Summary
Las personas con mutaciones BRCA1 tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer, lo que garantiza una evaluación precisa de la función de las variantes brca1. En este documento, describimos un protocolo para la evaluación funcional de variantes BRCA1 utilizando editores base de citosina mediadas por CRISPR que permiten la conversión de C:G a T:A dirigida en células vivas.
Abstract
Estudios recientes han investigado los riesgos asociados con las mutaciones del gen BRCA1 utilizando varios métodos de evaluación funcional, como ensayos de reporteros fluorescentes, ensayos embrionarios de viabilidad de células madre y ensayos terapéuticos de sensibilidad basada en fármacos. Aunque han aclarado muchas variantes brca1, estos ensayos que implican el uso de variantes BRCA1 expresadas exógenamente están asociados con problemas de sobreexpresión y no se pueden aplicar a la regulación post-transcripcional. Para resolver estas limitaciones, anteriormente informamos de un método de análisis funcional de variantes BRCA1 a través del editor base de citosina mediada por CRISPR que inducen la sustitución de nucleótidos dirigidos en células vivas. Utilizando este método, identificamos variantes cuyas funciones siguen siendo ambiguas, incluyendo c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T y c.4986+5G>A, y confirmó que los editores base mediados por CRISPR son herramientas útiles para reclasificar las variantes de importancia incierta en BRCA1. Aquí, describimos un protocolo para el análisis funcional de variantes BRCA1 utilizando el editor base de citosina basado en CRISPR. Este protocolo proporciona directrices para la selección de sitios de destino, análisis funcional y evaluación de variantes BRCA1.
Introduction
El gen de susceptibilidad tipo 1 del cáncer de mama(BRCA1)es un gen supresor tumoral ampliamente conocido. Debido a que el gen BRCA1 está relacionado con la reparación del daño del ADN, las mutaciones en este gen conducirían a un mayor riesgo de desarrollo del cáncer en un individuo1. Los cánceres de mama, ovario, próstata y páncreas están relacionados con mutaciones hereditarias de pérdida de función (LOF) del gen BRCA1 2. La evaluación funcional y la identificación de las variantes brca1 pueden ayudar a prevenir y diagnosticar las diversas enfermedades. Para abordar la función de las variantes BRCA1, se han desarrollado varios métodos y utilizados ampliamente para investigar la patogenicidad de variantes BRCA1 como ensayos embrionarios de viabilidad de células madre, ensayos de reportero fluorescente y ensayos terapéuticos de sensibilidad basada en fármacos3,4,5,6. Aunque estos métodos han evaluado la función de una gran cantidad de variantes BRCA1, los métodos que implican variantes BRCA1 expresadas exógenamente plantean limitaciones en términos de sobreexpresión que podrían afectar a la regulación aguas abajo, dosis de genes, y plegado de proteínas7. Además, estos ensayos no pueden aprovecharse para el reglamento posttranscriptional, como el empalme del ARNM, la estabilidad de la transcripción y el efecto de la región no traducida8,9.
El sistema CRISPR-Cas9 permite la edición selectiva del genoma en células y organismos vivos10. A través de un ARN mono guía, Cas9 puede inducir roturas de doble hebra (DSB) en adn cromosómico en loci genómico específico con el fin de activar dos vías de reparación del ADN: vía de unión final nohomologous (NHEJ) propensa a errores y vía11de reparación dirigida por homología sin errores (HDR). HDR es un mecanismo de reparación preciso; sin embargo, los DSB inducidos por la nucleasa Cas9 para HDR a menudo resultan en una mutación no deseada de inserción y eliminación (indel). Además, necesita plantillas homologosas de ADN de donantes para reparar el daño del ADN y tiene una eficiencia relativamente baja. Recientemente, Cas9 nickase (nCas9) se han fusionado con dominios desaminases de citidina para apuntar a sustituciones de C:G a T:A, sin necesidad de plantillas de ADN homologosas y roturas de doble hebra de ADN12,13,14,15. Utilizando el editor base de citosina, desarrollamos un nuevo método para el análisis funcional de las variantes BRCA116.
En este estudio, utilizamos el editor base de citosina mediada por CRISPR, BE314, que induce mutaciones eficientes de punto C:G a T:A, para implementar la evaluación funcional de las variantes BRCA1 e identificar con éxito las funciones de varias variantes BRCA1 (Figura 1).
Figura 1: Una visión general del flujo de trabajo para la evaluación funcional. (A) Esquema que muestra la evaluación funcional de BRCA1. Debido a que el LOF de BRCA1 afecta la viabilidad celular, cuando la mutación BRCA1 es patógena, las células mueren a medida que aumenta el número de pasajes. B) Etapas de la evaluación funcional de BRCA1. El cuadro punteado es opcional. Puede ser reemplazado por la co-transfección de la expresión de GRNA y BE3 expresando ADN plásmidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
NOTA: El método 1 (generación de líneas de celda HAP1-BE3) es opcional. En lugar de construir una línea celular que expresa BE3, el ADN plásmido que codifica BE3 se puede co-transfectar con ADN plásmido codificante de GRNA. Otras variantes de los editores base de citosina, como BE4max, también se pueden utilizar para la edición base altamente eficiente.
1. Generación de líneas celulares HAP1-BE3
- Construcción de ADN plásmido
- Para construir el ADN plásmido lentiBE3-blast para la producción de lentivirus, amplificar las secuencias de codificación BE3 en pCMV-BE3(Tabla de Materiales)por PCR utilizando polimerasa de alta fidelidad. Diseñe la imprimación PCR para que contenga secuencias superpuestas del vector digerido (del paso 1.1.2) para el ensamblaje isotérmico de la siguiente manera17:
primer-F: 5'-TTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3',
primer-R: 5'-CAGAGAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTCTCTCTTGGG-3'
NOTA: Los nucleótidos mostrados en subrayado se superponen con el vector digerido y estas secuencias serán específicas del vector de destino elegido por el usuario. - Digerir lentiCas9-blast (Tabla de materiales) ADN plásmido con las enzimas de restricción, XbaI y BamHI (1 unidad por 1 μg) para 1 h a 37 °C. Ejecute el producto digerido en un gel de agarose del 0,8% y purifique las bandas de tamaño adecuado (8,6 kb) utilizando un kit comercial de extracción de gel(Tabla de Materiales).
- Clonar el producto PCR BE3 amplificado y el vector lentiCas9-Blast digerido utilizando el kit de montaje isotérmico (Tabla de materiales). Utilice un total de 0,02-0,5 pmol de fragmentos de ADN y una relación de 1:3 de vector:insert. Transforme el producto ensamblador en células alfa-competentes DH518. Añadir los transformadores en una placa de agar que contenga ampicilina (100 μg/ml) e incubar la placa durante la noche a 37 °C.
- Elija varias colonias e inocularlas en 4 ml de caldo LB (caldo lysogeny) que contenga ampicilina (100 μg/ml) y haga crecer el cultivo en una incubadora temblorosa a 180 rpm.
- Purifique el ADN plásmido utilizando un kit comercial de purificación de ADN plásmido(Tabla de Materiales)de acuerdo con los protocolos del fabricante.
- Para confirmar el éxito de la clonación de ADN, analice las secuencias BE3 de cada ADN plásmido purificado (del paso 1.1.5) mediante secuenciación Sanger utilizando imprimaciones estándar y específicas de BE3(Tabla suplementaria 1)y seleccione la construcción exacta clonada de lentiBE3-blast.
NOTA: Para analizar los resultados de la secuenciación de Sanger, recomendamos varias herramientas como BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) y CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
- Para construir el ADN plásmido lentiBE3-blast para la producción de lentivirus, amplificar las secuencias de codificación BE3 en pCMV-BE3(Tabla de Materiales)por PCR utilizando polimerasa de alta fidelidad. Diseñe la imprimación PCR para que contenga secuencias superpuestas del vector digerido (del paso 1.1.2) para el ensamblaje isotérmico de la siguiente manera17:
- Cultivo celular y generación de líneas celulares HAP1-BE3
- Mantener las células en una condición sana y en un estado de división activa. Cultivo de células HAP1 en el medio modificado de Dulbecco de Iscove(Tabla de Materiales)que contiene 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina/estreptomicina. Cultivo HEK293T/17 células en el medio de águila modificado de Dulbecco(Tabla de materiales)que contiene 10% FBS y 1% penicilina/ estreptomicina.
NOTA: La célula HAP1 es útil para la investigación genética debido a que es casi células haploides. Sin embargo, las células pueden volver espontáneamente a un estado diploide en el cultivo celular. Enriquecimiento Hoechst 34580 teñido 1n-población utilizando flucytometría será útil para el mantenimiento de haploidy de células HAP119. - Semillas 5 x 106 células HEK293T/17 en un plato de 100 nm 1 día antes de la transfección. El día de la transfección, transfectar el ADN plásmido (15 μg de lentiBE3-blast, 9 μg de psPAX2 para envases virales, y 6 μg de pMD2.G para envolvente de vial de2ª generación de sistema de envasado lentiviral) utilizando reactivos de transfección comerciales de acuerdo con los protocolos del fabricante (Tabla de Materiales)20. Cambie el medio a 6 h después de la transfección y el medio que contiene el virus de la cosecha a 48 h o 72 h después de la transfección. Filtre el sobrenadante con un filtro de 0,45 μm.
- Transducir las partículas lentiviales de BE3 a células HAP1 en un MOI (multiplicidad de infección) de 0,1. Para ajustarse a un MOI adecuado, utilice concentraciones de virus diluidas en serie. Retire el medio y reemplácelo por un sobrenadante viral ajustado y un medio de cultivo fresco.
- Un día después de la transducción, cambie el medio a 10 μg/ml de blasticidina(tabla de materiales)que contiene el medio y seleccione las células transducidas durante 3 días con blasticidina. Después de la selección blasticidina, seleccione un pozo con ~ 10% de las células sobrevivientes para el siguiente paso.
- Después de la selección de blasticidina, sembrar las células transducidas en placas de 96 pozos a una densidad de 0,5 células/pozo con el fin de aislar clones individuales (por ejemplo, diluir 50 células en 20 mL (0,5 células por 200 μL) medio de cultivo y alícuota 200 μL por pozo en 96 placa de pozo). Incubar las placas de 96 pozos durante 2 semanas y recoger las colonias individuales para confirmar la actividad de BE3.
- Divida las colonias individuales en dos conjuntos, un conjuntos para probar la actividad de BE3 y otro para el mantenimiento. Transducir las partículas lentiviales de gRNAs en uno de los conjuntos para confirmar la actividad BE3. Analizar la frecuencia de mutación de cada colonia utilizando ensayo T7 endonuclease I (T7E1, Tabla de Materiales)o realizando la técnica de secuenciación profunda dirigida (paso 4)21. Seleccione clones individuales adecuados que estén en buen estado y tengan un BE3 altamente activo.
NOTA: Para validar las frecuencias exactas de mutación, recomendamos la secuenciación profunda dirigida que el ensayo T7E1. HEK2 (5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-'3) es un sitio de destino bien validado para BE3.
- Mantener las células en una condición sana y en un estado de división activa. Cultivo de células HAP1 en el medio modificado de Dulbecco de Iscove(Tabla de Materiales)que contiene 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina/estreptomicina. Cultivo HEK293T/17 células en el medio de águila modificado de Dulbecco(Tabla de materiales)que contiene 10% FBS y 1% penicilina/ estreptomicina.
2. Diseño y construcción de BRCA1 dirigido a gRNAs
Figura 2: Un ejemplo de ADN plásmido gRNA. (A) Para editar eficazmente la secuencia de destino con BE3, se requiere una PAM de NGG (CCN PAM) que coloca la C de destino (G de destino) dentro de una ventana de cinco nucleótidos. NGG PAM se muestra en rojo y la ventana de edición base está representada por un cuadro gris. (B) Se indica la secuencia de gRNA para la edición base c.8047C>T (H1283Y) y los pares C:G de destino se muestran en rojo mientras que la ventana activa se resalta mediante un cuadro gris. Para la clonación de gRNA, las secuencias de voladizo indicadas en negrita se agregan en ambos extremos 5ʹ. Las plantillas para gRNA se generaron recocidos los dos oligonucleótidos complementarios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
NOTA: Los controles positivos y negativos de las variantes BRCA1 son esenciales. En este estudio, c.5252G>A (R1751Q) y c.4527C>T (Y1509Y) se utilizan como controles benignos. c.191G>A (C64Y), 81-1G>A y c.3598C>T (Q1200*) se utilizan como controles patógenos. Las secuencias de destino de cada GRNA se enumeran en la Tabla complementaria 1.
- Obtenga la secuencia del genoma BRCA1 de GenBank en NCBI22.
- Busque en los sitios de destino de 20 bp con la secuencia de motivo adyacente protoespacial (PAM) "NGG" y "CCN" en torno a la mutación de interés. La mutación de interés debe ubicarse en 4-8 nucleótidos en el extremo PAM-distal de las secuencias objetivo de gRNA debido a que la ventana activa de BE3 es 4-8 nucleótidos en el extremo PAM-distal de las secuencias objetivo de gRNA14. En el caso de los GRNAs de orientación c.8047C>T (H1283Y)- y c.5252G>A (R1751Q), 5ʹ-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3ʹ y 5ʹ-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-3ʹ, las secuencias en negrita son ventanas activas. Las conversiones de C a T y G a A se producen con NGG y CCN PAM, respectivamente (Figura 2A).
NOTA: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 es útil herramientas basadas en web para el diseño de GRNA. - Ordenar dos oligonucleótidos complementarios por gRNA; para los oligonucleótidos delanteros, añadir "CACCG" al extremo 5ʹ de la secuencia guía, y para los oligonucleótidos inversos, añadir "AAAC" al extremo de 5' y "C" al extremo 3'. Estas secuencias adicionales son específicas del vector de expresión gRNA de destino (del paso 2.5) utilizado para este protocolo, y los usuarios deben ajustarse para vectores de expresión gRNA alternativos (Figura 2B).
- Resuspend el oligonucleótido en agua destilada a una concentración final de 100 μM. Mezcle los dos oligonucleótidos complementarios a una concentración final de 10 μM con tampón de ligadura T4(Tabla de materiales)y caliente a 95 °C durante 5 minutos y enfríe a temperatura ambiente para recocido.
- Digest pRG2 utilizando la enzima de restricción, BsaI (1 unidad por 1 μg) durante 1 h a 37 °C (Tabla de Materiales). Ejecute el producto digerido en gel de agarose al 1% y purifique la banda de tamaño adecuado (2,5 kb).
NOTA: En lugar de usar un método clásico de digestión y ligadura, se puede utilizar otro método de clonación como la clonación golden gate. - Ligar el dúplex de oligonucleótido recocido al ADN vectorial utilizando el ligase de ADN comprado(Tabla de materiales)de acuerdo con el protocolo del fabricante y transformarlos en células alfa-competentes DH5 (También se pueden utilizar otras cepas de E. coli que se utilizan ampliamente para el subcloning).
- Añadir los transformadores a una placa de agar que contenga ampicilina (100 μg/ml) e incubar la placa durante la noche a 37 °C. Purifique el ADN plásmido de varios transformadores y analice sus secuencias de GRNA por secuenciación de Sanger utilizando imprimaciones que priman en U6 promoter(Tabla de Materiales).
3. Creación de variantes BRCA1 utilizando herramientas de edición base mediadas por CRISPR
NOTA: Si no se utilizan líneas celulares HAP1-BE3, el ADN plásmido de codificación BE3 se puede co-transfectar con gRNA de orientación BRCA1. En comparación con la co-transfección de plásmidos BE3 y gRNA, la transfección del plásmido gRNA a las células HAP-BE3 induce una edición de base eficiente hasta 3 veces en el locus objetivo en nuestras manos.
- Semillas 5 x 105 células HAP1-BE3 (o células HAP1 en caso de métodos de co-transfección) por pozo en placas de 24 pozos 1 día antes de la transfección. En el momento de la transfección, las células de cultivo alcanzan una densidad adecuada (70%-80% de confluencia).
- Transfectar BRCA1-dirigido a gRNAs utilizando los reactivos de transfección comprados (Tabla de Materiales) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice 1 μg de GRNAs de orientación BRCA1(con 1 μg de ADN plásmido de codificación BE3 en caso de métodos de co-transfección) para inducir la conversión de C:G a T:A en los sitios objetivo de BRCA1. Incubar las células a 37 °C y subcultura cada 3-4 días.
- Cosechar los pellets celulares 3, 10 y 24 días después de la transfección para analizar la eficiencia de edición de la base (Muestras de 3 días después de la transfección se analizan regradando como muestras del día 0).
- Extraer ADN genómico utilizando el kit de purificación genómica del ADN (Tabla de materiales).
NOTA: Recomendamos optimizar las condiciones de transfección con una relación variable de reactivo a ADN. La condición óptima para la transfección HAP1 es 4:1 ración de reactivo al ADN en nuestras manos.
4. Preparación de muestras para secuenciación de próxima generación de Illumina (NGS)
Figura 3: Preparación para la secuenciación de próxima generación. La imprimación 1st PCR fue diseñada para amplificar el sitio objetivo brca1 en ADN genómico. La2ª imprimación PCR fue diseñada de tal manera que sus secuencias se encuentran más adentro que las secuencias de imprimación PCR de 1pt. Se agregaron secuencias adicionales que se muestran como una barra amarilla en ambos extremos de la2ª imprimación PCR para adjuntar las secuencias esenciales para realizar secuencias de próxima generación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Diseñe las imprimaciones PCR de 1pt para amplificar los sitios de destino brca1. Aunque no hay ninguna restricción en el tamaño del producto 1st PCR, se recomienda un tamaño de producto de <1 kb para amplificar eficientemente una región específica (Figura 3).
- Diseñe las 2ª imprimaciones PCR ubicadas dentro del producto 1st PCR. Considere el tamaño del amplificador según la longitud de lectura NGS (Por ejemplo, el tamaño del producto amplicon debe ser menor que 300 bp para 2 × carrera de extremo emparejado de 150 bp para fusionar cada lectura). Para adjuntar secuencias esenciales para el análisis NGS, agregue secuencias adicionales al final de 5' de las 2ª imprimaciones PCR de la siguiente manera: para las imprimaciones delanteras, añadir 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3' secuencias al final de 5', y para las imprimaciones inversas, añadir 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG ATCT-3' secuencias al final 5'.
NOTA: Utilizamos PCR anidado para reducir el amplificador de enlace no específico evitando que las imprimaciones se conecten a secuencias no objetivo. - Amplificar los sitios objetivo brca1 en el ADN genómico obtenido de tres puntos de tiempo. Utilice la polimerasa de alta fidelidad de acuerdo con el protocolo del fabricante para minimizar los errores de PCR. Para la reacción PCR de 1pt, utilice 100 ng de ADN genómico para amplificación durante 15 ciclos. Para la2ª reacción PCR, utilice 1 μL del producto PCR de 1pt para amplificación durante 20 ciclos. Ejecute 5 μL del2º producto PCR en gel de agarose al 2% y confirme el tamaño.
- Con el fin de adjuntar las secuencias esenciales para el análisis NGS, amplificar el2º producto PCR utilizando las imprimaciones enumeradas a continuación. Para la reacción PCR, 1 μL del2º producto PCR se utiliza para amplificación de hasta 30 ciclos utilizando polimerasa de alta fidelidad.
- Para realizar secuencias multiplex para un gran número de bibliotecas que se agruparán y secuenciarán simultáneamente, utilice las imprimaciones directas (D501 – D508) y inversas (D701 – D712), que tienen una secuencia de índice única(Tabla suplementaria 1). Amplifica cada muestra usando diferentes conjuntos de imprimaciones para llevar a cabo la estrategia única de doble indexación.
- Ejecute 5 μL del producto PCR en gel de agarose al 2% para confirmar el tamaño y purifique el amplificador utilizando un kit comercial de limpieza de PCR(Tabla de Materiales). Mezcle cada muestra en cantidades iguales para crear una biblioteca NGS.
- Cuantifique la biblioteca NGS a una longitud de onda de 260 nm utilizando espectrofotómetros y diluya la biblioteca NGS a una concentración de 1 nM utilizando búfer de resuspensión o Tris-HCl de 10 mM, pH 8.5. Preparar 100 μL de la biblioteca diluido a la concentración de carga adecuada dependiendo de los tipos de biblioteca (Por ejemplo, preparar 200 pM de la biblioteca para Nextera DNA Flex).
- Como control, combine phiX con la muestra diluida adecuada para el tipo de kit.
- Cargue la biblioteca en el cartucho y ejecute NGS de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los sistemas Illumina iSeq 100 o Miseq pueden secuenciar los amplificadores de varias longitudes de hasta 300 bp para un solo fin de lectura o emparejado. Recomendamos más de 10.000 lecturas por amplificador objetivo para un análisis en profundidad de la eficiencia de edición base.
5. Análisis de la eficiencia de edición base para la evaluación funcional de variantes BRCA1
- Analice la eficiencia de edición base utilizando MAUND24. La eficiencia de edición base se calcula como se describe a continuación.
Si hay varias citosinas presentes en la ventana activa BE3, solo se considera la conversión de C a T destinada a evaluar la variante BRCA1. Por ejemplo, si las secuencias de la ventana activa BE3 son "C4A5T6C7T8",las secuencias posibles generadas por la edición base son "T4A5T6C7T8","C4A5T6T7T8",y "T4A5T6T7T8". En este momento, si la posición 4 es la posición objetivo para la variante BRCA1 deseada, entonces sólo se considera la secuencia ""T4A5T6C7T8"para calcular la eficiencia de edición base.
NOTA: También recomendamos otras herramientas web para el análisis de la actividad de edición base como CRISPResso225y BE-analyzer23. - Verifique los resultados utilizando controles positivos y negativos de variantes BRCA1. La eficiencia de edición de base del control benigno debe seguir siendo la misma, mientras que las del control patógeno deben disminuir con el tiempo.
- Calcule la eficiencia relativa de edición de base de las variantes BRCA1 y determine su patogenicidad. Las diferencias significativas entre las muestras del día 0 y el día 21 se analizan análisis estadísticos apropiados, como t-test.
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Representative Results
Los enfoques experimentales descritos en este protocolo permiten la evaluación funcional de variantes endógenas BRCA1 generadas por editores base de citosina basados en CRISPR. Para seleccionar las líneas celulares adecuadas para la evaluación funcional de las variantes BRCA1, los investigadores deben confirmar que BRCA1 es un gen esencial en las líneas celulares dirigidas. Por ejemplo, primero transfectamos Cas9 y gRNAs en líneas celulares HAP1 para interrumpir BRCA1 y analizamos las frecuencias de mutación mediante secuenciación profunda dirigida. Encontramos que las frecuencias de mutación disminuyeron significativamente con el tiempo en las líneas celulares HAP1 (Figura 4A). Estos resultados mostraron que BRCA1 es un gen esencial para la viabilidad celular en las líneas celulares HAP1. Para investigar si las variantes sustituidas de C:G a T:A afectan la función de BRCA1,se analizaron los gRNAs de codificación de ADN de los plásmidos, que podrían inducir cada mutación, a las líneas celulares HAP1-BE3 y se analizaron las frecuencias de sustitución. Las frecuencias de sustitución relativas de c.3598C>T (p. Q1200*), una variante patógena, disminuyeron drásticamente, mientras que las de c.4527C>T (p.Y1509Y), una variante benigna, se mantuvieron similares con el tiempo(Figura 4B). En la base de datos ClinVar, c.154C>T (p. L52F), c.3847C>T (p.H1283Y) y c.5056C>T (p.H1686Y) de BRCA1 se notifican como variantes de importancia incierta. Analizamos la función de estas variantes utilizando los métodos mencionados anteriormente y encontramos que las frecuencias de sustitución de nucleótidos de estas tres variantes disminuyeron de manera dependiente del tiempo (Figura 4B). A partir de estos resultados, las tres sustituciones alteraron la función BRCA1 y podrían clasificarse como mutaciones patógenas.
Figura 4: Resultados representativos del estudio funcional de BRCA1 utilizando sistemas CRISPR-Cas9. (A) La interrupción de BRCA1 afecta a la viabilidad celular. Las células HAP1 se transfectaron con spCas9 de codificación de plásmidos y se realizaron dos gRNAs dirigidos a BRCA1,respectivamente, y se realizó una secuenciación profunda dirigida para el análisis de viabilidad celular. Las frecuencias de mutación de BRCA1 disminuyeron de manera dependiente del tiempo en las células transfectadas con dos gRNAs independientes, y las frecuencias de mutación del CCR5, que se utilizó como control negativo, se mantuvieron iguales con el tiempo. (B) Evaluaciones funcionales de cinco variantes BRCA1. Las células HAP1-BE3 fueron transfectadas con gRNAs que inducen mutaciones brca1, respectivamente, y se realizó una secuenciación profunda dirigida para el análisis de viabilidad celular. Las frecuencias de sustitución relativas disminuyeron de manera dependiente del tiempo en celdas de c.3598C>T, c.154C>T, c.3847C>T y c.5056C>T y las de c.4527C>T siguieron siendo las mismas. Las barras de error muestran el error estándar de la media. Los asteriscos denotan diferentes valores P: * P<0.05; ** P<0.005., n.s: no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe un método simple para evaluaciones funcionales de variantes BRCA1 utilizando el editor base de citosina meditado por CRISPR. El protocolo describe los métodos para el diseño de gRNAs en el locus objetivo y la construcción de los DNAs plásmidos a partir de los cuales se expresan. Los editores base de citosina inducen la conversión de nucleótidos en una ventana activa (en el caso de BE3, nucleótidos 4–8 en el extremo PAM-distal de las secuencias de destino de gRNA). El investigador debe elegir cuidadosamente las secuencias objetivo porque todas las citosinas en la ventana activa se pueden sustituir a las timinas. Además, como se describe en el Paso 5, se deben analizar cuidadosamente varias citosinas en una ventana activa para evaluar la función de las variantes BRCA1.
Uno de los pasos más importantes es la transfección en la línea celular objetivo, que afecta la frecuencia de mutación inicial para las evaluaciones funcionales BRCA1. Para mejorar la frecuencia inicial de mutación, los investigadores deben optimizar los métodos de entrega a la línea celular de interés. Como se describe en el Paso 1, la generación de líneas celulares de expresión BE3 es una opción útil para aumentar la frecuencia de mutación inicial. No recomendamos la transducción lentiviral de gRNA en las células HAP1-BE3, porque la expresión constitutiva de BE3 y gRNA podría causar la conversión de nucleótidos acumulados, y estos resultados interfieren con la evaluación funcional de las variantes BRCA1.
Además de los métodos mediados be3 introducidos en este protocolo, se recomiendan varios métodos complementarios para ampliar aún más las evaluaciones funcionales de las variantes BRCA1. En primer lugar, como se describió anteriormente, la frecuencia de mutación en la muestra inicial es importante para obtener resultados seguros de las variantes BRCA1. Para aumentar la eficiencia de edición base, se recomiendan variantes de editores base de citosina, como BE4max. En segundo lugar, el BE3 reconoce la secuencia de ADN objetivo a través de las secuencias PAM de 5'-NGG-3', que es una limitación en la generación de varios tipos de variantes BRCA1. Las variantes Cas9 recientemente desarrolladas con secuencias PAM alteradas son una opción útil en este caso para ampliar las variantes BRCA1 objetivo26,27,28. En tercer lugar, el BE3 induce una edición base sustancial en sitios no deseados y el efecto fuera de objetivo podría influir en la evaluación funcional de las variantes BRCA129,30,31. Para reducir el efecto fuera de objetivo de BE3, los sitios objetivo de los gRNAs deben elegirse cuidadosamente sin secuencias similares en el genoma. SECURE-BE3 o YE1, que se ha desarrollado para reducir la edición base no deseada en el genoma y el transcriptoma son la opción útil32,33. Forth, un método de edición del genoma de saturación (SGE) basado en HDR mediado por Cas9 también grandes opciones para el análisis funcional de las variantes BRCA119. El método no tiene ninguna limitación para seleccionar secuencias de destino y posiciones de nucleótidos de variantes BRCA1. Sin embargo, el enfoque basado en HDR es relativamente menos eficiente que los editores base y además requiere el diseño y la síntesis de las plantillas dedonantes 14. Por último, las variantes BRCA1 derivadas del paciente incluyen varias gamas de mutaciones como mutaciones puntuales, inserciones y deleciones. De ellas, las mutaciones puntuales son la población importante de variantes BRCA1, que no son solo conversión de C:G a T:A, sino también de A:T a G:C, C:G a G:C y conversiones de A:T a T:A. A las evaluaciones funcionales de este tipo de conversiones, los editores base de adenosina mediados por CRISPR y los Editores Prime son valiosasopciones 34,35. El rápido desarrollo de tecnologías de ingeniería del genoma permitirá evaluaciones funcionales de variantes BRCA1 más diversas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (subvenciones 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637, y 2018R1A5A2020732 a Y.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | NEB | R3136 | Restriction enzyme |
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | Drug for selecting transduced cells |
| BsaI | NEB | R0535 | Restriction enzyme |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | Genomic DNA prep. kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965092 | Medium for HEK293T/17 cells |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000036 | Supplemetal for cell culture |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | Gibson assembly kit |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Gibco | 12440046 | Medium for HAP1 cells |
| lentiCas9-Blast | Addgene | 52962 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection materials |
| pCMV-BE3 | Addgene | 73021 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | Supplemetal for cell culture |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530SQ | High-fidelity polymerase |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Plasmids DNA for virus prep. |
| pRG2 | Addgene | 104174 | gRNA cloning vector |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmids DNA for virus prep. |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | Plasmid DNA prep. Kit |
| QIAquick Gel extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel extraction kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR product prep. kit |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | Ligase for gRNA cloning |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Materials for T7E1 assay |
| XbaI | NEB | R0145 | Restriction enzyme |
References
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