli Xenotrapianto sono un potente strumento per ampliare le conoscenze sullo sviluppo della malattia e la scoperta di nuovi agentiterapeutici 8. Inoltre, l'utilizzo di cellule derivate dal paziente consente agli scienziati di ricapitolare l'eterogeneità della mutazione per studiare lo spettro dei fenotipi dei pazienti.
Qui, descriviamo un protocollo in cui la VM EC derivata dal paziente che esprime una forma mutante costitutivamente attiva di TIE2 e/o PIK3CA viene iniettata sottocutaneamente nella parte posteriore di topi nudi atimici. Le cellule vascolari iniettate sono sospese in un quadro ECM al fine di promuovere l'angiogenesi come descritto nei precedenti modelli di xenotrapianto vascolare9,10,11. Queste VM EC sono sottoposte a una significativa morfogenesi e generano vasi patologici allargati e perfuso in assenza di cellule di supporto. Il modello di xenotrapianto descritto di VM fornisce una piattaforma efficiente per la valutazione preclinica dei farmaci mirati per la loro capacità di inibire l'espansione incontrollato del lume.
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Protocol
I campioni di tessuto del paziente sono stati ottenuti dai partecipanti dopo il consenso informato dalla raccolta e dal deposito di campioni di tessuti e dati da pazienti con tumori e anomalie vascolari nell'ambito di un Comitato di revisione istituzionale (IRB) approvato per le politiche istituzionali presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute e con l'approvazione del Comitato per l'indagine clinica. Tutte le procedure relative agli animali descritte di seguito sono state esaminate e approvate dal CCHMC Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Preparazione dei materiali e delle soluzioni di stock
- Preparazione del mezzo completo di crescita cellulare endoteliale (EGM)
- Integrare il mezzo basale endoteliale (EBM) con i seguenti fattori di crescita presenti nel kit (vedi Tabella dei materiali): Fattore di crescita fibroblasta umano-Beta (hFGF-β), fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), Fattore di crescita a base di insulina lunga3- I (R3-IGF-I), acido ascorbico, fattore di crescita epidermico (EGF), solfato di gentamicina e amphotericin-B, ed epaina. Aggiungere la soluzione 1% Penicillina/Streptomicina/L-Glutamina (PSG) e il 20% di siero bovino fetale (FBS).
NOTA: Non è consigliabile aggiungere idrocortisone. - Filtrare sterilemente la soluzione sotto un cofano a flusso laminare attraverso un filtro superiore a bottiglia da 0,2 m in una bottiglia di vetro autoclaved e un supporto aliquot in tubi conici da 50 mL e conservare a 4 gradi centigradi fino a una settimana o a -20 gradi centigradi per un massimo di un anno.
- Integrare il mezzo basale endoteliale (EBM) con i seguenti fattori di crescita presenti nel kit (vedi Tabella dei materiali): Fattore di crescita fibroblasta umano-Beta (hFGF-β), fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), Fattore di crescita a base di insulina lunga3- I (R3-IGF-I), acido ascorbico, fattore di crescita epidermico (EGF), solfato di gentamicina e amphotericin-B, ed epaina. Aggiungere la soluzione 1% Penicillina/Streptomicina/L-Glutamina (PSG) e il 20% di siero bovino fetale (FBS).
- Preparare collagenase Una soluzione stock
- Preparare 50 mg/mL collagenasi Una soluzione di stock in 1x salina tampone di fosfato (PBS).
- Filtrare sterilemente la soluzione sotto un cappuccio a flusso laminare con filtro e siringa da 0,2 m e conservare 100 aliquots di lL a -20 gradi centigradi.
- Preparare il supporto di raccolta dei tessuti (Buffer A)
- Preparare una soluzione di stoccaggio Ca2/Mg2, aggiungendo 0,927 g di dihydrato di cloruro di calcio (CaCl2.2H2O) e 1 g di ettoidrato di solfato di magnesio (MgSO4.7H2O) a 500 mL di acqua distillata. Filtrare sterilemente la soluzione attraverso un filtro superiore a bottiglia da 0,2 m in una bottiglia di vetro autoclaved e conservare a temperatura ambiente (RT).
- Integrare il Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con la soluzione 10% Ca2/Mg2 e il 2% di FBS.
- Filtrare sterilemente la soluzione sotto un cappuccio a flusso laminare con filtro e siringa da 0,2 m e conservare aliquots di 5 mL a -20 gradi centigradi.
- Rivestimento fibronectina di piastre di coltura dei tessuti
- Preparare il tampone di rivestimento (Buffer B) sciogliendo 5,3 g di carbonato di sodio (Na2CO3; 0,1 M) in 500 mL di acqua deionizzata. Regolare il pH del buffer a 9,4 utilizzando 1 M di acido cloridrico (HCl). Filtrare sotto un cappuccio a flusso laminare attraverso un filtro top bottiglia da 0,2 m in una bottiglia di vetro autoclaved e conservare a RT.
- Per il rivestimento, pipetta 2 mL/5 mL/10 mL di buffer B per 60 mm/100 mm/145 mm piastra di coltura del tessuto, rispettivamente. Aggiungete 1 g/cm2 della soluzione di proteina purificata al plasma umano e distribuire delicatamente il liquido sulla piastra.
- Piastra incubata a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per 20 min.
- Aspirare Buffer B e lavare la piastra con PBS prima di cultre le cellule.
2. Isolamento delle cellule endoteliali dal tessuto del paziente VM
- Isolamento della CE dal tessuto solido della macchina virtuale
NOTA: il tessuto della macchina virtuale è risentito dalla chirurgia di debulking12,13 nell'ambito di un protocollo approvato dall'IRB.- Il tessuto VM di lavaggio (peso del campione di tessuto varia in genere tra 0,5 g e 1,5 g) nel 5% di PSG in PBS.
- Trasferire il tessuto in un piatto di coltura cellulare da 100 mm, tritare il campione di tessuto in piccoli pezzi utilizzando strumenti di dissezione chirurgica sterili e trasferirlo in un tubo conico da 50 mL.
- Aggiungere 100 L di collagenase Una soluzione di stock a 5 mL di Buffer A per una concentrazione finale di 1 mg/mL, quindi aggiungere questo al tessuto e digerire il tessuto macinato a 37 gradi centigradi per 30 min agitando il contenuto ogni 5 minuti.
- Macinare con cura il tessuto digerito a RT utilizzando una smerigliatrice di pestello di superficie liscia di 6 mm all'interno del tubo conico da 50 mL.
- Continuare a macinare con cura il tessuto digerito utilizzando un pestello aggiungendo 5 mL di PBS freddo integrato con 0.5% albumina di siero bovino (BSA) e 2% PSG. Ripetere questo passaggio quattro volte.
- Filtrare la soluzione attraverso un colino a cellule da 100 m in un tubo conico da 50 mL per rimuovere i frammenti di tessuto.
- Sospensione delle celle centrifughe per 5 min a 400 x g a RT. Procedere al punto 2.3.
- Isolamento della VM EC dal sangue lesionale ottenuto dalla scleroterapia del paziente
- Ottenere il sangue lesional VM umano dalla scleroterapia in base a un protocollo approvato IRB.
- Diluire il sangue lesionale (il volume del campione varia in genere tra 0,5 mL e 5 mL) in PBS ad un volume finale di 40 mL.
- Sospensione delle cellule Centrifuga per 5 min a 200 x g a RT.
- Placcatura iniziale delle cellule
- Scartare il supernatant e risundere il pellet a cella singola in 1 mL di EGM.
- Aggiungere 9 mL di EGM completo su piastre rivestite di fibronectina (1 g/cm2) e semi da 1 mL di sospensione cellulare.
- Incubare le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umidificata del 5% di CO2.
- Ogni altro giorno rimuovere 2 mL di supporti e aggiungere 2 mL di STERILE filtrato FBS.
- Una volta che le colture cellulari raggiungono una confluenza di 40 u201250% cambiare il mezzo per completare EGM. In genere ci vogliono tra 2-u20123 settimane per le cellule per raggiungere questa confluenza.
- Osservare ogni giorno per la comparsa di colonie CE. Possono essere riconosciuti dalla loro tipica morfologia "ciottone" (Figura 1A). In ogni campione appaiono tra le colonie EC di 3-u20125.
- Cambiare il mezzo ogni due giorni per altri 5-u20127 giorni fino a quando le singole colonie EC iniziano a toccarsi l'un l'altro.
- Isolamento manuale delle singole colonie CE
- Per raccogliere le colonie EC, lavare la piastra con 5 mL di PBS e aspirare manualmente con una pipetta sierologica.
- Portare la piastra al microscopio e circondare le posizioni di più colonie EC utilizzando una penna di marcatura sia sul coperchio che sul fondo prima di restituirla al cofano di flusso laminare.
- Scollegare le colonie CE mediante pipettamento 50 L della soluzione prova-EDTA dello 0,05% sulle aree contrassegnate.
- Utilizzando un piccolo raschietto a cellule o una punta di pipetta, raschiare delicatamente le cellule dalla piastra.
- Inclinare la piastra al bordo più vicino e risciacquare con 1 mL di EGM per area contrassegnata e raccogliere le cellule.
- Contare il numero di celle utilizzando un emocitometro o un contatore di celle automatizzato.
- Placcare le colonie CE raccolte ad una densità di 1 x10 4 cellule/cm2 su piatti di coltura cellulare rivestiti di fibronectina (1 g/cm2) contenenti EGM fresco. Il giorno successivo, cambiare mezzo per completare EGM.
- Cambiare il mezzo per completare EGM ogni due giorni per 2-u20123 settimane fino a quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza.
- Provare EC con 2 mL di metapsina-EDTA prerimosa per 100 mm a 37 gradi centigradi per 2 min e neutralizzare la metapsina aggiungendo 4 mL di EGM.
- Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 400 x g a RT per 5 min. Aspirare le cellule supernante e rispendere in 2 mL di EGM.
- Contare il numero di celle utilizzando un emocitometro o un contatore di celle automatizzato. I numeri di cellulare tipici ottenuti sono 1 x 106 celle per piastra di coltura cellulare 60 mm o 2 x 106 cellule per piastra di coltura del tessuto 100 mm.
- Pellet le cellule per centrifugazione a 400 x g a RT per 5 min e aspirare il supernante. Procedere al punto 3.2.1.
3. Selezione ed espansione delle cellule endoteliali
- Preparazione di perline magnetiche anti-CD31-coniugate
- Vortex la fiala contenente le perline magnetiche anti-CD31-coniugate per 30 s. Il numero di perline richieste è 8 x 106 perline / 2 x 106 celle.
- Lavare la quantità desiderata di perline magnetiche anti-CD31 coniugate con 1 mL di soluzione di lavaggio contenente 0,1% BSA in PBS in un tubo microcentrifuge da 1,5 mL.
- Posizionare il tubo microcentrifuge in un magnete di isolamento cellulare per 1 min.
- Aspirare il supernatant e ripetere il passaggio di lavaggio.
- Purificazione e placcatura delle cellule endoteliali
- Pellet cellulare di riespettazione ottenuto in 2.4.12 in 500 L di soluzione di lavaggio contenente 0.1% BSA in PBS.
- Aggiungere la soluzione cellulare al tubo microcentrifuge contenente perline magnetiche e riesposo accuratamente.
- Incubare per 20 minuti a 4 gradi centigradi con leggera inclinazione.
- Aggiungere 500 L dello 0,1% BSA in PBS e mescolare bene.
- Posizionare il tubo su un magnete di isolamento cellulare per 1 min.
- Aspirare delicatamente tutto il liquido, che contiene la frazione di cellule CD31-negativa senza toccare le perline.
- Lavare il pellet di perline contenente la frazione di cella POSITIVA CD31 con 1 mL dello 0,1% BSA in PBS e ripetere la separazione magnetica.
- Ripetere il lavaggio e la separazione magnetica per un minimo di 3 volte per purificare la frazione di cellule CD31-positive.
- Rispendere le cellule endoteliali purificate in un tubo conico da 15 mL e girare verso il basso per 5 min a 400 x g a RT.
- Rimuovere il pellet cellulare supernatant e resuspend in 1 mL di EGM.
- Aggiungere 9 mL di EGM completo su piastre rivestite di fibronectina (1 g/cm2) e semi da 1 mL di sospensione cellulare. Si noti che alcune perline magnetiche sono ancora attaccate alle cellule in questa fase iniziale di semina. La maggior parte delle perline si lavano via durante l'espansione cellulare, ma un piccolo numero di perline può persistere nei primi passaggi.
- Incubare le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umidificata del 5% di CO2.
- Modificare il supporto a giorni in su fino a raggiungere l'80 % di confluenza (Figura 1B).
- Espansione delle cellule endoteliali
- Una volta che le cellule raggiungono l'80 % di confluenza, staccare con 2 mL di 0,05% trypsin-EDTA per 100 mm piatto a 37 gradi centigradi per 2 min.
- Neutralizzare la trypsina aggiungendo 4 mL di EGM e raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 mL.
- Centrifuga a 400 x g a RT per 5 min.
- Aspirare il supernatante, rispendere le cellule in 2 mL di EGM, e contare il numero di cellule con un emocitometro o con il conteggio automatico delle cellule.
- Cellule di semi ad una densità di 1 x 104 cellule/cm2 in piastre di coltura dei tessuti rivestite di fibronectina da 145 mm (1 g/cm2).
- Continuare a passare le celle fino a quando non è stato soddisfatto il numero di cella desiderato. Si consideri che una piastra di coltura del tessuto confluente 145 mm contiene circa 8 u20129 x10 6 cellule e il numero di cellule necessarie è 2,5 x 106 cellule per iniezione. Solo le cellule tra il passaggio 3 e 8 devono essere considerate per lo xenotrapianto.
4. Protocollo xenotrapianto derivato dal paziente VM
NOTA: In questo protocollo usiamo topinu nu athymic nude Foxn1 nu di 5-u20126.
Tutte le procedure relative agli animali devono essere approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
- Preparazione dei materiali il giorno prima dell'iniezione
- Siringhe, aghi e punte di pipetta pre-freddo in freezer a -20 gradi centigradi durante la notte.
- Scongelare lentamente la membrana intercastrata a matrice extracellulare (BMEM) durante la notte sul secchio di ghiaccio posto a 4 gradi centigradi per evitare una maggiore viscosità del gel.
- Preparazione della sospensione cellulare per l'iniezione
- Trypsinize EC con 5 mL di pre-riscaldato 0.05% trypsin-EDTA per 145 mm piatto a 37 s per 2 min.
- Neutralizzare la trypsina aggiungendo 5 mL di EGM e raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 mL.
- Centrifuga a 400 x g a RT per 5 min.
- Aspirare il supernante, rispendere le cellule in 3 mL di EGM, e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o contatore cellulare automatizzato.
- Determinare il numero totale di celle necessarie per tutte le iniezioni pianificate.
NOTA: Il numero consigliato di cellule è 2,5 x 106 celle per iniezione. Un totale di 2 iniezioni sono in genere eseguite in ogni mouse per i duplicati tecnici. È necessario calcolare un 10% in eccesso di numero di cellulare per tenere conto della perdita durante il trasferimento nella siringa. - Trasferire il volume contenente il numero di cella calcolato in un nuovo tubo conico da 50 mL e cellule di pellet per centrifugazione a 400 x g a RT per 5 min.
- Aspirare il supernante, lasciando un piccolo volume (circa 50-u201270 L) per allentare il pellet.
- Preparazione delle siringhe
- Calcolare un volume in eccesso di 20 L/iniezione per tenere conto della perdita durante il trasferimento alla siringa. Rispendere il pellet cellulare con 220 L di BMEM per iniezione sul ghiaccio. Il volume iniettato delle sospensioni cellulari sarà di 200 L per lesione.
- Mescolare accuratamente la sospensione delle cellule sul ghiaccio per ottenere una sospensione omogenea delle cellule ed evitare di creare bolle.
- Utilizzando una pipetta da 1 mL e una siringa da 1 mL, contemporaneamente pipetta la miscela di cellule BMEM nell'apertura della siringa mediante forza di aspirazione mentre si tira lo stantuffo di siringa.
- Luer bloccare un ago sterile 26G x 5/8 pollici alla siringa e mantenere le siringhe preparate piatto sul ghiaccio prima dell'iniezione.
- Iniezione sottocutanea nel topo
- Anestesizzare i topi con una miscela di isoflurane/ossigeno del 5% ad una velocità di flusso di 1 L/min utilizzando un vaporizzatore isoflurane. Garantire la sedazione corretta degli animali (ad esempio, la mancata risposta ai pizzichi delle dita dei piedi). Mantenere l'anestesia tramite somministrazione continua dell'1,5% di isoflurane/ossigeno erogato tramite cono naso.
- Posizionare i topi sullo stomaco, esponendo la regione posteriore dove si verificherà l'innesto e disinfettare la regione di iniezione con il 70% di etanolo.
- Arrotolare delicatamente la siringa preparata per risospendere eventuali cellule stabilite. Flick bolle all'estremità dell'ago della siringa ed espellere un piccolo volume della sospensione cellulare per garantire la rimozione di tutte le bolle.
NOTA: È possibile eseguire due iniezioni per ogni mouse, sul lato sinistro e destro del mouse indietro. - Pizzica e crea una struttura simile a una tenda usando il pollice e l'indice e inserisci l'ago sottocutaneamente sotto la pelle. Assicurarsi che l'ago sia solo profondo della pelle rilasciando la pelle pizzicata per prevenire l'iniezione nel tessuto muscolare.
- Tenendo l'ago ad angolo di 45 gradi iniettare con cura 200 L della sospensione cellulare per creare una piccola massa sferica (Figura 1C).
- Registrare il peso del mouse con una scala, etichettare l'orecchio il mouse e tornare in gabbia.
- Monitorare i topi dopo la sedazione per assicurarsi che tornino alla normale attività.
- Monitoraggio della crescita delle lesioni
- Utilizzando una pinna, misurare la lunghezza e la larghezza di ciascuna spina (Figura 1D).
- Documentare le misurazioni a giorni in su fino alla raccolta delle lesioni.
5. Raccolta e lavorazione dei tessuti
- Eutanasia i topi 9 giorni dopo l'impianto in una camera di CO2 e controllare i segni vitali per confermare la morte. Eseguire la lussazione cervicale sui topi come metodo secondario per eutanasia del mouse.
- Raccogliere la lesione/spina dello xenotrapianto dal fianco del topo con la dissezione utilizzando forbici e forbici chirurgiche.
NOTA: Al fine di evitare la rottura dei vasi riempiti di sangue all'interno della spina, è importante evitare di toccare il plug della lesione con strumenti di dissezione e lasciare un tessuto circostante eccessivo come la pelle attaccata alla spina. - Immergere la lesione resected in PBS per lavare.
- Impostare un palco della fotocamera con una fotocamera. Allineare le spine su un tagliere con un righello. Scattare un'immagine di tutte le spine per registrare la vascolarizzazione lorda delle lesioni (Figura 1E).
- Fissare le spine immergendosi in formalina 10% durante la notte a RT.
- Lavare le spine in PBS il giorno seguente e spostarle nel 70% di etanolo.
- Tappi di lesione di processo per l'incorporamento di paraffina (nucleo di patologia).
6. Sezione di lesione
- Utilizzare un microtomo per tagliare le sezioni di 5 m dalle lesioni murine raccolte su diapositive caricate positivamente.
NOTA: Per l'analisi successiva, le sezioni al centro della spina (circa 50-u201270 m nel tessuto) sono importanti. - Sciogliere la paraffina a 60 gradi centigradi per 1 h prima della colorazione.
- De-paraffinare e ri-idratare il tessuto in sequenza sotto un cappuccio di flusso di fumi chimici. Pertanto, incubare diapositiva in xylene per 10 min, 100% etanolo (EtOH) per 5 min, 90% EtOH per 3 min, e 80% EtOH per 3 min.
- Sciacquare lo scivolo in acqua deionizzata per 5 minuti.
7. Ematossilina ed Eosin (H&E)
- Incubare sezioni in Hematoxylin per 2 min.
- Mettere gli scivoli in un barattolo di colorazione e risciacquare in un lavandino da un flusso costante di acqua del rubinetto fino a quando l'acqua è limpida.
- De-idratare scivola incubando il tessuto in sequenza nel 70% EtOH per 1 min, 80% EtOH per 1 min, 90% EtOH per 1 min, 100% EtOH per 1 min e fresco 100% EtOH per 1 min.
- Sezioni di macchie in Eosin Y per 30 s.
- Risciacquare in EtOH fresco al 100% fino a quando la soluzione non è chiara.
- Incubare scivolo in xylenes per 2 min. Lasciare asciugare le vetrini per 5-u201210 min sotto il cofano dei fumi.
- Eroga una goccia di mezzo di montaggio permanente e non aqueo su sezioni di xenotrapianti e posiziona il coperture sulla parte superiore.
- Lasciare asciugare i vetrini durante la notte prima dell'imaging.
8. Immunohistochimica
- Preparare il buffer di recupero dell'antigene (Tris-EDTA) pesando 0,6 g di Tris-base e 1 mL da 0,5 M EDTA a 500 mL di acqua deionizzata. Regolare il pH a 9,0 utilizzando 1 M HCl. Aggiungere 250 L di Tween-20.
- Incubare vetrini di tessuto de-paraffinato (come ottenuto al punto 6.2-u20126.3) in un becher con buffer di recupero dell'antigene, mescolando su un blocco di riscaldamento, per 20 min a 95 gradi centigradi.
- Togliere il becher dal blocco di riscaldamento, lasciare raffreddare la soluzione a 35 gradi centigradi e poi lavare in PBS per 3 minuti.
- Bloccare le sezioni di tessuto nel 5% di siero di cavallo normale in PBS per 30 min a RT.
- Preparare una soluzione di lavoro ulex europaeus agglutinin-I (UEA-I) biotinicolante diluizione di 20 g/mL di UEA-I biotinilato nel 5% di siero di cavallo normale in PBS.
- Pipetto 50-u2012100 di soluzione di lavoro UEA-I per sezione e incubare per 1 h a RT in una camera umidificante.
- Lavare le diapositive due volte in PBS per 3 min.
- Sezioni di scorrimento del 3% di perossido di idrogeno per 5 min a RT.
- Lavare le diapositive due volte in PBS per 3 min.
- Preparare 5 g/mL di Streptavidin rafano perossiidsi-coniugato nel 5% di siero di cavallo normale in PBS.
- Pipetto 50-u2012100 L su ogni scivolo di tessuto e incubare per 1 h a RT in una camera umidificante.
- Lavare le diapositive due volte in PBS per 3 min.
- Preparare la soluzione 3,3'Diaminobenzidine (DAB) secondo le istruzioni del produttore e aggiungere 50,u2012100 per sezione.
- Incubare sezioni per 10-u201215 min, il controllo e il monitoraggio per lo sviluppo di macchia ogni 2 u20125 min.
- Lavare le diapositive tre volte in PBS per 3 min.
- Aggiungere una goccia di ematossilina e incubare per 3 minuti.
- Mettere gli scivoli in un barattolo di colorazione e risciacquare in un lavandino da un flusso costante di acqua del rubinetto fino a quando l'acqua è limpida.
- Scivolare in sequenza nell'80% etOH per 1 min, 90% EtOH per 1 min, 100% EtOH per 1 min e xylene per 2 min.
- Lasciare asciugare le vetrini per 5-u201210 min sotto il cofano dei fumi.
- Eroga una goccia di mezzo di montaggio permanente e non aqueo su sezioni di xenotrapianti e posiziona il coperture sulla parte superiore.
- Lasciare asciugare i vetrini durante la notte prima dell'imaging.
9. Analisi dei canali vascolari derivati dall'uomo
NOTA: La vascolarizzazione delle lesioni VM è quantificata misurando l'area vascolare e la densità vascolare. Solo i canali vascolari positivi UEA-I derivati dall'uomo sono considerati per la quantificazione.
- Prendere da quattro a cinque immagini per sezione di lesione con un microscopio a campo luminoso ad un ingrandimento 20x (campi ad alta potenza [HPF]). Prendere immagini HPF in un modello di piano x all'interno della sezione di lesione per evitare sovrapposizioni (Figura 1F-H). Includere una barra della scala nelle immagini scattate.
- Aprire le immagini HPF in Immagine J (File > Apri). Calibrare i pixel della barra della scala come segue. Utilizzare lo strumento linea retta e passare sopra la barra della scala. Per convertire i pixel misurati in mm, fare clic su Analizza > Imposta scala.
- Fare clic su Analizza > Imposta misure e selezionare Area e Aggiungi alla sovrapposizione.
- Misurare l'area totale del campo in un HPF utilizzando Analizza > Misura. Salvare questa misura per la quantificazione al punto 9.8.
- Utilizzando lo strumento selezioni a mano libera,+ delineare manualmente i canali vascolari UEA-I.
NOTA: Un canale vascolare è definito come qualsiasi area+ che è fiancheggiata da UEA-I - EC che può contenere cellule del sangue. - Fare clic su Analizza > Misura per quantificare l'area vascolare UEA-I+ delineata (mm2/HPF).
- Ripetere questa misura per tutti e cinque gli HPF presi all'interno di una spina.
- Media dell'area vascolare totale di tutti e cinque gli HPF. L'area vascolare ottenuta per HPF viene successivamente divisa per l'area di campo HPF (in mm2, passo 9.5) ed espressa in percentuale (%).
- Per la quantificazione della densità vascolare, contare+ il numero di canali vascolari UEA-I di ogni HPF preso. La densità vascolare è il numero+ medio di canali vascolari UEA-I conteggiati per area HPF (navi/mm2).
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Representative Results
Questo protocollo descrive il processo di generazione di un modello murine xenotrapianto di VM basato sull'iniezione sottocutanea della EC derivata dal paziente nella parte posteriore di topi nudi immunodeficienti. Le colonie di cellule endoteliali possono essere raccolte entro 4 settimane dall'isolamento iniziale delle cellule dal tessuto VM o dal sangue lesionale(Figura 1A,B). Il giorno dopo l'iniezione, la spina di lesione xenotrapianto copre una superficie di circa 80 u2012100 mm2. Nelle nostre mani, le spine di lesione con TIE2/PIK3CA-mutante EC sono visibilmente vascolarizzate e perfuse entro 7 u20129 giorni dall'iniezione 14,15 ( Figura1C-E). Tuttavia, l'entità della crescita della lesione è variabile e riflette sull'eterogeneità del paziente e del campione.
I tappi di lesione ricapitolano da vicino le caratteristiche istopatologiche del tessuto umano della macchina virtuale: canali vascolari ingranditi rivestiti da un sottile strato di cellule endoteliali (Figura 1F-u2012H). Queste strutture vascolari contengono in genere erythrocytes, confermando gli anastomosi funzionali con la vascolatura del mouse host (Figura 1F -u2012H). La colorazione immunostochimica utilizzando la lectina specifica umana UEA-I può confermare che le cellule che rivestono lesioni vascolari sono derivate da cellule impiantate dall'uomo piuttosto che dalla vascolatura del topo (Figura 1H). Uno schema che riassume i passaggi dall'isolamento VM-EC alla dissezione della spina di lesion è presentato nella Figura 2.
Figura 1: Risultati dei rappresentanti.
(A) Immagine rappresentativa della coltura primaria delle cellule miste tre settimane dopo l'isolamento dal tessuto della macchina virtuale prima della selezione CE. Tipica colonia di cellule endoteliali (EC) e fibroblasta contaminante (FB). (B) Immagine di una coltura cellulare endoteliale purificata (selezione del tallone CD31) dal tessuto derivato dal paziente della macchina virtuale. Barra della scala - 200 m. (C) La lesione formerà una struttura sferica. La vascolarizzazione è visibile a causa del colore bluastro attraverso la pelle dei topi nudi. (D) Le linee tratteggiate mostrano come la dimensione della lesione viene ricodificata misurando la lunghezza (L) e la larghezza (W) utilizzando una pinca. (E) Foto di lesione visibilmente vascolarizzata, xenograft explant al giorno 9. Barra della scala : 1 cm. (F) Immagine rappresentativa di una sezione del plug di lesione. Il modello x-piano in cui vengono scattate cinque immagini di campo ad alta potenza per la quantificazione è indicato da caselle tratteggiate bianche. Barra della scala : 1000 m. (G-u2012H) Immagini rappresentative delle sezioni della spina di lesione della macchina virtuale. (G) Hematoxylin e Eosin colorazione e (H) immunohistochimica di lectina specifica umana UEA-I. Barra della scala : 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema del flusso di lavoro per generare uno xenotrapianto derivato dal paziente della macchina virtuale.
(A) Le cellule endoteliali isolate dal tessuto solido del paziente o dal sangue lesionale sono placcate e, quando viene raggiunta l'80% di confluenza, vengono selezionate da perline immunomagnetiche anti CD31 e ampliate. (B) Per l'iniezione sottocutanea di EC, il giorno 0, la pelle sul retro del topo viene pizzicata utilizzando l'indice e il pollice per creare una struttura simile a una tenda. Le lesioni vengono misurate al giorno 1 e poi ogni altro giorno (frecce rosse) utilizzando una pinna attraverso il giorno sperimentale 9. Le lesioni vengono sezionate ed elaborate per l'analisi itologica. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui viene descritto un metodo per generare un modello xenotrapianto derivato dal paziente della macchina virtuale. Questo modello murino presenta un eccellente sistema che consente ai ricercatori di ottenere una comprensione più profonda dell'allargamento del lume patologico e sarà determinante nello sviluppo di terapie più efficaci e mirate per il trattamento della VM. Questo può essere facilmente adattato per studiare altri tipi di anomalie vascolari come la malformazione venosa linfatica capillare16. Ci sono diversi passaggi che sono cruciali per la generazione di successo di lesioni vascolari riproducibili. In primo luogo, le cellule endoteliali derivate dal paziente devono essere pure (senza la presenza di altri tipi di cellule) e in crescita esponenziale al momento dell'iniezione. La morfologia o altri non-EC mesenchimal possono essere facilmente riconosciuti dalla morfologia allungata. In rare occasioni, è possibile che anche dopo la purificazione mediante anticorpi anti-CD31 coniugati perle magnetiche, un piccolo numero di extra-EC rimanga nella cultura. Queste colture richiedono un'ulteriore purificazione con marcatori di superficie cellulare specifici endoteliali. Come approccio alternativo, è possibile un'espansione clonale a singola cellula delle cellule endoteliali. Ciò ricurverebbe l'omogeneità della CE mutante, poiché tutte le cellule all'interno di una coltura deriverebbero da una singola cellula. Tuttavia, questo approccio non è raccomandato per la CE derivata da VM in quanto le cellule tendono a superiore le loro capacità di proliferazione e convertire in un fenotipo senescente dopo 9-u201210 passaggi. È fondamentale utilizzare le cellule tra i passaggi 3-u20128 per gli esperimenti di xenotrapianto e non passare le cellule il giorno prima dell'iniezione.
Il modello xenotrapianto può essere modificato per studiare altre anomalie vascolari che portano diverse mutazioni attivanti. Inoltre, poiché i campioni di tessuto del paziente sono difficili da accedere per alcuni laboratori, il modello di xenotrapianto può essere adattato utilizzando la CE, come le cellule endoteliali del cordone ombelicale umano (HUVEC), geneticamente progettate per esprimere la mutazione/s nota per causare una crescita vascolare disfunzionale15,17.
Il numero di cellule raccomandate per l'iniezione nello xenotrapianto è 2,5 x10 6 cellule/200 L di BMEM. Tuttavia, se il numero di cellule è insufficiente, è possibile ridurre il numero di iniezioni per animale a uno o ridurre il volume di iniezione ad un minimo di 100 L. Per quest'ultimo, è tuttavia importante mantenere il rapporto di densità cellulare, ad esempio, 1,25 x10 6 cellule/100 BMEM. Quando si lavora con BMEM, tutti i passaggi devono essere eseguiti sul ghiaccio per evitare la solidificazione della sospensione cellulare prima dell'iniezione. Durante l'iniezione, è importante e che l'ago viene inserito con un angolo di 45 gradi direttamente sotto la pelle e lontano dal tessuto muscolare, poiché l'iniezione nel muscolo impedisce la riproducibilità della lesione e rende difficile la dissezione della lesione. Su ogni topo possono essere eseguite in totale due iniezioni, una a destra e una sul lato sinistro di ogni animale. La seconda iniezione nello stesso mouse può servire come una replica tecnica. Più iniezioni sul retro non sono raccomandati come lesioni crescono nel tempo e potrebbe interferire con l'altro. Per l'analisi statistica in studi precliccali che confrontano tappi di xenotrapianto di topi trattati con topi trattati con solo veicoli, si consiglia l'uso di un minimo di 5 animali (10 tappi di xenotrapianto) per gruppo di studio. Se disponibile, la seconda iniezione potrebbe in alternativa essere utilizzata come "controllo interno" utilizzando CE non mutante. Abbiamo usato CE primario non mutante, come HUVEC, come un controllo e abbiamo dimostrato che queste cellule hanno formato un numero trascurabile di piccolicanali 14,15. Inoltre, in questi tappi di lesione di controllo HUVEC, abbiamo notato l'infiltrazione di canali vascolari derivati dal murino nella spina dopo il giorno 9. Se il progetto sperimentale richiede tempi di incubazione più lunghi, questi canali infiltrati possono essere facilmente esclusi dall'analisi colorando per un marcatore specifico dell'uomo come l'anticorpo CD31 specifico per l'uomo o Ulex europaeus agglutinin I (UEA-I) che non reagisce con il topo.
Per garantire che la lesione non diventi un peso per la salute e il benessere degli animali è importante osservare le dimensioni della lesione, registrare il peso del topo ogni giorno e prestare attenzione a eventuali complicazioni laterali come sanguinamento e lividi. Se il volume della lesione supera i 500 mm3, l'esperimento deve essere terminato.
Quando le lesioni vascolari sono ingrandite e perfuse, è necessario prestare estrema attenzione durante la dissezione per evitare di la rottura della lesione. È importante evitare di toccare il plug-in della lesione con strumenti di dissezione e lasciare il tessuto circostante eccessivo (come la pelle) attaccato alla spina. Ciò impedisce il collasso delle strutture vascolari all'interno della spina xenotrapianto che interferirebbe con un'analisi accurata.
Infine, per mantenere la coerenza, è importante che l'analisi istologica iniziale inizi al centro della spina (circa 50-u201270 m nel tessuto) piuttosto che nelle regioni di confine in cui potrebbe essere presente una vascolatura del topo anastomosing. Si raccomanda vivamente di macchiare le sezioni di tessuto con un marcatore CE specifico per l'uomo, come l'UEA-I o un anticorpo alternativo specifico per l'uomo che non reagisca con il topo, al fine di confermare che le strutture vascolari sono formate da CE derivata dall'uomo piuttosto che invadere la CE.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interessi da divulgare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Nora Lakes per la correzione delle bozze. La ricerca riportata in questo manoscritto è stata supportata dal National Heart, Lung, and Blood Institute, sotto il premio numero R01 HL117952 (E.B.), parte del National Institutes of Health. Il contenuto è esclusivamente di competenza degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
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