वेनस कुरूपता के लिए एक रोगी-व्युत्पन्न Xenograft मॉडल
Summary
हम शिरायस कुरूपता का एक मुरीन ज़ेनोबेड़ा मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह मॉडल रोगी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं के चमड़े के नीचे इंजेक्शन पर आधारित है जिसमें हाइपर-एक्टिवेट टाई2 और/या PIK3CA जीन म्यूटेशन होते हैं । Xenograft घावों बारीकी से वीएम रोगी ऊतक की हिस्टोपैथोलॉजिकल सुविधाओं को पुनः काटना।
Abstract
वेनस कुरूपता (वीएम) एक संवहनी विसंगति है जो शिरीन नेटवर्क के बिगड़ा विकास से उत्पन्न होती है जिसके परिणामस्वरूप फैली हुई और अक्सर बेकार नसों। इस लेख का उद्देश्य ध्यान से एक मुरीन ज़ेनोबेड़ा मॉडल की स्थापना का वर्णन करना है जो मानव वीएम की नकल करता है और रोगी विषमता को प्रतिबिंबित करने में सक्षम है। एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) में हाइपर-एक्टिवेटिंग गैर-विरासत (दैहिक) टेक (TIE2) और PIK3CA म्यूटेशन को वीएम में पैथोलॉजिकल पोत वृद्धि के मुख्य ड्राइवरों के रूप में पहचाना गया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल उत्परिवर्ती TIE2 और/या PIK3CA व्यक्त रोगी व्युत्पन्न चुनाव आयोग के अलगाव, शुद्धि और विस्तार का वर्णन करता है । इन ईसी को एक्टाटिक वैस्कुलर चैनल उत्पन्न करने के लिए इम्यूनोडिफिशल एथेमिक चूहों के पीछे चमड़े के इंजेक्शन दिए जाते हैं। TIE2 या PIK3CA-उत्परिवर्ती चुनाव आयोग के साथ उत्पन्न घावों इंजेक्शन के 7 \ u20129 दिनों के भीतर संवहनी दिख रहे है और वीएम रोगी ऊतक की हिस्टोपैथोलॉजिकल सुविधाओं का पुनर्पूंजीकरण । यह वीएम ज़ेनोबेड़ा मॉडल वीएम गठन और विस्तार को चलाने वाले सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए एक विश्वसनीय मंच प्रदान करता है। इसके अलावा, यह मॉडल मानव वीएम में देखे गए असामान्य पोत वृद्धि को रोकने में उपन्यास दवा उम्मीदवारों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने वाले अनुवादात्मक अध्ययनों के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाता होगा।
Introduction
वैक्यूलेचर के विकास में दोष शिराय कुरूपता (वीएम) सहित कई बीमारियों का अंतर्निहित कारण हैं। वीएम एक जन्मजात रोग है जो असामान्य रूपोजेने की बीमारी है और नसों का विस्तार होता है1. वीएम ऊतक और एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) पर महत्वपूर्ण अध्ययनों ने दो,जीनों में लाभ-कार्य उत्परिवर्तनों की पहचान की है: टेक,जो टायरोसिन किनेज़ रिसेप्टर TIE2, और PIK3CAको एन्कोड करता है, जो पी110α (उत्प्रेरक उपइका) को एन्कोड करता है PI3-kinase (PI3K)2,3,4,5।,, इन दैहिक उत्परिवर्तनों के परिणामस्वरूप PI3K/AKT सहित प्रमुख एंजियोजेनिक/विकास सिग्नलिंग रास्तों के लिगांड-स्वतंत्र हाइपर-एक्टिवेशन होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप फैली हुई एक्टेटिक नसें3होती हैं । इन महत्वपूर्ण आनुवंशिक खोजों के बावजूद, असामान्य एंजियोजेनेसिस को ट्रिगर करने वाले बाद के सेलुलर और आणविक तंत्र और बढ़े हुए संवहनी चैनलों के गठन को अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहा है।
सामान्य और पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस के दौरान, नए जहाजों को पहले से मौजूद संवहनी नेटवर्क से अंकुरित किया जाता है और ईसी प्रसार, प्रवासन, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) रिमॉडलिंग और ल्यूमेनगठन 6सहित महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं के अनुक्रम से गुजरता है। ईसी की विट्रो संस्कृतियों में दो और त्रि-आयामी (2D/3D) व्यक्तिगत रूप से इन सेलुलर गुणों में से प्रत्येक की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। फिर भी, अनुवाद अनुसंधान के लिए लक्षित दवाओं के पूर्व-नैदानिक मूल्यांकन के लिए एक कुशल मंच प्रदान करते हुए मेजबान माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर पैथोलॉजिकल पोत वृद्धि को पुनः प्राप्त करने वाले माउस मॉडल की स्पष्ट मांग है।
आज तक, TIE2 गेन-ऑफ-फंक्शन म्यूटेशन से जुड़े वीएम के ट्रांसजेनिक मुरीन मॉडल की रिपोर्ट नहीं की गई है। वर्तमान ट्रांसजेनिक वीएम माउस मॉडल सक्रिय उत्परिवर्तन PIK3CA p.H1047R3,,5की सर्वव्यापी या ऊतक-प्रतिबंधित अभिव्यक्ति पर भरोसा करते हैं। ये ट्रांसजेनिक जानवर इस हॉटस्पॉट PIK3CA उत्परिवर्तन के पूरे शरीर या ऊतक-विशिष्ट प्रभावों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इन मॉडलों की सीमा एक अत्यधिक रोग संवहनी नेटवर्क का गठन है जिसके परिणामस्वरूप प्रारंभिक घातकता होती है। इस प्रकार, ये माउस मॉडल वीएम पैथोलॉजी की उत्परिवर्तनीय घटनाओं और स्थानीयकृत प्रकृति की छिटपुट घटनाओं को पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं करते हैं।
इसके विपरीत, रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोबेड़ा मॉडल रोग रोग ऊतक या रोगियों से प्राप्त कोशिकाओं के प्रत्यारोपण या इंजेक्शन पर आधारित हैं इम्यूनोडिडेंट चूहों में7। Xenograft मॉडल रोग के विकास और उपन्यास चिकित्सकीय एजेंटों की खोज के बारे में ज्ञान को व्यापक बनाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं8. इसके अलावा, रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग करने से वैज्ञानिकों को रोगी फेनोटाइप के स्पेक्ट्रम का अध्ययन करने के लिए उत्परिवर्तन विषमता को पुनः प्राप्त करने की अनुमति देता है ।
यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जहां रोगी-व्युत्पन्न वीएम ईसी जो TIE2 के एक उत्परिवर्ती संविलियन-सक्रिय रूप को व्यक्त करता है और/या PIK3CA को एथिमामिक नग्न चूहों के पीछे चमड़े के इंजेक्शन दिए जाते हैं । इंजेक्शन संवहनी कोशिकाओं को ईसीएम ढांचे में निलंबित किया जाता है ताकि एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा दिया जा सके जैसा कि पिछले संवहनी ज़ेनोबेड़ा मॉडल 9 ,10,,11में वर्णित है ।10 ये वीएम ईसी महत्वपूर्ण रूपोजेने की मात्रा से गुजरते हैं और सहायक कोशिकाओं के अभाव में बढ़े हुए, छिद्रित रोग वाहिकाओं उत्पन्न करते हैं। वीएम का वर्णित ज़ेनोबेड़ा मॉडल अनियंत्रित ल्यूमेन विस्तार को बाधित करने की क्षमता के लिए लक्षित दवाओं के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के लिए एक कुशल मंच प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम वीएम के रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोबेड़ा मॉडल उत्पन्न करने की विधि का वर्णन करते हैं। यह मुरीन मॉडल एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रस्तुत करता है जो शोधकर्ताओं को पैथोलॉजिकल ल्यूमेन इज़ाफ़ा की गहरी समझ हा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक प्रूफरीडिंग के लिए नोरा झीलों का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । इस पांडुलिपि में रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के हिस्से पुरस्कार संख्या R01 HL117952 (ई.बी. के तहत राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है ।
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
References
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