Summary
Ce protocole décrit une application de l’hybridation in situ de fluorescence monomolécule (smFISH) pour mesurer la cinétique in vivo de la synthèse et de la dégradation de l’ARNm.
Abstract
L’hybridation in situ de fluorescence monomolécule permet de compter le nombre absolu d’ARNms dans les cellules individuelles. Ici, nous décrivons une application de smFISH pour mesurer les taux de transcription et de dégradation de l’ARNm chez Escherichia coli. Comme smFISH est basé sur des cellules fixes, nous effectuons smFISH à plusieurs moments au cours d’une expérience de cours de temps, c’est-à-dire lorsque les cellules subissent des changements synchronisés lors de l’induction ou la répression de l’expression des gènes. À chaque moment, les sous-régions d’un ARNm sont spectralement distinguées pour sonder l’allongement de la transcription et la terminaison prématurée. Le résultat de ce protocole permet également d’analyser la localisation intracellulaire des ARNms et l’hétérogénéité dans les numéros de copie d’ARNm parmi les cellules. L’utilisation de ce protocole de nombreux échantillons (~50) peut être traitée dans les 8 heures, comme le temps nécessaire pour seulement quelques échantillons. Nous discutons de la façon d’appliquer ce protocole pour étudier la cinétique de transcription et de dégradation de différents ARNms dans les cellules bactériennes.
Introduction
Le flux d’informations génétiques de l’ADN à l’ARNm et aux protéines est l’un des processus cellulaires les plus fondamentaux, dont la régulation est importante pour la condition physique cellulaire1. Le nombre d’ARNms dans une cellule est déterminé par deux processus dynamiques, la transcription et la dégradation de l’ARNm. Cependant, la façon dont la transcription et la dégradation de l’ARNm sont réglementées dans le temps et l’espace d’une seule cellule ne sont pas complètement comprises, en grande partie en raison de la pénurie de méthodes expérimentales pour mesurer quantitativement leur cinétique in vivo.
Les méthodes basées sur le total des ARNms extraits d’une population de cellules, telles que la tache nordique, RT-PCR, séquençage de l’ARN et les microarrays d’expression génique, peuvent mesurer la différence relative dans les niveaux d’ARNm et ont été largement utilisées pour analyser le taux d’élongation de transcription2,3,4,5 ou le taux de dégradation de l’ARNm6,7. Cependant, ils ne fournissent pas le nombre absolu d’ARNm par cellule, et donc, ils ne sont pas appropriés pour sonder le taux d’initiation de transcription8. En outre, étant donné que les ARNm sont extraits d’une population de cellules, la distribution spatiale des ARNms à l’intérieur d’une seule cellule et la variabilité des nombres de copies d’ARNm entre les cellules ne peuvent pas être mesurées.
Le séquençage de l’ARN de nouvelle génération sur des cellules individuelles (scRNAseq) peut quantifier le nombre d’ARNms par cellule dans une échelle génomique9. Cependant, il reste difficile d’utiliser cette technique pour mesurer la cinétique de transcription, en raison de défis avec la préparation de l’échantillon et le coût élevé. En particulier, l’application de scRNAseq aux bactéries a été techniquement difficile en raison de l’abondance faible de l’ARNm10,11.
L’hybridation in situ de fluorescence monomolécule (smFISH) est basée sur l’hybridation de sondes mono-échouées étiquetées fluorescentement dont les séquences sont complémentaires à l’ARNm cible d’intérêt12,13. Le concept d’hybridation spécifique à la séquence est similaire à celui utilisé dans northern blot ou RT-PCR, mais l’hybridation se fait in situ dans des cellules fixes, afin de préserver la localisation indigène des ARNm. Le signal d’un seul ARNm est amplifié à l’aide de nombreuses sondes, ~20 nucléotides (nt) de longueur, hybridant à différentes parties d’un ARNm (Figure 1A)13. Dans cette approche de sonde de « carrelage », le nombre de sondes nécessaires pour détecter un seul ARNm fixe une limite inférieure sur la longueur de l’ARNm qui peut être évaluée. Alternativement, l’ARNm d’intérêt peut être fusionné transcriptionnellement à un tableau non codant de séquences d’opérateurs de lac tandem, de sorte que plusieurs copies d’une sonde laco fluorescente étiquetée hybrident à un seul ARNm (Figure 1B)14.
smFISH a été utilisé pour quantifier le nombre d’ARNms par cellule à un état stable (c.-à-d. lorsque la synthèse et la décomposition sont en équilibre) et pour analyser la moyenne et la variabilité des ARNm chez les cellules bactériennes15,16,17. Récemment, smFISH a été appliqué pour quantifier les numéros d’ARNm à un état non stable, juste après l’induction ou la répression de l’expression génique dans E. coli18,19,20. Les changements temporels dans les numéros absolus de copie d’ARNm ont ensuite été utilisés pour calculer le taux d’initiation de transcription, d’allongement et de terminaison, ainsi que le taux de dégradation de l’ARNm. Pour cette application, les procédures smFISH conventionnelles peuvent être lourdes parce qu’il existe de nombreux échantillons, représentant chacun un point de temps, qui doivent passer par plusieurs étapes d’échange de mémoire tampon (c.-à-d. la centrifugation et le lavage). Ici, nous décrivons un protocole smFISH, dans lequel les étapes de manipulation de l’échantillon sont considérablement simplifiées en ayant des cellules adhéré à la surface d’un couvercle et en aspirant les liquides avec un système de filtration sous vide14,19. En utilisant l’expression de lacZ dans E. coli comme exemple, le flux de travail complet (figure 2) est démontré, y compris l’analyse d’image (figure 3) produisant la cinétique in vivo de la transcription (initiation, élongation et terminaison) et la dégradation de l’ARNm, la variabilité cellule-cellule dans l’expression de l’ARNm, et la localisation de l’ARNm. Nous prévoyons que le protocole est largement applicable à la cinétique in vivo de sonde et à la localisation d’autres ARNms dans diverses espèces de bactéries.
Protocol
1. Préparation des sondes smFISH
REMARQUE : Pour étiqueter les sondes smFISH avec un seul fluorophore, suivez un protocole standard pour étiqueter les oligonucléotides d’acide nucléique à partir de la chimie des esters du NHS21.
- Concevoir des sondes smFISH. Décider d’utiliser des sondes de « carrelage » ou des sondes « array » (figure 1) pour le gène d’intérêt. Voir la section Discussion sur la façon de prendre la décision.
- Pour les sondes de « carrelage » (figure 1A), utilisez un outil de concepteur de sondes en ligne (p. ex., voir Tableau des matériaux).
- Pour les sondes « array » (Figure 1B), effectuez une recherche de séquence BLAST pour s’assurer que la séquence de sonde n’est pas complémentaire à d’autres séquences d’ARNm.
- Pour étudier la cinétique de transcription et de dégradation de l’ARNm lacZ, utilisez deux ensembles de 24 sondes, chacune couvrant les premières et dernières régions de 1 kb de lacZ (3 072 pb)19.
REMARQUE : Ces ensembles de sondes sont, ci-après dénommées, respectivement sous les noms de « sonde à l’ARNm » et de « sonde d’ARNm » et de « sonde d’ARNm de 3 po ». Les séquences de ces sondes sont répertoriées dans le Tableau des matériaux.
- Commandez des séquences de sondes sous forme d’oligonucléotides d’ADN avec un lieneur aminé C6 à l’extrémité de 5'. Dissoudre les sondes individuelles dans l’eau à 1 mM.
- Combinez des quantités équimolaires de sondes pour les ensembles de sondes « 5 ' mRNA » et de « sonde d’ARNm » de 3 po. Par exemple, pour la sonde d’ARNm de 5' définie pour lacZ, combinez 20 μL de chaque sonde (total 24 types de sondes dans l’ensemble).
- Effectuer des précipitations d’éthanol22 des sondes combinées pour éliminer toute contamination des amines primaires et secondaires (comme les sels de Tris, de glycine et d’ammonium) qui peuvent inhiber la réaction de conjugaison. En fin de compte, dissoudre la pastille d’ADN dans 100 μL d’eau (produisant ~4,5 mM d’ADN dans un ensemble de sondes).
REMARQUE : Cette étape est recommandée même si les sondes ont subi une purification de desalte standard par le fabricant. Une purification standard à base de filtre peut fonctionner à la place et en plus des précipitations d’éthanol. - Choisissez deux fluorophores spectralement distincts avec un ester moiety monofonctionnel du NHS, de sorte que les ensembles de sondes d’ARNm de 5' et 3's peuvent être étiquetés différemment. Par exemple, préparez l’ester cy5 nhs pour les sondes d’ARNm de 5' et l’ester de Cy3B NHS pour les sondes d’ARNm de 3'. Dissoudre chaque type de fluorophores dans le DMSO anhydre à 20 mg/mL final (~25 mM).
- Préparer 0,1 M de bicarbonate de sodium (pH 8,5) juste avant chaque réaction d’étiquetage. L’exposition à l’air pendant une longue période réduira son pH et réduira l’efficacité de l’étiquetage.
- Pour la réaction de conjugaison, combiner les éléments suivants : 15 μL du stock de fluorophore Cy5 (à partir de l’étape 1,5), 4 μL de sonde à 5' (à partir de l’étape 1.4), 75 μL de bicarbonate de sodium (à partir de l’étape 1.6) et 7 μL d’eau. Envelopper le tube de papier d’aluminium et secouer à température ambiante pendant 3-6 h.
REMARQUE : Une incubation plus longue n’entraîne pas nécessairement une plus grande efficacité d’étiquetage. En outre, la réaction peut être intensifiée ou vers le bas si les concentrations des composants sont maintenues. - Répétez l’étape ci-dessus pour l’ensemble de sondes d’ARNm de 3' et le fluorophore correspondant (c.-à-d. Cy3B NHS-ester).
- Effectuer des précipitations d’éthanol22 pour éliminer les molécules de colorant non réagi. Dissoudre le granulé dans ~50 μL de tampon TE (10mM Tris-HCl pH 8.0 avec 1mM EDTA).
- Estimer les concentrations d’ADN et de fluorophore à l’aide d’un spectromètre UV-Vis.
- Mesurez l’absorption à 260 nm et 559 nm (Cy3B) ou 649 nm (Cy5). Si l’échantillon est trop concentré pour produire une mesure précise, diluer 1 μL de l’échantillon à 10 μL.
- Convertir l’absorption à la concentration :
ε ADN = 0,2 μM-1 (pour 20-nt ADN à brin unique), εCy5 = 0,25 μM-1, et εCy3B = 0,13 μM-1
REMARQUE : [L’ADN] est la concentration des sondes totales dans la solution. La concentration de sondes individuelles est environ 24 fois plus faible. La concentration des sondes totales sera utilisée comme « concentrations de sondes » à partir de ce point. Si le rapport entre [ADN] et [colorant] est de 1, l’étape HPLC suivante peut être ignorée23, et l’échantillon doit être dilué à 4-5 μM final dans la mémoire tampon TE.
- (Recommandé) Purifier les sondes étiquetées à partir de sondes non étiquetées et de colorants libres à l’aide de HPLC.
REMARQUE : Bien que cette étape de purification supplémentaire entraîne la perte de l’échantillon, elle est bénéfique pour les applications en aval. L’enlèvement des sondes d’ADN non étiquetées augmentera le signal de fluorescence des cibles d’ARNm et l’élimination des colorants non expurgés réduira la fluorescence de fond.- Préparer hplc avec une colonne C18 analytique standard, un acétate de triéthylammonium de 0,1 M (TEAA) sous forme de tampon A et de l’acétonitrille sous forme de tampon B.
- Ajouter 1 M TEAA à l’échantillon (à partir de l’étape 1.9) pour faire 0,1 M TEAA.
- Définissez le programme de gradient comme suit : 0-5 min avec 0% B, 5-35 min avec un gradient linéaire de 0-30% de B, 35-37 min avec un gradient linéaire de 30-100% de B, et 37-40 min avec 0% B. Maintenir le débit à 0,1 mL/min et enregistrer les chromatogrammes à 260 et 649 nm (pour les échantillons étiquetés Cy5) ou à 260 et 559 nm (pour les échantillons marqués Cy3B).
- Recueillir l’échantillon élut lorsque l’absorption augmente dans les canaux d’ADN et de fluorophore.
- Concentrer l’échantillon éluté à l’aide d’un concentrateur à vide et re-suspendre le granulé dans un tampon TE de 50 à 100 μL.
- Vérifiez la concentration d’ADN et de fluorophore à l’aide d’un spectromètre UV-Vis (voir étape 1.10). Diluer, si nécessaire, pour faire une concentration finale autour de 4-5 μM. Stocker les sondes à -20 °C
2. Préparation de solutions
- Préparer un grand volume d’eau et de tampons traités par DEPC (tableau 1). Ces solutions peuvent durer plus d’un an à température ambiante.
- Préparer une solution de fixation 4x et une solution de lavage (Tableau 1).
- Préparer la solution de pré-hybridation et la solution d’hybridation des sondes (tableau 1). Préparer la solution d’hybridation de la sonde pendant l’incubation à l’étape 5.1 ou à l’étape 6.1, puis conserver la solution dans un shaker de comptoir à 37 °C pendant 20 à 40 min avec un couvercle pour minimiser l’exposition à la lumière.
REMARQUE : Les concentrations de formamide, de SSC et de sonde ont été optimisées pour les ensembles de sondes lacZ afin de minimiser la fluorescence de fond tout en maximisant le signal réel. Consultez la section Discussion pour plus d’informations sur la façon de modifier ces concentrations pour différentes applications.
3. Préparation de couvercles et de lames en verre
- Nettoyez les couvercles et les lames en verre.
- Placez des couvercles individuels et des diapositives dans un bocal Coplin à l’aide de forceps. Assurez-vous que les couvercles et les diapositives sont séparés et ne se touchent pas.
- Remplissez le bocal de 100 % d’éthanol et fermez le couvercle. Placez le bocal dans un nettoyant à ultrasons de bain d’eau et sonicate pendant 15-20 min.
REMARQUE : Pour le sonicateur de bain d’eau, il est recommandé d’éteindre la fonction de chauffage. - Verser l’éthanol et laver avec de l’eau ultrapure 3-4x. Utilisez l’eau qui coule directement de la machine de purification de l’eau.
- Verser l’eau du bocal et la remplir de 70% d’éthanol. Fermez le couvercle et effectuez une sonication pendant 15-20 min et lavez-vous avec de l’eau ultrapure.
- Remplissez le bocal d’eau ultrapure et de sonicate pendant 15-20 min.
REMARQUE : Les couvercles et les lames en verre peuvent être conservés toute la nuit dans le bocal Coplin rempli d’eau ultrapure. - Prenez une diapositive ou un couvercle du bocal Coplin à l’aide de forceps propres et séchez-le à l’aide de gaz N2. Répétez ceci pour les diapositives et les couvercles restants.
- Placez les lames séchées dans une boîte de rangement propre jusqu’à ce qu’elles soient utilisées à l’étape 7.5. Placez les couvercles séchés dans une boîte à pointes de pipette vide de 1 000 μL, qui servira de « chambre » dans la procédure restante.
- À l’aide d’un marqueur hydrophobe, dessinez des cercles sur les couvercles suivant des trous circulaires dans la boîte de pointe de la pipette. Ces cercles (~0,5 cm de diamètre) serviront de « puits ». Attendez au moins 5-10 min pour que le marqueur soit complètement séché.
REMARQUE : Gardez toujours le couvercle de la boîte de pointe fermé. - Appliquer une baisse de 20 à μL de 0,1 % de poly-L-lysine dans chaque puits. Incuber pendant 10-50 min à température ambiante.
REMARQUE : Ajuster ce volume en fonction de la taille du puits. Assurez-vous que la solution couvre complètement la zone du puits. Pour une incubation plus longue, veillez à éviter l’évaporation. - Après l’incubation, l’ascure poly-L-lysine sans toucher la surface, car cela va éramer la poly-L-lysine. Appliquez ensuite une goutte (~20 μL) d’eau DEPC sur les puits traités en poly-L-lysine. Fermer le couvercle de la « chambre » pour éviter l’évaporation jusqu’à l’étape 5.1.
4. Expérience de cours de temps et fixation d’échantillon
- Cultiver des cellules e. coli dans une culture liquide d’environ 20 ml dans une fiole de 250 mL. Conservez la fiole dans un shaker de bain d’eau (30 °C) et continuez à trembler. Arrêtez le shaker uniquement lorsque vous prenez des échantillons.
NOTE : Les résultats présentés dans cet article sont obtenus à partir de cellules MG1655 cultivées dans le milieu minimal de M9 complétés par le glycérol de 0,2 %, 0,1 % d’acides casamino, et la thiamine de mg/L à une phase de croissance exponentielle (OD600~0.2). - Ajouter 250 μL de la solution de fixation 4x dans un tube vide de 1,5 mL. Répétez et préparez plusieurs tubes, autant que les points de temps à prendre. Étiqueter les tubes avec les numéros de point de temps et les garder à température ambiante.
- Prenez 750 μL de culture cellulaire (OD600~0,2) avant de commencer une expérience de cours dans le temps. Ajoutez la culture à un tube marqué pour « temps zéro » (à partir de l’étape 4.2). Inversez le tube doucement pour mélanger les cellules avec la solution de fixation.
REMARQUE : Ne pas faire de haut en bas pour mélanger, vortex, ou « être rugueux » sur les cellules. Cet échantillon représente l’état réprimé et sera utilisé comme un contrôle pour calculer l’intensité de fluorescence d’un seul ARNm (voir l’étape 9.4). - Ajouter 0,02 à 1 mM d’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à la culture liquide pour induire l’expression lacZ. Démarrez une minuterie à ce point (t = 0 min) et échantillonnez à un certain intervalle de temps (p. ex., toutes les 1 min) à partir de ce moment.. Pour l’échantillonnage, répétez l’étape 4.3.
- Ajouter 5 mM orthonitropheynl-β-D-fucopyranoside (ONPF) ou 500 mM glucose24 à un certain moment au cours de l’expérience de cours de temps (par exemple à t = 1,5 min) pour réprimer l’expression lacZ. Après la répresse, continuer à échantillonner les cultures (étape 4.3) pour suivre la dégradation de l’ARNm.
REMARQUE : La répression peut également se faire avec ~400 μg/mL rifampicine, un inhibiteur d’initiation à la transcription25. - Pour la fixation, incuber les tubes contenant des cellules échantillonnées à température ambiante pendant 15 min, suivie de l’incubation dans la glace pendant 30 min.
- Pour enlever les fixatifs, centrifugez les tubes à 4 500 x g pendant 4 min à température ambiante. Retirer le supernatant à l’aide d’une pipette.
REMARQUE : Assurez-vous de jeter le formaldéhyde dans un contenant de déchets séparé suivant le protocole de sécurité. - Ajoutez 1 mL DEPC-PBS et re-suspendez les cellules. Répétez la centrifugation et re-suspension 2 fois de plus.
REMARQUE : Les cellules fixes sont fragiles et nécessitent un traitement doux. Re-suspendre soigneusement le granulé et éviter les bulles. - Après l’étape finale de lavage, re-suspendre les cellules dans ~30 μL DEPC-PBS.
5. Perméabilisation des membranes cellulaires
- Appliquer chaque échantillon de point de temps à différents puits sur le couvercle (~30 μL par puits). Attendre de 10 à 30 min à température ambiante pour que les cellules adhèrent à la surface. Évitez de fusionner les gouttes liquides entre les puits.
- Pour rincer les cellules non liées, aspirate le liquide et appliquez ~20 μL DEPC PBS à chaque puits. Apirate DEPC PBS en quelques minutes.
- Permeabiliser les membranes cellulaires en appliquant 15 μL d’éthanol à 70% sur chaque puits pendant 4 min. Apirate l’éthanol après les 4 min, et assurez-vous que les puits sont complètement secs.
REMARQUE : Il est essentiel de limiter le traitement à l’éthanol pendant 4 min. Un traitement plus long entraînera une surméabilisation. - Appliquer 30 μL de la solution de lavage à chaque puits.
6. Hybridation de sonde
- Apirate la solution de lavage de chaque puits. Appliquer 30 μL de la solution de pré-hybridation à chaque puits. Incuber la chambre dans le four à 37 °C pendant 30 min.
REMARQUE : Ajoutez ~50 mL d’eau au fond de la chambre pour fournir de l’humidité. - Apirate la solution de pré-hybridation de chaque puits. Appliquer à chaque puits ~30 μL de la solution d’hybridation de la sonde. Couvrir la chambre de papier d’aluminium et incuber dans le four à 37 °C pendant 2 h.
REMARQUE : Assurez-vous que la solution d’hybridation de la sonde se trouve dans le shaker de comptoir de 37 °C avant cette étape. Évitez la fusion des liquides entre les puits. Appliquez un plus petit volume de la solution à chaque puits, si nécessaire.
7. Lavage post-hybridation et préparation pour l’imagerie
- À l’aide d’une pipette multicanal, appliquez environ 30 μL de la solution de lavage à chaque puits à la fois. Apirate et répéter 3-5 fois de lavage. Incuber la chambre dans le four à 37 °C pendant 15-30 min.
- Répétez l’étape 7.1 deux fois de plus.
- Lavez-les bien avec DEPC-PBS 5 fois. Suivez la méthode utilisée à l’étape 7.1, mais sautez le processus d’incubation.
- Apirate le liquide de la couverture. Appliquer 4 μL de DEPC-PBS à chaque puits.
- À l’aide de forceps, soulevez et retournez le couvercle et placez-le doucement sur une lame de verre (à partir de l’étape 3.2). Évitez les bulles.
- Sceller les bords de la couverture avec la gomme dentaire en silicone.
- Attendez que la gomme soit solidifiée. On peut faire une pause ici et stocker la diapositive pendant la nuit à 4 °C.
REMARQUE : D’autres protocoles smFISH suggèrent d’ajouter des réactifs de récupération d’oxygène (p. ex., l’oxidase de glucose/catalase) ou l’utilisation d’un milieu commercial de montage anti-fade14,26 pour augmenter la photostabilité des fluorophores.
8. Imagerie
- Pour trouver un domaine d’intérêt, utilisez le mode live d’imagerie par contraste de phase. Changez le champ de vision dans un puits en manœuvrant le joystick de scène. Choisissez une zone où la densité cellulaire est optimale (c.-à-d. il y a beaucoup de cellules qui sont la plupart du temps séparées). Ajustez la mise au point z de telle sorte que les images de cellules de contraste de phase soient au point.
- Prenez des instantanés de l’ordre de Cy5 (exposition de 4 s), cy3 (exposition de 2 s) et de contraste de phase (exposition de 0,2 s).
REMARQUE : Les molécules de colorant Cy3B sont imaged dans le canal Cy3, et les images sont appelées images Cy3. - Répétez les étapes 8.1-8.2 pour acquérir des images d’environ 10 zones différentes dans un puits.
- Déplacez l’objectif vers un autre puits et répétez les étapes 8.1-8.3.
- Exporter des images sous forme de fichiers TIFF.
- (Facultatif) Image perles multicolores adsorbé sur la surface coverslip dans les canaux Cy5 et Cy3 pour déterminer le déplacement spatial entre les canaux Cy5 et Cy3 à des fins d’enregistrement d’image.
- Appliquer ~10 μL de perles fluorescentes multicolores (0,2 μm de diamètre) sur une surface de couverture propre et attendre de 10 à 30 min. Après le lavage avec ~50 μL de PBS, appliquer ~5 μL de PBS et sandwich le couvercle avec une lame de verre. Sceller et monter au microscope.
- Perles d’image dans les canaux Cy5 et Cy3.
9. Analyse d’image
REMARQUE : Le code Matlab utilisé dans cette étape est disponible sur le site GitHub suivant : https://github.com/sjkimlab/Code_Publication/tree/master/JoVE_2020. Le dossier GitHub contient tout ce qui est nécessaire pour l’analyse d’image, y compris les valeurs des paramètres pour la segmentation des cellules et l’identification ponctuelle. La procédure de cette étape est expliquée dans le script principal, appelé « FISHworkflow.m ».
- Ouvrez un outil de segmentation cellulaire, tel que microbeTracker27 ou Oufti28, et chargez des images de contraste de phase. Choisissez « Cadres indépendants » et appuyez sur un bouton appelé « Tous les cadres » pour commencer le processus de segmentation, à partir duquel les cellules sont identifiées et leurs contours sont calculés (Figure 3B,C).
REMARQUE : Des protocoles détaillés pour l’utilisation de ces logiciels sont disponibles en ligne (p. ex., oufti.org). - Chargez les images de fluorescence Cy5 dans la fonction spotFinder de microbeTracker ou Oufti, et appuyez sur le bouton «Run» pour commencer l’identification et la quantification ponctuelles basées sur le montage gaussien 2D (Figure 3B,C). Répétez cette étape pour les images de fluorescence Cy3 pour analyser les taches dans le canal Cy3. Cette étape produit une liste de taches dans chaque cellule, y compris leurs intensités et leurs coordonnées.
- (Facultatif) Filtrer les points faibles (faux positifs) à l’aide d’un seuil, comme expliqué dans le fichier FISHworkflow.m.
REMARQUE : Examinez les taches fluorescentes dans le contrôle négatif (p. ex. MG1655 ΔlacZ)et déterminez le seuil pour filtrer les faux positifs. - Pour obtenir l’intensité ponctuelle d’un seul ARNm, utilisez une liste d’intensités ponctuelles mesurées au moment zéro (avant d’ajouter l’IPTG) et adapter la distribution des intensités ponctuelles avec un modèle de mélange gaussien avec deux composants de mélange. Prenez la position de pointe de la première population gaussienne (ligne noire de la figure 3D,E),Ecomme l’intensité ponctuelle d’un seul ARNm. Effectuez ceci pour les taches de Cy5 et de Cy3 séparément pour obtenir l’intensité de tache d’un seul ARNm de 5' et 3' lacZ.
REMARQUE : Répétez cette opération à chaque expérience de cours de temps, car l’intensité ponctuelle d’un seul ARNm peut varier légèrement selon les expériences. - Divisez l’intensité de fluorescence d’un endroit avec l’intensité d’un seul ARNm (à partir de l’étape 9.4) pour obtenir le nombre d’ARNm à l’intérieur d’un endroit. Additionner les intensités ponctuelles normalisées dans une cellule pour calculer le nombre total d’ARNm dans une cellule (figure 3F). Effectuez ces calculs pour l’ARNm de 5' et 3' séparément.
- Calculer et tracer les nombres moyens d’ARNm par cellule à chaque point de temps (p. ex., figure 4B)et analyser la cinétique in vivo de la transcription et de la dégradation de l’ARNm à partir du changement temporel des niveaux moyens d’ARNm (figure 4B).
- Pour obtenir le taux d’élongation de transcription, effectuer un ajustement des moindres carrés d’une ligne à l’élévation initiale des signaux d’ARNm de 5' et 3' et d’identifier les interceptions aux niveaux basaux (figure 4B). La différence entre ces interceptions indique le temps moyen pour les RNAPs de voyager de la région de la sonde 5' à la région de la sonde 3'. Divisez la distance entre deux ensembles de sondes (2 ko) avec ce temps pour obtenir le taux moyen d’élongation de transcription.
- Pour obtenir le taux de dégradation de l’ARNm, adapter une fonction de décomposition exponentielle, y = A·exp(-t/τ) à la région de décomposition finale des signaux d’ARNm de 5' et 3' (p. ex., figure 4B). Le paramètre d’ajustement, τ, est la durée de vie moyenne de l’ARNm.
- (Facultatif) Analyser la variation de cellule à cellule dans l’expression des gènes (p. ex., la réponse au niveau cellulaire à l’induction indiquée à la figure 4C),basée sur la distribution des nombres d’ARNm dans chaque cellule (calculée à l’étape 9.5).
- (Facultatif) À l’aide d’informations sur l’emplacement des taches le long des axes majeurs et mineurs d’une cellule (obtenus à partir de l’étape 9.2), analyser la localisation des ARNms (Figure 4D,E).
- (Facultatif) Analyser la co-localisation des ARN de 5' et 3' (Figure 5) en comparant la localisation des taches détectées dans les canaux Cy5 et Cy3.
- Chargez des images de perles multicolores (étape 8.6) dans la fonction spotFinderF dans microbeTracker et obtenez les coordonnées des centroïdes de perles dans les canaux Cy5 et Cy3. Utilisez la liste des coordonnées centroïdes pour calculer la matrice de transformation affine, qui indique comment les canaux Cy5 et Cy3 sont déplacés et tournés les uns par rapport à l’autre29.
- Appliquez la matrice de transformation d’affine aux images Cy5 et Cy3 FISH pour convertir les images Cy3 dans la coordonnée Cy5. Classez si un spot est co-localisé avec un autre endroit dans un autre canal. Par exemple, une tache dans le canal Cy5 est considérée comme co-localisée avec un autre endroit dans le canal Cy3 si la distance entre leurs centroïdes est inférieure à 150 nm (figure 5).
- Analyser le nombre de taches Cy5 classées comme « co-localisées » avec des taches Cy3 à chaque point de temps. Analysez également l’intensité des taches co-localisées (Figure 5).
Representative Results
La figure 3 montre des images représentatives de ce protocole smFISH. Un champ de vision complet (86,7 μm x 66,0 μm à l’aide de notre configuration de microscopie détaillée dans tableau des matériaux)montre ~500 cellules E. coli dispersées dans tout le champ ( figure3A). Si la densité des cellules est beaucoup plus élevée que ce qui est montré dans cette image, la segmentation automatique des cellules devient difficile car les algorithmes de segmentation n’identifient pas de manière fiable les cellules individuelles lorsque les cellules se touchent. Il faut ajuster la concentration des cellules et le temps d’incubation utilisé pour l’adhérence de surface (étape 5.1) afin d’atteindre la densité optimale des cellules dans le champ de vision.
La morphologie des cellules dans les images de contraste de phase doit rester comparable à celle des cellules vivantes à des fins de segmentation (Figure 3A-C). Si les cellules sont sur-perméabilisées, la morphologie cellulaire change (comme les « fantômes » ; Figure supplémentaire 1). Dans ce cas, on peut réduire la durée du traitement à l’éthanol à 70 % à l’étape 5.3.
Avant l’induction, le niveau moyen d’expression lacZ était de ~0,03 mARN par cellule, conformément aux rapports précédents15,30. En outre, la distribution des intensités ponctuelles de l’ARNm lacZ avant l’induction ne correspondait pas bien à une distribution normale ou à une distribution de Poisson en raison de la présence de taches à forte intensité (Figure 3D,E). Ceci suggère que la plupart des taches détectées sous l’état réprimé représentent un ARNm de lacZ simple, mais une petite population de taches contient plus d’un ARNm de lacZ. Pour isoler la population avec un seul ARNm lacZ, nous avons utilisé un modèle de mélange gaussien avec deux composants de mélange (insets dans la figure 3D,E). Ensuite, la moyenne du premier Gaussien a été prise comme l’intensité moyenne d’une seule tache d’ARNm (p. ex., le pic de la courbe noire de la figure 3D)et utilisée pour convertir l’intensité ponctuelle en nombre d’ARNm, pour tous les endroits détectés dans l’expérience du cours de temps. Pour calculer le nombre total d’ARNm dans une cellule, les intensités ponctuelles normalisées ont été résumées dans chaque cellule (figure 3F)19.
Lorsque le niveau d’expression de l’ARNm lacZ est faible, il y a un ou deux taches d’ARNm lacZ limitées par diffraction dans l’espace séparées dans une cellule. Par conséquent, les images de ces taches peuvent être analysées par 2D Gaussian montage pour leur intensité et la localisation.
Lorsque le niveau d’expression est élevé, de sorte que les taches se chevauchent les unes avec les autres dans une cellule, l’ajustement gaussien 2D ne fait pas de quantification fiable. Dans ce cas, le niveau d’ARNm doit être calculé en divisant le signal de fluorescence total soustraite en arrière-plan dans une cellule avec l’intensité moyenne d’un seul ARNm19.
Lorsque l’expression de lacZ est induite, le signal de l’ARNm lacZ de 5' augmente d’abord et celui de l’ARNm lacZ de 3' augmente plus tard (figure 4B). Si l’expression de lacZ est réprimée, les signaux d’ARNm lacZ de 5' et 3' diminuent avec un certain retard entre les deux (figure 4B). Pour obtenir le taux d’élongation de transcription, la montée des signaux de 5' et 3' correspond d’abord aux lignes (figure 4B),et la différence dans les interceptions x est prise comme le temps pour les RNAP de parcourir la distance entre deux régions de sonde (2 000 nt). Le taux d’élongation de transcription peut être mesuré à partir de chaque expérience de cours de temps et les écarts standard peuvent être calculés à partir de doublons expérimentaux. Le taux moyen d’élongation de transcription était de 15-30 nt/s dans nos conditions expérimentales19.
En outre, le taux de dégradation de l’ARNm (inverse de la durée de vie moyenne de l’ARNm) a été obtenu en ajustant la région de décomposition avec une fonction exponentielle (figure 4B). Nos données de cours de temps contiennent la dégradation de l’ARNm pendant et après la transcription31. Nous nous inscrivons aux points de temps après que l’ARNm de 3' a commencé à se décomposer (t > 6 min) pour sonder la dégradation des ARNm libérés. Nous avons obtenu ~90 s comme une durée de vie moyenne de 5' ou 3' lacZ mRNA19.
Le taux d’initiation à la transcription peut être calculé à partir de la pente de 5' augmentation du signal après induction(figure 4B,bleu), ou à partir du nombre moyen d’ARNm à l’état stable (qui est le taux d’initiation divisé par le taux de dégradation). En outre, la probabilité d’interruption prématurée de la transcription peut être estimée, soit en prenant le rapport entre la pente de 3' augmentation de signal par rapport à celle de 5' augmentation de signal32 ou entre les niveaux d’état stable des régions 3' et 5' d’ARNm19.
Parce que smFISH est une technique unicellulaire, nous pouvons analyser la variabilité cellule-cellule dans la transcription. Par exemple, on peut analyser le pourcentage de cellules exprimant l’ARNm lacZ après l’ajout de l’IPTG (Figure 4C). On peut également déterminer si la localisation de l’ARNm change après l’induction. Nous avons observé que les taches d’ARNm lacZ de 5' et 3' se déplacent légèrement vers l’extérieur, loin du centre de la cellule (figure 4D,E), conformément à un rapport précédent33.
Enfin, l’analyse de la co-localisation entre les taches d’ARNm de 5' à 3' peut être informative (Figure 5A). Par exemple, dans l’état réprimé (temps zéro), environ 25 % des taches d’ARNm de 5' sont co-localisées avec une tache d’ARNm de 3'. À t = 1 min, comme beaucoup de loci de gène ont la synthèse de 5' d’ARNm, mais pas encore la synthèse de 3' d’ARNm, la plupart des taches d’ARNm de 5' sont par elles-mêmes sans signal d’ARNm de 3' (c.-à-d. faible probabilité de co-localisation). Toutefois, lorsque l’ARNm de 3' apparaît (c.-à-d. t = 2 min), la probabilité de co-localisation augmente (flèche violette de la figure 5A,B). Ce point de temps, lorsque la co-localisation devient fréquente, dépend de la vitesse d’allongement de la transcription. La parcelle de densité 2D des numéros d’ARNm lacZ de 5' et 3' dans chaque point de co-localisation détecté à ce moment-là peut être utilisée pour déduire la densité des RNAPs sur le gène lacZ (Figure 5C). Comme indiqué précédemment19, les numéros de 5' arnm dans cette parcelle indiquent que la plupart des loci lacZ ont moins de 10 RNAPs sur l’ADN lorsque l’expression lacZ est induite par 1 mM IPTG. En outre, les numéros d’ARNm de 3' de cette parcelle sont liés au regroupement des RNAPs34. Le fait que le nombre d’ARNm de 3' soit proche d’un seul signifie qu’à peu près un RNAP entre dans la région de la sonde 3'. Cela suggère que les RNAPs du gène lacZ sont séparés spatialement, au lieu de former un amas (ou « convoi »).
Figure 1 : Conception de sondes smFISH pour un ARNm d’intérêt. (A) Méthode de carrelage. Des séquences d’oligonucléotides à l’ADN court (~20 pb de longueur) sont choisies afin qu’elles puissent couvrir l’ARNm d’intérêt. Les sondes oligonucléotides sont étiquetées avec une molécule de colorant fluorescent. (B) Méthode de tableau. Un tableau non codant de séquences en tandem (p. ex., «tableau lacO ») est fusionné transcriptionnellement à l’ARNm d’intérêt. La sonde fluorescente étiquetée complémentaire à l’unité de répétition (p. ex., sonde laco de 17 pb) est utilisée pour amplifier le signal d’un ARNm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Schéma de la procédure expérimentale smFISH et durée de chaque étape. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : analyse d’image smFISH. (A-C) smFISH microscopy image de 5' lacZ mRNA (rouge) et 3' lacZ mRNA (vert) dans le type sauvage E. coli (MG1655) cultivé dans M9 milieu minimal complété par 0,2% glycérol, 0,1% d’acides casamino, et 1 mg/L de thiamine à 30 °C. (A) Image représentative d’un échantillon de t = 3 min après induction avec 0,05 mM IPTG à t = 0 min et répression avec 500 mM de glucose à t = 1,5 min. Le contraste de phase et deux images de fluorescence de Cy5 (pour l’ARNm de lacZ de 5', rouge) et de Cy3 (pour l’ARNm de lacZ de 3', vert) ont été recouverts de pseudo-coloration. L’image montre un champ entier de 86,7 μm x 66,0 μm. Barre d’échelle, 5 μm. (B) Version zoom-in d’une petite région (boîte jaune) dans (A). Les contours des cellules sont indiqués en blanc, et les taches de fluorescence identifiées à partir de l’analyse d’image sont montrées avec des points rouges. Barre d’échelle, 1 μm. (C) Détection des contours cellulaires et des taches fluorescentes sous une condition d’expression élevée (t = 4 min après induction avec 1 mM IPTG). Barre d’échelle, 1 μm. (D-E) Distributions d’intensités de 5' et 3' de taches d’ARNm mesurées avant d’ajouter IPTG (état réprimé). Les histogrammes sont représentés avec deux fonctions gaussiennes (noir et gris) dont les valeurs moyennes proviennent du modèle de mélange gaussien. L’encart montre une parcelle quantile-quantile de nombres aléatoires générés à partir des modèles de mélange gaussiens et d’intensités de taches d’ARNm mesurées expérimentalement (n = 1040 pour 5' mRNA et 680 pour l’ARNm de 3'). (F) Renseignements obtenus pour une cellule individuelle pointée dans le panneau B). Pour une cellule donnée (i), des taches ont été identifiées dans les canaux Cy5 et Cy3, et leur intensité (I) et se coordonnent le long de l’axe court et longd’unecellule ( d , l) ont été quantifiées à partir de l’ajustement gaussien 2D. Après normalisation, les intensités ponctuelles ont été résumées pour produire le nombre total de 5' ou 3' mRNA dans cette cellule. En outre, la co-localisation entre les taches de différents canaux peut être analysée comme dans l’exemple montré à la figure 5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Analyse de la cinétique in vivo de la transcription et de la dégradation de l’ARNm. (A) Images schématiques et représentatives d’expériences smFISH bicolores mesurant les changements dans les niveaux d’ARNm lacZ au fil du temps. Les lignes pointillées rouges et vertes indiquent des sondes oligonucléotides étiquetées Cy5 ou Cy3B qui s’hybrident aux régions d’ARNm de 1 kb de long de 5' et 3' de l’ARNm lacZ dans E. coli, respectivement. Sont également montrés des superpositions de deux images de fluorescence avec une image de contraste de phase aux points de temps indiqués après l’induction avec 0,2 mM IPTG à t = 0 min. La transcription a été réprimée avec 500 mM de glucose à t = 1,5 min. Barre d’échelle, 1 μm. Le chiffre a été modifié de Kim et al19. (B) 5' et 3' numéros d’ARNm lacZ par cellule au fil du temps, au cours de l’expérience décrite dans le panneau (A). Les barres d’erreur sont des SEM à bretelles. Au moins 1 200 cellules ont été analysées par point de temps. La montée initiale des signaux d’ARNm de 5' et 3' correspondait à une ligne (bleue). La différence dans les interceptions x était de 1,93 min, ce qui donne le taux moyen d’élongation de transcription de 17,3 nt/s. La décomposition finale des signaux d’ARNm de 5' et 3' correspondait à une fonction de décomposition exponentielle (gris). Les paramètres d’ajustement indiquent que la durée de vie moyenne de l’ARNm est de 1,52 min pour 5' d’ARNm et de 1,66 min pour l’ARNm de 3'. (C) Pourcentage de cellules ayant une ou plusieurs taches d’ARNm lacZ au cours de l’expérience décrite dans (A). Les barres d’erreur sont des SEM à bretelles. (D) Localisation d’un endroit le long de l’axe court d’une cellule. On peut quantifier la proximité d’un endroit avec la membrane en divisant l’emplacement le long del’axecourt ( d ) avec la demi-largeur de la cellule (w). (E) Modification de la localisation des taches d’ARNm lacZ de 5' et 3' le long de l’axe court des cellules au cours de l’expérience décrite dans (A). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Analyse de la co-localisation des taches d’ARNm de 5 et 3'. (A) Schématique montrant la co-localisation prévue entre 5' et 3' taches d’ARNm après induction. Lorsque l’ARNm de 3' est faite, la probabilité qu’une tache d’ARNm de 5' soit co-localisée avec une tache d’ARNm de 3' augmente (flèche pourpre). (B) Probabilité de co-localisation après induction avec 1 mM IPTG. La flèche violette indique le moment où la probabilité de co-localisation devient fréquente selon le schéma du panneau (A). (C) Le nombre d’ARN 5' et 3' lacZ dans un point de co-localisation détecté à t = 2 min après induction avec 1 mM IPTG (total 841 taches). Les points gris représentent des taches co-localisées individuelles, tandis que les points rouges représentent la moyenne des données binned. Les barres d’erreur sont SEM. L’ombre du gris indique la densité des points dans une zone donnée du graphique. La ligne pointillée indique une pente de 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Optimisation de l’état d’hybridation de la sonde. Deux types d’échantillons ont été utilisés : les cellules MG1655 cultivées telles que décrites à la figure 3 et restent non induites (bleues) ou traitées avec 0,5 mM IPTG pendant 20 min (rouge). La solution d’hybridation de sonde a été faite avec différentes concentrations de sondes (total 72 sondes conjuguées cy5 carrelant toute la région de lacZ) et de formamide. Les concentrations de formamide ont également été ajustées dans la solution de pré-hybridation et la solution de lavage, en conséquence. « Aucune sonde » (ligne grise) indique le niveau de fluorescence des cellules ajoutées à l’IPTG traitées sans sondes pendant l’étape d’hybridation. L’intensité moyenne de fluorescence normalisée par zone cellulaire (UA) a été calculée à partir de 300-800 cellules. Les barres d’erreur sont des SEM à bretelles. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Morphologies cellulaires déformées dues à une surméabilisation. Superposition des images de contraste de phase (échelle grise), d’ARNm lacZ de 5' (Cy5, rouge) et d’ARNm de 3' lacZ (Cy3, vert) des cellules MG1655 5 min après l’induction avec 1 mM IPTG. (A) Exemple montrant le mélange de cellules normales et de cellules trop perméabilisées dépourvues de morphologie normale (indiquée avec des flèches roses). (B) Exemple montrant des cellules « fantômes » agglutinées. Barre d’échelle = 1 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
| DEPC Eau | ||||
| Ajouter 0,1 % de DEPC à l’eau ultrapure et incuber la bouteille (couverte) dans le four à 37°C pendant la nuit et autoclave le lendemain. | ||||
| DEPC PBS (10X) | ||||
| Mélangez ce qui suit : | ||||
| 80 g | NaCl (finale 1,37 M) | |||
| 2 g | KCl (finale 27 mM) | |||
| 14,2 g | Na2HPO4 (finale 100 mM) | |||
| 2,7 g | KH2PO4 (finale 20 mM) | |||
| Eau ultrapure à 1L | ||||
| Filtrer (0,22 μm) dans une bouteille en verre. | ||||
| Ajouter 0,1% DEPC et suivre l’instruction pour l’eau DEPC. | ||||
| Pour faire une solution 1X, diluer 10 fois avec de l’eau DEPC. | ||||
| Tampon de phosphate de sodium DEPC 1M, pH 7.4 | ||||
| Mélangez ce qui suit : | ||||
| 115 g | Na2HPO4 | |||
| 22,8 g | NaH2PO4 | |||
| Eau ultrapure à 1 L | ||||
| Filtrer (0,22 μm) dans une bouteille en verre. | ||||
| Ajouter 0,1% DEPC et suivre l’instruction pour l’eau DEPC. | ||||
| Solution de fixation 4X (16% formaldéhyde) | ||||
| 5 mL | 20% de formaldéhyde | |||
| 500 μL | Eau DEPC | |||
| 750 μL | Tampon de phosphate de sodium DEPC 1M, pH 7.4 | |||
| Conserver à 4 °C jusqu’à 2-4 semaines. | ||||
| ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique. Portez des gants et utilisez une capuche de fumée lors de la fabrication de cette solution. | ||||
| Solution de lavage | ||||
| Mélangez ce qui suit : | ||||
| 10 mL | Formamide (final 25%) | |||
| 4 mL | 20X SSC (finale 2X) | |||
| Remplissez l’eau DEPC à 40 mL | ||||
| Filtrer (0,22 μm) et conserver à 4 °C | ||||
| ATTENTION : Le formamide est toxique. Portez des gants et utilisez une capuche de fumée lors de la fabrication de cette solution. | ||||
| Solution de pré-hybridation | ||||
| 200 μL | Formamide (final 20%) | |||
| 100 μL | 20X SSC (finale 2X) | |||
| 10 μL | VRC 100X (finale 1X) | |||
| 25 μL | 4 % (w/v) BSA (finale 0,1 %) | |||
| 685 μL | Eau DEPC | |||
| REMARQUE : Vortex le stock VRC avant de prendre 10 μL. | ||||
| ATTENTION : Le formamide est toxique et un tératogène connu. Portez des gants et manipulez-le sous une hotte de fumée. | ||||
| Solution d’hybridation de sonde | ||||
| 200 μL | Formamide (final 20%) | |||
| 100 μL | 20X SSC (finale 2X) | |||
| 10 μL | VRC 100X (finale 1X) | |||
| 25 μL | 4 % (w/v) BSA (finale 0,1 %) | |||
| 10 μL | 40 mg/mL E. coli tRNA (final 0,4 mg/mL) | |||
| 200 μL | 50% de sulfate de dextran (final 10%) | |||
| x μL | Ensemble de sondes d’ARNm de 5' (de l’étape 1.12) à la finale 4 nM. | |||
| y μL | Ensemble de sondes d’ARNm de 3' (de l’étape 1.12) à la finale 4 nM. | |||
| - | DePC eau pour faire le volume total 1 mL | |||
| REMARQUE : Ajouter le sulfate de dextran en dernier. Parce qu’il est très visqueux, couper l’extrémité d’une pointe de pipette avant de prendre 200 μL sur le stock de 50%. Après l’ajout de sulfate de dextran, pipette de haut en bas pour homogénéiser la solution. | ||||
Tableau 1 : Recettes des solutions utilisées.
Discussion
Ici, nous avons présenté un protocole smFISH pour mesurer la cinétique de l’ARNm chez E. coli. Dans les protocoles smFISH précédemment publiés pour les bactéries23, les cellules ont été conservées dans les tubes jusqu’à la toute fin du protocole, c’est-à-dire jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’imagerie. Bien qu’il ait de nombreux avantages, tels que la liaison non spécifique minimale des sondes fluorescentes sur la surface de couverture23, il est difficile de suivre ces protocoles quand il ya de nombreux échantillons d’une expérience de cours dans le temps. Premièrement, un volume relativement important de cellules (>1 mL) doit être échantillonné et même récolté avant fixation. Deuxièmement, les échantillons de cellules doivent être centrifugés plusieurs fois pour échanger des solutions et se laver après l’étape d’hybridation. Dans notre protocole, un petit volume (<1 mL) de culture est directement mélangé avec une solution de fixation dans un tube de 1,5 mL, aidant à « geler » rapidement l’état cellulaire au moment de l’échantillonnage. En outre, les cellules restent attachées à la surface tout au long de la procédure, et différentes solutions peuvent être échangées rapidement en aspirant des liquides avec un système de filtration sous vide et en appliquant des gouttes de solution à la fois avec une pipette multi-canaux. Cette différence rend notre protocole très avantageux lorsqu’un grand nombre d’échantillons doivent être traités immédiatement. En utilisant notre protocole, 12 à 48 échantillons peuvent être manipulés simultanément et l’ensemble de la procédure FISH peut être complété dans un délai d’environ 8 heures, environ une quantité similaire de temps nécessaire pour quelques échantillons (Figure 2). Bien que nous ayons utilisé l’expression de lacZ dans E. coli comme exemple, le protocole est largement applicable à différents gènes et espèces bactériennes avec des considérations discutées ci-dessous.
Pour différents gènes, la première chose à considérer est les sondes smFISH. On peut concevoir des sondes oligonucléotides qui carreauxent l’ARNm d’intérêt (Figure 1A)13. Dans cette approche de sonde de « carrelage », chaque sonde est de 20 de base longue et étiquetée avec un fluorophore au terminus de 5 ou 3'. Cette stratégie est pratique car aucune manipulation génétique n’est nécessaire. Alternativement, une répétition en tandem d’une séquence d’environ 20 pb, étrangère à la séquence génomique (p. ex., un tableau de séquence de lacO dans Caumobacter crescentus14)peut être insérée dans la région non traduite d’un gène d’intérêt et une seule sonde complémentaire à l’unité de répétition est utilisée pour étiqueter l’ARNM (approche « array » ; Figure 1B). Dans les deux cas, plusieurs fluorophores décorent un ARNm, ce qui donne un signal de fluorescence amplifié qui peut être facilement différencié d’une seule sonde non spécifiquement liée à l’intérieur d’une cellule.
Le choix des approches de « carrelage » ou de « tableau » dépend du contrôle négatif, un échantillon où la liaison non spécifique des sondes est testée parce qu’elle n’a pas l’ARNm cible. Pour les sondes de carrelage (Figure 1A), une souche mutante sans le gène d’intérêt ou une condition, dans laquelle le gène n’est pas transcrit (par exemple, la répression de lacZ) peut servir de contrôle négatif pour tester la liaison non spécifique des sondes. Pour le smFISH (Figure 1B)à base de tableau , une souche de type sauvage dépourvue du tableau peut servir de contrôle négatif car elle ne contient pas de sites de liaison pour les sondes.
Les conditions optimales d’hybridation peuvent dépendre des séquences de sonde et même du choix des colorants fluorophore. Nous avons optimisé la condition d’hybridation pour les ensembles de sondes lacZ en maintenant la température d’hybridation à 37 °C et en testant différentes concentrations d’ensembles de sondes et de formamide dans la solution d’hybridation. Des concentrations plus élevées de formamide ont tendance à réduire à la fois la liaison non spécifique et spécifique26,35. Nous recommandons de modifier systématiquement l’hybridation et ses conditions de lavage tout en maintenant le temps et la température d’hybridation les mêmes. À mesure que la condition devient plus stricte, la diminution non spécifique et la liaison spécifique (figure 6). Il est important de trouver un point où la liaison non spécifique commence à atteindre en dessous d’un seuil acceptable sans compromettre davantage la liaison spécifique. Par exemple, nous avons utilisé le niveau de signal obtenu sans sondes (« as de sonde ») comme seuil (figure 6).
La méthode smFISH bicolore qui étiquette deux régions distinctes d’un ARNm est limitée aux gènes longs. Pour mesurer le taux d’allongement de la transcription, nous avons profité du fait que le lacZ est long (3075 pb) et que son expression peut être induite par l’IPTG. Lorsqu’un gène est court, il est difficile de concevoir deux ensembles de sondes de carrelage (près de 5' et 3' extrémités) et de résoudre le délai entre les apparitions des régions de 5' contre 3' d’ARNm. Dans ce cas, on peut compter les ARNms naissants à l’état stable par smFISH et analyser leur distribution avec un modèle analytique qui a le taux d’élongation de transcription comme paramètre approprié20. En outre, quand un gène d’intérêt n’est pas inductible, on peut traiter des cellules avec de la rifampicine au moment zéro et mesurer le changement temporel dans les sous-régions de l’ARNm 5' et 3'. Le délai de la diminution du signal d’ARNm de 5' à celui du signal d’ARNm de 3' peut alors être utilisé pour calculer le taux d’allongement de transcription comme fait précédemment31.
Enfin, le protocole smFISH est polyvalent et peut être combiné avec d’autres schémas d’étiquetage. Auparavant, le locus d’ADN a été visualisé avec les ARNms en combinant fish d’ARNm avec l’ADN FISH14 ou le système fluorescent reporter-opérateur20. Les produits protéiques peuvent être visualisés en effectuant l’immunofluorescence avec l’ARNm FISH14,36. En outre, il peut être combiné avec la microscopie en trois dimensions super-résolution37 pour visualiser les ARNms dans les trois dimensions38,39.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce protocole a été développé par S.K. au cours de ses recherches postdoctorales dans le laboratoire de la Dre Christine Jacobs-Wagner au Howard Hughes Medical Institute et au Microbial Sciences Institute de l’Université Yale. Nous remercions la Dre Jacobs-Wagner et ses membres de laboratoire pour les diverses contributions au cours de l’élaboration de la méthode et Laura Troyer pour la lecture critique du manuscrit. S.K. reconnaît l’appui du Programme des boursiers Searle; K.V. reconnaît le soutien du James Scholar Preble Research Award de l’Université de l’Illinois.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strain | |||
| Escherichia coli MG1655 | |||
| Chemicals, peptides, and others | |||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
| Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
| Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
| Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
| Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
| E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
| FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
| Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
| Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
| Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
| Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
| Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
| 2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
| Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
| Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
| Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
| sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
| Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
| Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
| TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
| Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
| Equipment | |||
| C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
| Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
| Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
| Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
| Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
| Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
| UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
| Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
| Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
| Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
| Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
| Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
| Tools | |||
| 1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
| 1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
| Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
| Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24x60 No1 |
| Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
| Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Gloves | Microflex | MK-296-M | |
| Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
| Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
| Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
| Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Software and algorithms | |||
| MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
| MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
| https://oufti.org/ | |||
| Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
| Microscope | |||
| CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
| Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
| Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
| Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
| Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
| Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
| Probe sequence | |||
| DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
| lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
| lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
| lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
| lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
| lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
| lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
| lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
| lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
| lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
| lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
| lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
| lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
| lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
| lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
| lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
| lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
| lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
| lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
| lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
| lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
| lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
| lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
| lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
| lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
| lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
| lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
| lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
| lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
| lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
| lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
| lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
| lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
| lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
| lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
| lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
| lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
| lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
| lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
| lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
| lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
| lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
| lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
| lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
| lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
| lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
| lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
| lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
| lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
| lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
| lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
| lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
| lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
| lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
| lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
| lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
| lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
| lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
| lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
| lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
| lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
| lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
| lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
| lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
| lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
| lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
| lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA | |
References
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