Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Функциональная оценка вариантов BRCA1 с использованием базовых редакторов CRISPR-Mediated

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/61557
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

Summary

Люди с мутациями BRCA1 имеют более высокий риск развития рака, что требует точной оценки функции вариантов BRCA1. В этом случае мы описали протокол функциональной оценки вариантов BRCA1 с использованием редакторов базы цитозина, опосредованной CRISPR, которые позволяют целевое преобразование C:G в T:A в живых клетках.

Abstract

Недавние исследования исследовали риски, связанные с мутациями генов BRCA1 с использованием различных функциональных методов оценки, таких как флуоресцентные анализы репортеров, анализ жизнеспособности эмбриональных стволовых клеток и терапевтические анализы чувствительности на основе наркотиков. Хотя они уточнили много вариантов BRCA1, эти анализы, связанные с использованием экзогенно выраженных вариантов BRCA1, связаны с проблемами переэкспрессии и не могут быть применены к пост-транскрипционные регулирования. Чтобы устранить эти ограничения, мы ранее сообщали о методе функционального анализа вариантов BRCA1 с помощью базового редактора цитозинов, опосредованного CRISPR, который вызывает целевую замену нуклеотида в живых клетках. Используя этот метод, мы определили варианты, функции которых остаются неоднозначными, в том числе c.-97C'gt;T, c.154C'gt;T, c.3847C'gt;T, c.5056C'gt;T, и c.4986'5G'gt;A, и подтвердили, что базовые редакторы CRISPR являются полезными инструментами для реклассификации вариантов неопределенного значения в BR1CA. Здесь мы описываем протокол функционального анализа вариантов BRCA1 с помощью базового редактора цитозина на основе CRISPR. Этот протокол содержит руководящие принципы для выбора целевых объектов, функционального анализа и оценки вариантов BRCA1.

Introduction

Ген восприимчивости к раку молочной железы типа 1(BRCA1)является широко известным геном супрессора опухоли. Поскольку ген BRCA1 связан с повреждением ДНК, мутации в этом гене приведут к большему риску развития рака у человека1. Рак молочной железы, яичников, простаты и поджелудочной железы связан с унаследованными потеря функции (LOF) мутации гена BRCA1 2. Функциональная оценка и выявление вариантов BRCA1 может помочь в профилактике и диагностике различных заболеваний. Для решения функции вариантов BRCA1, несколько методов были разработаны и широко используются для изучения патогенности вариантов BRCA1, таких как эмбриональные анализы жизнеспособности стволовых клеток, флуоресцентные анализы репортера, и терапевтические чувствительность наоснове наркотиков анализы 3,4,5,6. Хотя эти методы оценили функцию многих вариантов BRCA1, методы, включающие экзогенно выраженные варианты BRCA1, создают ограничения с точки зрения переэкспрессии, которые могут повлиять на регуляцию ниже по течению, дозировку генов исворачивание белка 7. Кроме того, эти анализы не могут быть использованы для посттранстуального регулирования, такие как сращивание мРНК, стабильность транскрипта иэффект непереводимой области 8,9.

Система CRISPR-Cas9 позволяет целенаправленно редактировать геном в живых клетках и организмах10. С помощью одногидной РНК, Cas9 может вызвать двухструнные перерывы (DSBs) в хромосомной ДНК на конкретных геномных локусов для того, чтобы активировать два пути восстановления ДНК: подверженных ошибкам нехомологических конце присоединения (NHEJ) путь и безошибочно гомологии направленного ремонта (HDR)путь 11. HDR является точным механизмом ремонта; однако DSBs, индуцированные ядром Cas9 для HDR, часто приводит к нежелательной вставке и удалению (инделя) мутации. Кроме того, он нуждается в гомологичные шаблоны донорской ДНК для восстановления повреждения ДНК и имеет относительно низкую эффективность. В последнее время Cas9 nickase (nCas9) были слиты с цитидин deaminase доменов для ориентации C:G к T: Замены, без необходимости гомологичные шаблоны ДНК и ДНК двойнойнити перерывы 12,13,14,15. Используя редактор базы цитозина, мы разработали новый метод функционального анализа вариантовBRCA1 16.

В этом исследовании мы использовали CRISPR-опосредованного редактора базы цитозина, BE314, который индуцирует эффективные C:G к T:A точечные мутации, для реализации функциональной оценки вариантов BRCA1 и успешно определили функции нескольких вариантов BRCA1 (рисунок 1).

Figure 1
Рисунок 1: Обзор рабочего процесса для функциональной оценки. (A)Схема, показывающая функциональную оценку BRCA1. Поскольку LOF BRCA1 влияет на жизнеспособность клеток, когда мутация BRCA1 является патогенной, клетки умирают по мере увеличения числа проходов. (B)Этапы функциональной оценки BRCA1. Пунктирная коробка необязательна. Его можно заменить ко-трансфектированием экспрессии гРНК и BE3, выражаюющих ДНК плазмидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод 1 (генерация клеточных линий HAP1-BE3) необязателен. Вместо построения линии клеток, выражающая BE3, BE3-кодируя плазмидную ДНК может быть совместно трансфицирована с плазмидной ДНК, кодирующей гРНК. Другие варианты редакторов базы цитозина, такие как BE4max, также могут быть использованы для высокоэффективного базового редактирования.

1. Поколение клеточных линий HAP1-BE3

  1. Строительство плазмидной ДНК
    1. Чтобы построить lentiBE3-блайт плазмидной ДНК для производства лентивируса, усилить BE3 кодирования последовательностей в pCMV-BE3 (Таблица материалов) ПЦР с использованием полимеразы высокой точности. Дизайн праймер PCR, чтобы содержать перекрывающиеся последовательности переваренного вектора (от шага 1.1.2) для изотермальной сборки следующимобразом:
      праймер-F: 5'-TTTGCCGCCAGAGAGAGAGGACCGGTTCTCTAGA GCCGCCACCATGAGCGAGAG-3',
      праймер-R: 5'-CAGAGAGAAGTTTGTTGGGCCGGATCC GACTTTCCTCTTCTCTTTGGG-3'
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нуклеотиды, показанные в подчеркнуто, перекрываются с переваренным вектором, и эти последовательности будут специфичны для выбранного пользователем вектора назначения.
    2. Дайджест lentiCas9-blast(Таблица материалов)плазмидная ДНК с ферментами ограничения, XbaI и BamHI (1 единица на 1 мкг) в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия. Вы запустите переваренный продукт на 0,8% агарозного геля и очистите соответствующие размеры полос (8,6 кб) с помощью коммерческого комплекта для извлечениягеля (Таблица материалов).
    3. Клон усиленный продукт BE3 PCR и переваренный lentiCas9-Blast вектор с помощью изотермального комплекта сборки(Таблица материалов). Используйте в общей сложности 0,02-0,5 п.п. фрагментов ДНК и соотношение вектора 1:3: вставка. Преобразование сборочного продукта в DH5 альфа-компетентных клеток18. Добавьте трансформанты на агар-пластину, содержащую ампициллин (100 мкг/мл) и инкубировать пластину на ночь при 37 градусах Цельсия.
    4. Выберите несколько колоний и привить их в 4 мл LB (лизогенный бульон) среды, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) и расти культуры в встряхивания инкубатора на 180 об /мин.
    5. Очищайте плазмидную ДНК с помощью коммерческого набора для очистки ДНК плазмиды(Table of Materials)в соответствии с протоколами производителя.
    6. Чтобы подтвердить успех клонирования ДНК, проанализируйте последовательности BE3 каждой очищенной плазмидной ДНК (от шага 1.1.5) с помощью секвенирования Sanger с использованием стандартных и BE3-специфическихгрунтовок ( Дополнительная таблица 1) и выберите точную клонированную конструкцию lentiBE3-взрыва.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа результатов секвенирования Sanger мы рекомендовали несколько инструментов, таких как BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) и CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
  2. Культура клеток и генерация клеточных линий HAP1-BE3
    1. Поддержание клеток в здоровом состоянии и в активно делящихся состояниях. Культурные клетки HAP1 в модифицированной среде Dulbecco в Iscove(Таблица материалов),содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина. Культура HEK293T/17 клеток в модифицированной среде орла Дульбекко(Таблица материалов), содержащий 10% FBS и 1% пенициллин / стрептомицин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HAP1 клетка полезна для генетических исследований из-за его почти гаплоидных клеток. Тем не менее, клетки могут спонтанно вернуться в состояние диплоид в клеточной культуре. Обогащение Hoechst 34580окрашенных 1 n-популяции с использованием flowcytometry будет полезно для поддержания гаплоидии клеток HAP119.
    2. Семя 5 х 106 HEK293T/17 клеток на 100 нм блюдо за 1 день до трансфекции. В день трансфекции, трансфект плазмидной ДНК (15 мкг lentiBE3-взрыв, 9 мкг psPAX2 для вирусной упаковки, и 6 мкг pMD2.G для флакона конверт2-го поколения лентивирусной упаковочной системы) с использованием коммерческих трансфектонных реагентов в соответствии с протоколами производителя (Таблицаматериалов )20. Изменение среды на 6 ч после трансфекции и урожай вируссодержащей среды на 48 ч или 72 ч после трансфекции. Фильтруйте супернатант с помощью фильтра 0,45 мкм.
    3. Трансдуцация лентивирусных частиц BE3 в клетки HAP1 при МВД (множественность инфекции) 0,1. Чтобы приспособиться к соответствующему МВД, используйте последовательно разбавленные концентрации вируса. Удалите среду и замените ее на скорректированную вирусную супернатантную и свежую культурную среду.
    4. На следующий день после трансдукции, изменить средний до 10 мкг / мл блацитидина(Таблица материалов)-содержащих средних и выбрать трансдуцированных клеток в течение 3 дней с блацитидином. После выбора бластицидина выберите колодец с 10% выживших клеток для следующего шага.
    5. После выбора блацитидина, семена транс индуцированных клеток на 96-хорошо пластин при плотности 0,5 клеток / хорошо для того, чтобы изолировать одиночные клоны (например, разбавить 50 клеток в 20 мл (0,5 клеток на 200 йл) культуры среды и aliquot 200 йл на колодец в 96 хорошо пластины). Инкубировать 96-хорошо пластин в течение 2 недель и выбрать одиночные колонии, чтобы подтвердить активность BE3.
    6. Разделите одиночные колонии на два набора: один набор для тестирования активности BE3 и другой для обслуживания. Трансдуцация лентивирусных частиц гРНК в один из наборов для подтверждения активности BE3. Проанализируйте частоту мутаций каждой колонии с помощью анализа T7 endonuclease I (T7E1, Таблицаматериалов) или выполняя целевую технику глубокого секвенирования (шаг 4)21. Выберите подходящие одиночные клоны, которые являются здоровыми и имеют очень активный BE3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки точных частот мутаций мы рекомендуем целевое глубокое секвенирование, чем анализ T7E1. HEK2 (5'-GAACACAAGCATAGACTGGGG-'3) является хорошо проверенным целевым сайтом для BE3.

2. Проектирование и строительство BRCA1, ориентированных на ГРНА

Figure 2
Рисунок 2: Пример плазмидной ДНК гРНК. (A) Для эффективного редактирования целевой последовательности с BE3, NGG PAM (CCN PAM), который помещает цель C (цель G) в пятинуклеотидное окно не требуется. NGG PAM отображается красным цветом, а базовое окно редактирования представлено серой коробкой. (B) Показана последовательность gRNA для базового редактирования c.8047C'gt;T (H1283Y), а целевые пары C:G показаны красным цветом, в то время как активное окно выделено серой коробкой. Для клонирования гРНК последовательности свеса, указанные жирным шрифтом, добавляются как на 5ʹ концах. Шаблоны для гРНК были созданы путем анны двух дополнительных олигонуклеотидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

ПРИМЕЧАНИЕ: Позитивный и отрицательный контроль вариантов BRCA1 имеют важное значение. В этом исследовании в качестве доброкачественных элементов управления используются c.5252G'gt;A (R1751) и c.4527C'gt;T (Y1509Y). в качестве патогенных элементов контроля используются c.191G'gt;A (C64Y), 81-1G'gt;A и c.3598C'gt;T (No1200). Целевые последовательности каждой гРНК перечислены в дополнительной таблице 1.

  1. Получить последовательность генома BRCA1 от GenBank на NCBI22.
  2. Поиск 20-bp целевых сайтов с Protospacer Соседние Мотив (PAM) последовательность "NGG" и "CCN" вокруг мутации интереса. Мутация интереса должна быть расположена в 4-8 нуклеотидов в PAM-дистальный конец гРНК целевых последовательностей из-за активного окна BE3 составляет 4-8 нуклеотидов в PAM-дистальный конец гРНК целевыхпоследовательностей 14. В случае c.8047C'gt;T (H1283Y)- и c.5252G'gt;A (R1751) - таргетинга gRNAs, 5ʹ-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3ʹ и 5ʹ-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-3ʹ, последовательности жирным шрифтом являются активными окнами. C к T и G к преобразованиям происходят с NGG и CCN PAM, соответственно(рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 является полезным веб-инструментов для gRNA дизайн.
  3. Заказать два дополнительных олигонуклеотидов на гРНК; для форвардных олигонуклеотидов добавьте "CACCG" к 5ʹ концу направляющий последовательности, а для обратного олигонуклеотида добавьте "AAAC" к концу 5' и "C" к концу 3' Эти дополнительные последовательности специфичны для вектора экспрессии gRNA назначения (из шага 2.5), используемого для этого протокола, и пользователи должны быть скорректированы для альтернативных векторов экспрессии gRNA(рисунок 2B).
  4. Resuspend олигонуклеотид в дистиллированной воде при окончательной концентрации 100 МКМ. Смешайте два дополнительных олигонуклеотидов до конечной концентрации 10 МКм с буфером T4 Ligation(Таблица материалов) и нагревайте их при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут и охладить их при комнатной температуре для annealing.
  5. Дайджест pRG2 с использованием фермента ограничения, BsaI (1 единица на 1 мкг) в течение 1 ч при 37 градусов поЦельсию( Таблица материалов ). Вы запустите переваренный продукт на 1% агарозного геля и очистите соответствующую по размеру полосу (2,5 кб).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо использования классического метода пищеварения и перевязки можно использовать другой метод клонирования, такой как клонирование Золотых Ворот.
  6. Ligate annealed олигонуклеотид дуплекс вектор ДНК с помощью приобретенных лигазы ДНК (Таблица материалов) в соответствии с протоколом производителя и превратить их в DH5 альфа-компетентных клеток (Другие штаммы кишечной палочки, которые широко используются для субклонирования также могут быть использованы).
  7. Добавьте трансформанты в агаровую пластину, содержащую ампициллин (100 мкг/мл) и инкубировать пластину на ночь при 37 градусах Цельсия. Очистить плазмидную ДНК от нескольких трансформантов и проанализировать их последовательности gRNA с помощью Сэнгера секвенирования с помощью грунтовки, которые премьер на U6 промоутер (Таблица материалов).

3. Создание вариантов BRCA1 с использованием инструментов базового редактирования CRISPR при посредничестве CRISPR

ПРИМЕЧАНИЕ: Если линии клеток HAP1-BE3 не используются, BE3-кодируя плазмидную ДНК может быть совместно трансфицирована с BRCA1-таргетингомgRNA. По сравнению с ко-трансфектированием BE3 и плазмидов гРНК, трансфекция плазмидной гРНК для клеток HAP-BE3 вызывает эффективное базовое редактирование до 3 раз при целевом локусе в наших руках.

  1. Семя 5 х 105 HAP1-BE3 клеток (или HAP1 клеток в случае совместного трансфекции методы) на колодец в 24-хорошо пластин 1 день до трансфекции. Во время трансфекции, клетки культуры, чтобы достичь соответствующей плотности (70%-80% слияния).
  2. Transfect BRCA1- таргетирование гРНК с использованием приобретенных трансфектных реагентов(таблицаматериалов) в соответствии с протоколом производителя. Используйте 1 мкг BRCA1-таргетингаgRNAs (с 1 мкг BE3 кодирования плазмидной ДНК в случае методов совместной трансфекции), чтобы вызвать C:G к T: Преобразование в BRCA1 целевых сайтов. Инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию и субкультуры каждые 3-4 дня.
  3. Урожай клеточных гранул 3, 10 и 24 дней после трансфекции для анализа эффективности базового редактирования (образцы через 3 дня после трансфекции анализируются при повторной анализе в виде образцов 0-го дня).
  4. Экстракт геномной ДНК с использованием комплекта геномной очисткиДНК (Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем оптимизировать условия трансфекции с переменным соотношением реагента к ДНК. Оптимальным условием для трансфекции HAP1 является 4:1 рацион реагента в ДНК в наших руках.

4. Пример подготовки к секвенированию нового поколения Illumina (NGS)

Figure 3
Рисунок 3: Подготовка к последовательности следующего поколения. 1-йпраймер ПЦР был разработан для усиления целевого участка BRCA1 на геномной ДНК. 2-ягрунтовка PCR была разработана таким образом, что ее последовательности расположены больше внутри, чем 1-й ПЦР грунтовки последовательностей. Дополнительные последовательности, показанные как желтый бар, были добавлены на обоихконцах 2-й праймер PCR, чтобы прикрепить необходимые последовательности для выполнения последовательности следующего поколения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

  1. Дизайн 1-йПЦР грунтовки для усиления BRCA1 целевых сайтов. Несмотря на отсутствие ограничений на размер 1-гопродукта ПЦР, размер продукта хлт;1 кб рекомендуется эффективно усиливать определенный регион(рисунок 3).
  2. Дизайн2-й ПЦР грунтовки, расположенные внутри1-й pcR продукта. Рассмотрим размер ампликона в соответствии с длиной чтения NGS (например, размер продукта amplicon должен быть меньше, чем 300 bp для 2 × 150 bp парного запуска для слияния каждого чтения). Для того, чтобы прикрепить основные последовательности для анализа NGS, добавить дополнительные последовательности к 5'конец2-й праймеры ПЦР следующим образом: для вперед грунтовки, добавить 5'-ACACTCTCTCCACACCGCCTCCCGATCT-3' последовательности к 5' конец, и для обратного грунтовки, добавить 5'-GTGACTGGAGTTCAGGTGTGGGGTCCCC АТКТ-3 'последовательности к концу 5'
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали вложенный ПЦР, чтобы уменьшить ампликсон неспецифической привязки, предотвращая присоединение грунтовки к нецелевой последовательности.
  3. Усиление целевых участков BRCA1 на геномной ДНК, полученной из трех точек времени. Используйте полимеразу высокой точности в соответствии с протоколом производителя для минимизации ошибок ПЦР. Для1-й реакции ПЦР используйте 100 нг геномной ДНК для усиления в течение 15 циклов. Для2-й реакции ПЦР используйте 1 МКЛ1-го продукта ПЦР для усиления в течение 20 циклов. Вы запустите 5 мкл2-го продукта ПЦР на 2% агарозного геля и подтвердите размер.
  4. Для того, чтобы прикрепить основные последовательности для анализа NGS, усилить2-й продукт ПЦР с помощью грунтовки, перечисленные ниже. Для реакции ПЦР для усиления до 30 циклов с использованием полимеразы высокой точности используется 1 МЛ 2-го продукта ПЦР.
    1. Для выполнения мультиплексного секвенирования для большого количества библиотек, которые будут объединяются и секвенированы одновременно, используйте вперед (D501 - D508) и обратные (D701 - D712) грунтовки, которые имеют уникальную последовательность индексов(Дополнительная таблица 1). Усильте каждый образец, используя различные наборы грунтовок для проведения уникальной стратегии двойной индексации.
    2. Вы запустите 5 мкл продукта ПЦР на 2% агарозного геля, чтобы подтвердить размер, и очистите ампликон с помощью коммерческого комплекта очисткиПЦР (Таблица материалов). Смешайте каждый образец в равных количествах для создания библиотеки NGS.
  5. Количественная оценка библиотеки NGS на длине волны 260 нм с помощью спектрофотометров и разбавления библиотеки NGS до концентрации 1 нм с использованием буфера повторного использования или 10 мМ Трис-HCl, рН 8,5. Подготовьте 100 мл библиотеки, разбавленной соответствующей концентрацией нагрузки в зависимости от типов библиотек (например, подготовь 200 рМ библиотеки для Nextera DNA Flex).
    1. В качестве управления объединить phiX с разбавленным образцом подходит для типа комплекта.
    2. Загрузите библиотеку на картридж и запустите NGS в соответствии с протоколом производителя. Системы Illumina iSeq 100 или Miseq могут секвенировать ампликоны различной длины до 300 б.п. для одночитаемого или парного конца. Мы рекомендовали более 10 000 считываний на целевой amplicon для углубленного анализа эффективности базового редактирования.

5. Анализ эффективности базового редактирования для функциональной оценки вариантов BRCA1

  1. Проанализируйте эффективность базового редактирования с помощью MAUND24. Эффективность базового редактирования рассчитывается, как описано ниже.
    Equation 1
    Если в активном окне BE3 присутствует несколько цитозинов, рассматривается только преобразование от C до T, предназначенное для оценки варианта BRCA1. Например,еслипоследовательности активного окна BE3 являются "C 4 A5T6C7T8", то возможнымипоследовательностями, генерируемыми базовым редактированием, являются "T4A5T6C7T8","C4A5T6T7T8"и "T4A5T6T7T8". В настоящее время, если позиция 4 является целевой позицией для желаемого варианта BRCA1, то для расчета эффективностибазового редактированиярассматривается только последовательность ""T4A 5 T6C7T8".
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы также рекомендуем другие веб-инструменты для анализа деятельности базового редактирования, такие как CRISPResso225и BE-анализатор23.
  2. Проверка результатов с использованием положительного и отрицательного контроля вариантов BRCA1. Эффективность базового редактирования доброкачественного контроля должна оставаться прежней, в то время как эффективность патогенного контроля должна со временем снижаться.
  3. Рассчитайте относительную эффективность базового редактирования вариантов BRCA1 и определите их патогенность. Значительные различия между образцами Дня 0 и 21-го дня анализируются соответствующим статистическим анализом, таким как t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Экспериментальные подходы, описанные в этом протоколе, позволяют проводить функциональную оценку эндогенных вариантов BRCA1, генерируемых редакторами базы цитозинов на основе CRISPR. Чтобы выбрать соответствующие клеточные линии для функциональной оценки вариантов BRCA1, исследователи должны подтвердить, что BRCA1 является важным геном в целевых клеточных линиях. Например, мы сначала трансфицированы Cas9 и GRNAs в клеточные линии HAP1, чтобы нарушить BRCA1 и проанализировали частоты мутаций путем целевого глубокого секвенирования. Мы обнаружили, что частоты мутаций значительно снизились с течением времени в клеточных линиях HAP1(рисунок 4A). Эти результаты показали, что BRCA1 является важным геном для жизнеспособности клеток в клеточных линиях HAP1. Чтобы выяснить, влияют ли заменяемые C:G до T:A варианты на функцию BRCA1,плазмиды ДНК, кодирующие гРНК, которые могли вызвать каждую мутацию, были трансфицированы на клеточные линии HAP1-BE3 и были проанализированы частоты замены. Относительные частоты замещения c.3598C'gt;T (p. 1200), патогенный вариант, резко снизились, в то время как частоты c.4527C'gt;T (p.Y1509Y), доброкачественный вариант, оставались похожими современем (рисунок 4B). В базе данных ClinVar, c.154C'gt;T (p. L52F), c.3847C'gt;T (p.H1283Y), и c.5056C'gt;T (p.H1686Y) BRCA1 сообщаются как варианты неопределенного значения. Мы проанализировали функцию этих вариантов с помощью методов, упомянутых выше, и обнаружили, что частоты замещения нуклеотида этих трех вариантов снизились в зависимости от времени образом(рисунок 4B). Из этих результатов три замены изменили функцию BRCA1 и могут быть классифицированы как патогенные мутации.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные результаты функционального исследования BRCA1 с использованием систем CRISPR-Cas9. (A)Нарушение BRCA1 влияет на жизнеспособность клетки. Клетки HAP1 были трансфицированы плазмидной кодирующей spCas9 и двумя гРНК, нацеленными на BRCA1,соответственно, и было выполнено целевое глубокое секвенирование для анализа жизнеспособности клеток. Частоты мутаций BRCA1 уменьшились во времени в клетках, трансфицированных двумя независимыми гРНК, а частоты мутаций CCR5, которые использовались в качестве отрицательного контроля, оставались неизменными с течением времени. (B)Функциональные оценки пяти вариантов BRCA1. Клетки HAP1-BE3 были трансфицированы гРНК, вызывая мутации BRCA1, соответственно, и было выполнено целевое глубокое секвенирование для анализа жизнеспособности клеток. Относительные частоты замены снизились в зависимости от времени образом в ячейках c.3598C'gt;T, c.154C'gt;T, c.3847C'gt;T, и c.5056C'gt;T и c.4527C'gt;T остались прежними. Бары ошибок показывают стандартную погрешность среднего. Звездочки обозначают различные значения P: Пя lt;0.005., n.s: не значительный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает простой метод функциональных оценок вариантов BRCA1 с использованием базового редактора CRISPR-медитируемого цитозина. В протоколе описаны методы проектирования ГРНК в целевом локусе и строительства плазмидных ДНК, из которых они выражены. Редакторы базы цитозина индуцировать преобразование нуклеотида в активном окне (в случае BE3, нуклеотидов 4-8 в PAM-дистальной конце целевых последовательностей gRNA). Исследователь должен тщательно выбирать целевые последовательности, потому что все цитозины в активном окне могут быть заменены тиминами. Кроме того, как описано в шаге 5, несколько цитозинов в активном окне должны быть тщательно проанализированы для оценки функции вариантов BRCA1.

Одним из наиболее важных шагов является трансфекция в линии целевых клеток, которая влияет на начальную частоту мутаций для функциональных оценок BRCA1. Чтобы улучшить начальную частоту мутаций, исследователи должны оптимизировать методы доставки к линии интереса клеток. Как описано в шаге 1, генерация ЛИНИй клеток BE3 является полезным вариантом для увеличения первоначальной частоты мутаций. Мы не рекомендуем лентивирусную трансдукцию гРНК в клетки HAP1-BE3, так как составное выражение BE3 и гРНК может вызвать накопительное нуклеотидное преобразование, и эти результаты мешают функциональной оценке вариантов BRCA1.

В дополнение к методам BE3, представленным в этом протоколе, рекомендуется несколько дополнительных методов для дальнейшего расширения функциональных оценок вариантов BRCA1. Во-первых, как описано выше, частота мутаций в первоначальном образце важна для получения уверенных результатов вариантов BRCA1. Для повышения эффективности базового редактирования рекомендуются варианты редакторов базы цитозина, такие как BE4max. Во-вторых, BE3 распознает целевую последовательность ДНК через последовательности PAM 5'-NGG-3, что является ограничением в генерации различных типов вариантов BRCA1. Недавно разработанные варианты Cas9 с измененными последовательностями PAM являются полезным вариантом в данном случае для расширения целевых вариантов BRCA1 26,27,28. В-третьих, BE3 вызывает существенное базовое редактирование на нежелательных сайтах, и внецелевой эффект может повлиять на функциональную оценку вариантов BRCA129,30,31. Для уменьшения внецелевого эффекта BE3, целевые участки ГРНК должны быть тщательно отобраны без каких-либо аналогичных последовательностей в геноме. SECURE-BE3 или YE1, который разработал для снижения нежелательного базового редактирования в геноме и транскриптоме являются полезнымвариантом 32,33. В-четвертых, метод редактирования генома насыщения (SGE) на основе Cas9-опосредованного HDR также отличные варианты для функционального анализа вариантов BRCA119. Метод не имеет ограничений для выбора целевых последовательностей и нуклеотидных позиций вариантов BRCA1. Тем не менее, HDR-подход является относительно менее эффективным, чем базовые редакторы и дополнительно требует проектирования и синтеза шаблонов доноров14. Наконец, полученные пациентом варианты BRCA1 включают в себя различные мутации, такие как точечные мутации, вставки и удаления. Из них точечные мутации являются основными вариантами популяции BRCA1, которые являются не только преобразованием C:G в T:A, но и A:T к G:C, C:G к G:C и A:T к преобразованиям T:A. Для функциональных оценок этих типов конверсий, CRISPR-опосредованная аденозин база редакторов и премьер-редакторы являютсяценными вариантами 34,35. Быстро развивающаяся технология геномной инженерии позволит проводить функциональные оценки более разнообразных вариантов BRCA1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным исследовательским фондом Кореи (гранты 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637, и 2018R1A5A2020732 до Y.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI NEB R3136 Restriction enzyme
Blasticidin Thermo Fisher Scientific A1113903 Drug for selecting transduced cells
BsaI NEB R0535 Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504 Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco 11965092 Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum Gibco 16000036 Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium Gibco 12440046 Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast Addgene 52962 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027 Transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985070 Transfection materials
pCMV-BE3 Addgene 73021 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140 Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530SQ High-fidelity polymerase
pMD2.G Addgene 12259 Plasmids DNA for virus prep.
pRG2 Addgene 104174 gRNA cloning vector
psPAX2 Addgene 12260 Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit Qiagen 28704 Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit NEB M2200 Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I NEB M0302 Materials for T7E1 assay
XbaI NEB R0145 Restriction enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  2. Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).
  3. Millot, G. A., et al. A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance. Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).
  4. Santos, C., et al. Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).
  5. Starita, L. M., et al. A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function. American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).
  6. Anantha, R. W., et al. Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance. Elife. 6, (2017).
  7. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  8. Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs. Frontiers in Genetics. 6, 242 (2015).
  9. Saunus, J. M., et al. Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR. Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).
  10. Knott1, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361, 866-869 (2018).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Hess, G. T., et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).
  13. Kim, K., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).
  14. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  15. Park, D. S., et al. Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos. Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).
  16. Kweon, J., et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).
  17. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  19. Findlay, G. M., et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).
  20. Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries. PLoS One. 13 (6), 0199473 (2018).
  21. Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).
  22. Sayers, E. W., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).
  23. Hwang, G. H., et al. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 19 (1), 542 (2018).
  24. Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).
  25. Clement, K., et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).
  26. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  27. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  28. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. , (2020).
  29. Kim, D., et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).
  30. Zuo, E., et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364 (6437), 289-292 (2019).
  31. Jin, S., et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 364 (6437), 292-295 (2019).
  32. Grunewald, J., et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).
  33. Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).
  34. Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
  35. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).

Tags

Исследования рака выпуск 168 CRISPR-Cas базовое редактирование BE3 BRCA1 функциональнаяоценка инженерия генома
Функциональная оценка <em>вариантов BRCA1</em> с использованием базовых редакторов CRISPR-Mediated
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

See, J. E., Shin, H. R., Jang, G.,… More

See, J. E., Shin, H. R., Jang, G., Kweon, J., Kim, Y. Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors. J. Vis. Exp. (168), e61557, doi:10.3791/61557 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter