Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

التقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1 باستخدام محررات قاعدة CRISPR-بوساطة

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/61557
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

Summary

الأشخاص الذين يعانون من طفرات BRCA1 لديهم خطر أعلى للإصابة بالسرطان ، مما يستدعي تقييمًا دقيقًا لوظيفة بدائل BRCA1. هنا، وصفنا بروتوكول للتقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1 باستخدام محررات قاعدة السيتوسين بوساطة CRISPR التي تمكن من C:G إلى T: تحويل في الخلايا الحية.

Abstract

وقد بحثت الدراسات الحديثة في المخاطر المرتبطة بالطفرات الجينية BRCA1 باستخدام أساليب تقييم وظيفية مختلفة مثل مقايسات المراسل الفلورية، مقايسات الخلايا الجذعية الجنينية، ومقايسات الحساسية العلاجية المستندة إلى الأدوية. على الرغم من أنها قد أوضحت الكثير من المتغيرات BRCA1، ترتبط هذه المقايسات التي تنطوي على استخدام بدائل BRCA1 أعرب عنها خارجيا مع قضايا فرط التعبير ولا يمكن تطبيقها على ما بعد النسخ. لحل هذه القيود، أبلغنا سابقا عن طريقة للتحليل الوظيفي لمتغيرات BRCA1 عبر محرر قاعدة السيتوسين بوساطة CRISPR التي تحفز استبدال النيوكليوتيدات المستهدفة في الخلايا الحية. باستخدام هذه الطريقة، حددنا المتغيرات التي لا تزال وظائفها غامضة، بما في ذلك c.-97C> T، c.154C> T، c.3847C> T، c.5056C> T، وc.4986+5G> A، وأكد أن محررات قاعدة CRISPR بوساطة هي أدوات مفيدة لإعادة تصنيف المتغيرات ذات الأهمية غير المؤكدة في BRCA1. هنا، ونحن وصف بروتوكول للتحليل الوظيفي للمتغيرات BRCA1 باستخدام محرر قاعدة cytosine مقرها CRISPR. ويوفر هذا البروتوكول مبادئ توجيهية لاختيار المواقع المستهدفة، والتحليل الوظيفي وتقييم المتغيرات BRCA1.

Introduction

سرطان الثدي نوع 1 الجينات القابلية للحساسية(BRCA1) هو معروف على نطاق واسع الجين القامع الورم. لأن جين BRCA1 يرتبط بإصلاح تلف الحمض النووي ، فإن الطفرات في هذا الجين ستؤدي إلى خطر أكبر من تطور السرطان في الفرد1. سرطانات الثدي, المبيض, البروستاتا, وسرطان البنكرياس ترتبط بالطفرات الموروثة فقدان وظيفة (LOF) من الجين BRCA1 2. التقييم الوظيفي وتحديد المتغيرات BRCA1 قد تساعد في الوقاية من الأمراض المختلفة وتشخيصها. لمعالجة وظيفة من المتغيرات BRCA1، وقد تم تطوير عدة طرق وتستخدم على نطاق واسع للتحقيق في الإمراضية من المتغيرات BRCA1 مثل المقايسات الخلايا الجذعية الجنينية البقاء، المقايسات مراسل الفلورسنت، والعلاجية المخدرات القائمة على الحساسية المقايسات3،4،5،6. على الرغم من أن هذه الطرق قد قيمت وظيفة الكثير من المتغيرات BRCA1، والأساليب التي تنطوي على بدائل BRCA1 أعرب عنها خارجيا تشكل قيودا من حيث فرط التعبير التي قد تؤثر على تنظيم المصب، والجرعة الجينية، والبروتين للطي7. وعلاوة على ذلك ، لا يمكن تسخير هذه المقايسات لتنظيم ما بعد الوصف مثل الربط مرنا ، واستقرار نسخة ، وتأثير المنطقة غير المترجمة8،9.

CRISPR-Cas9 نظام تمكن من تحرير الجينوم المستهدفة في الخلايا الحية والكائنات الحية10. من خلال RNA دليل واحد، يمكن أن تحفز Cas9 فواصل مزدوجة حبلا (DSBs) في الحمض النووي الكروموسومات في loci الجينوم محددة من أجل تنشيط مسارين إصلاح الحمض النووي: غيرhomologous غير عرضة للخطأ نهاية الانضمام (NHEJ) مسار وإصلاح homology خالية من الأخطاء الموجهة (HDR) مسار11. تقرير التنمية البشرية هو آلية دقيقة لإصلاح; ومع ذلك، DSBs الناجمة عن نيكلياز Cas9 لHDR غالباً ما يؤدي إلى إدخال غير المرغوب فيها والحذف (indel) طفرة. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يحتاج إلى قوالب الحمض النووي المانحة متجانسة لإصلاح تلف الحمض النووي ولها كفاءة منخفضة نسبيا. في الآونة الأخيرة، وقد تم دمج Cas9 نيكاسي (nCas9) مع المجالات cytidine deaminase لاستهداف C:G إلى T:A استبدالات، دون الحاجة إلى قوالب الحمض النووي متماثل والحمض النووي كسر حبلا مزدوج12،13،14،15. باستخدام محرر قاعدة cytosine ، وضعنا طريقة جديدة للتحليل الوظيفي للبدائل BRCA116.

في هذه الدراسة، استخدمنا كريسبر بوساطة محرر قاعدة السيتوسين، BE314، مما يدفع كفاءة C:G إلى T:A الطفرات نقطة، لتنفيذ التقييم الوظيفي للمتغيرات BRCA1 وتحديد بنجاح وظائف عدة متغيرات BRCA1 (الشكل 1).

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على سير العمل للتقييم الوظيفي. (A) التخطيطي تبين التقييم الوظيفي لBRCA1. لأن LOF من BRCA1 يؤثر على صلاحية الخلية، عندما طفرة BRCA1 هو المسببة للأمراض، تموت الخلايا كما يزيد عدد مرور. (ب) مراحل التقييم الوظيفي لـ BRCA1. مربع منقط اختياري. ويمكن استبداله بtrans-transfection من GRNA التعبير عن و BE3 التعبير عن dna plasmids. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: الطريقة الأولى (إنشاء خطوط خلايا HAP1-BE3) اختيارية. بدلا من بناء خط الخلية BE3-التعبير عن, BE3 ترميز الحمض النووي البلازميد يمكن أن تكون تشارك في نقل الحمض النووي مع الحمض النووي بلازميد ترميز الحمض النووي الريبي. ويمكن أيضا أن تستخدم المتغيرات الأخرى من المحررين قاعدة السيتوسين ، مثل BE4max ، لقاعدة تحرير عالية الكفاءة.

1. توليد خطوط خلايا HAP1-BE3

  1. بناء الحمض النووي البلازميد
    1. لبناء dna plasmid العدس من أجل إنتاج فيروس العدس، تضخيم تسلسل الترميز BE3 في pCMV-BE3(جدول المواد)بواسطة PCR باستخدام البوليميراز عالية الدقة. تصميم التمهيدي PCR لاحتواء متداخلة تسلسلات من الموجه هضم (من الخطوة 1.1.2) للتجميع متساوي الحرارة على النحو التالي17:
      التمهيدي -F: 5'-TTTGCCGCCAGAACACAGACCGGACCGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCACAGA-3'،
      التمهيدي-R: 5'-CAGAGAGAAGTTTGGGCGGCGGGATCC GACTTTCCTCTTCTTTGGG-3'
      ملاحظة: يتم تداخل النوكليوتيدات الموضحة في خط مسطر مع المتجه المهضم وستكون هذه التسلسلات خاصة بالمتجه الوجهة الذي يختاره المستخدم.
    2. Digest lentiCas9-الانفجار(جدول المواد)dna plasmid مع إنزيمات القيد، XbaI و BamHI (1 وحدة لكل 1 ميكروغرام) لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. تشغيل المنتج هضم على 0.8٪ agarose هلام وتنقية النطاقات المناسبة الحجم (8.6 كيلوبايت) باستخدام مجموعة استخراج هلام التجارية(جدول المواد).
    3. استنساخ تضخيم المنتج PCR BE3 وهضم lentiCas9- الانفجار ناقلات باستخدام مجموعة التجميع isothermal(جدول المواد). استخدام ما مجموعه 0.02-0.5 pmol من شظايا الحمض النووي ونسبة 1:3 من المتجه: إدراج. تحويل منتج التجميع إلى خلايا DH5 ألفا المختصة18. إضافة المحولات على لوحة أجار التي تحتوي على أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) واحتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    4. اختيار عدة مستعمرات وتطعيمها في 4 مل من LB (مرق lysogeny) المتوسطة التي تحتوي على أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) وتنمو الثقافة في حاضنة تهتز في 180 دورة في الدقيقة.
    5. تنقية الحمض النووي plasmid باستخدام طقم تنقية الحمض النووي plasmid التجارية(جدول المواد)وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
    6. لتأكيد نجاح استنساخ الحمض النووي، وتحليل تسلسل BE3 من كل DNA plasmid تنقية (من الخطوة 1.1.5) من قبل تسلسل سانجر باستخدام التمهيديات القياسية وBE3-محددة(الجدول التكميلي 1) وحدد بالضبط المستنسخة lentiBE3-انفجار البناء.
      ملاحظة: لتحليل نتائج تسلسل السانجر، أوصينا بعدة أدوات مثل BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) وCLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
  2. خلية ثقافة وتوليد من خطوط خلايا HAP1-BE3
    1. الحفاظ على الخلايا في حالة صحية وفي حالة تقسيم بنشاط. ثقافة HAP1 الخلايا في التوسط Dulbecco في Iscove المعدلة(جدول المواد)تحتوي على 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 1٪ البنسلين / ستربتوميسين. ثقافة HEK293T/17 الخلايا في دولبيككو معدلة النسر المتوسط(جدول المواد)تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / ستربتوميسين.
      ملاحظة: خلايا HAP1 مفيدة للبحث الجيني لأنها خلايا هابلويدية تقريبا. ومع ذلك، يمكن أن تعود الخلايا تلقائياً إلى حالة diploid في خلية الثقافة. سوف إثراء Hoechst 34580 ملطخة 1ن-السكان باستخدام flowtometry تكون مفيدة لصيانة haploidy من خلايا HAP119.
    2. بذور 5 × 106 HEK293T/17 الخلايا على طبق 100 نانومتر 1 قبل يوم من نقل. في يوم transfection، ونقل الحمض النووي plasmid (15 ميكروغرام من انفجار lentiBE3، 9 ميكروغرام من psPAX2 للتعبئة والتغليف الفيروسية، و 6 ميكروغرام من pMD2.G لظرف القارورة من الجيلالثاني نظام التعبئة والتغليف العدسي) باستخدام المواد reagentction التجارية وفقا لبروتوكولات الشركةالمصنعة( جدول المواد )20. تغيير المتوسطة في 6 ح بعد transfection وحصاد الفيروس التي تحتوي على المتوسطة في 48 ح أو 72 ح بعد transfection. تصفية عظمى باستخدام مرشح 0.45 μm.
    3. تحويل جزيئات العدس من BE3 إلى خلايا HAP1 في وزارة الداخلية (تعدد العدوى) من 0.1. لضبط ل MOI المناسبة، استخدم تركيزات مخففة متسلسلة من الفيروس. إزالة المتوسطة واستبدالها مع فائقة الفيروسية المعدلة والثقافة الطازجة المتوسطة.
    4. بعد يوم واحد من عملية النقل، قم بتغيير المتوسط إلى 10 ميكروغرام/مل من البلاستيسيدين(جدول المواد)المتوسطة التي تحتوي على وتحديد الخلايا العابرة لمدة 3 أيام مع البلاستيسيدين. بعد تحديد blasticidin، حدد جيدا مع ~ 10٪ من الخلايا الباقية للخطوة التالية.
    5. بعد اختيار blasticidin، بذور الخلايا المستحثة على لوحات 96-جيدا في كثافة 0.5 الخلايا/جيدا من أجل عزل استنساخ واحد (على سبيل المثال، تمييع 50 خلية في 20 مل (0.5 الخلايا لكل 200 ميكرولتر) ثقافة متوسطة و aliquot 200 ميكرولتر في بئر في 96 لوحة جيدا). احتضان لوحات 96-جيدا لمدة 2 أسابيع واختيار المستعمرات واحدة لتأكيد النشاط BE3.
    6. تقسيم المستعمرات واحدة إلى مجموعتين، مجموعة واحدة لاختبار النشاط BE3 وغيرها للصيانة. تحويل جزيئات العدس من gRNAs إلى واحدة من مجموعات لتأكيد النشاط BE3. تحليل تردد الطفرة من كل مستعمرة باستخدام T7 endonuclease I (T7E1، جدول المواد)مقايسة أو عن طريق تنفيذ تقنية التسلسل العميق المستهدفة (الخطوة 4)21. حدد استنساخ واحد المناسبة التي هي صحية ولها BE3 نشطة للغاية.
      ملاحظة: للتحقق من صحة ترددات الطفرات الدقيقة، نوصي بالتسلسل العميق المستهدف من مقايسة T7E1. HEK2 (5'GAACACAAAGCATAGACTGCGGGGG-'3) هو موقع جيد التحقق من صحة الهدف لـ BE3.

2. تصميم وبناء BRCA1 استهداف gRNAs

Figure 2
الشكل 2: مثال على الحمض النووي الريبيRNA. (أ) لتحرير تسلسل الهدف بشكل فعال مع BE3، يلزم إنشاء NGG PAM (CCN PAM) الذي يضع الهدف C (الهدف G) ضمن نافذة خماسية من النيوكليوتيدات. يتم عرض NGG PAM باللون الأحمر ويتم تمثيل إطار التحرير الأساسي بمربع رمادي. (B)يتم الإشارة إلى تسلسل GRNA لـ c.8047C> T (H1283Y) وتحريرها الأساسي وتظهر أزواج C:G المستهدفة باللون الأحمر بينما يتم تمييز الإطار النشط بواسطة مربع رمادي. وبالنسبة لاستنساخ الحمض النووي الريبي، تضاف تسلسلات الشنق المشار إليها بالخط العريض في كلا الطرفين. تم إنشاء نماذج لـ GRNA عن طريق حني القليدين التكميليين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: عناصر التحكم الإيجابية والسلبية من متغيرات BRCA1 ضرورية. في هذه الدراسة، يتم استخدام c.5252G> A (R1751Q) وc.4527C> T (Y1509Y) كضوابط حميدة. c.191G> A (C64Y)، 81-1G> A، وc.3598C> T (Q1200*) تستخدم كضوابط مسببة للأمراض. التسلسلات المستهدفة لكل رنا مرّة مدرجة في الجدول التكميلي 1.

  1. الحصول على تسلسل الجينوم BRCA1 من جينبانك في NCBI22.
  2. ابحث في المواقع المستهدفة 20-bp مع تسلسل Protospacer المجاورة عزر (PAM) "NGG" و "CCN" حول طفرة من الفائدة. وينبغي أن يكون موجودا في طفرة الفائدة في 4-8 النيوكليوتيدات في نهاية PAM-شطة من تسلسل الهدف GRNA بسبب النافذة النشطة من BE3 هو 4-8 النيوكليوتيدات في نهاية PAM-شطة من تسلسل الهدف GRNA14. في حالة c.8047C> T (H1283Y)- وc.5252G> A (R1751Q) استهداف gRNAs، 5-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3 و 5-CCA-CCAGGTCCAAAGCGAGCAA-3 3، التسلسل في جريئة هي النوافذ النشطة. C إلى T وG إلى A تحدث التحويلات مع NGG و CCN PAM ، على التوالي (الشكل 2A).
    ملاحظة: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 هو أدوات مفيدة على شبكة الإنترنت لتصميم GRNA.
  3. طلب اثنين من أوليغونوكليوتيدات تكميلية لكل رنا؛ بالنسبة إلى oligonucleotides إلى الأمام، أضف "CACCG" إلى النهاية 5 من تسلسل الدليل، وبالنسبة لـ oligonucleotides العكسي، أضف "AAAC" إلى نهاية 5 و "C" إلى نهاية 3. هذه التسلسلات الإضافية خاصة بمتجه تعبير GRNA الوجهة (من الخطوة 2.5) المستخدمة لهذا البروتوكول، وينبغي تعديل المستخدمين لناقلات التعبير GRNA بديلة(الشكل 2B).
  4. Resuspend oligonucleotide في الماء المقطر في تركيز نهائي من 100 μM. مزيج اثنين من oligonucleotides التكميلية إلى تركيز نهائي من 10 μM مع T4 الربط العازلة(جدول المواد)وتسخينها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتبريدها في درجة حرارة الغرفة للحن.
  5. هضم pRG2 باستخدام إنزيم القيد، BsaI (1 وحدة لكل 1 ميكروغرام) ل 1 ساعة عند 37 درجة مئوية(جدول المواد). تشغيل المنتج هضم على 1٪ agarose هلام وتنقية الفرقة المناسبة الحجم (2.5 كيلو بايت).
    ملاحظة: بدلاً من استخدام أسلوب الهضم واللتصاج الكلاسيكي، يمكن استخدام أسلوب استنساخ أخرى مثل استنساخ البوابة الذهبية.
  6. Ligate oligonucleotide الدوبلوج إلى الحمض النووي ناقلات باستخدام الحمض النووي التي تم شراؤها ligase(جدول المواد)وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وتحويلها إلى DH5 ألفا المختصة الخلايا (غيرها من سلالات القولونية E. التي تستخدم على نطاق واسع لscloning subcloning أيضا يمكن استخدامها).
  7. إضافة المحولات إلى لوحة أغار التي تحتوي على أمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) واحتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. تنقية plasmid الحمض النووي من عدة محولات وتحليل تسلسلها GRNA من قبل تسلسل سانجر باستخدام التمهيدي الذي رئيس في U6 المروج (جدول المواد).

3. إنشاء بدائل BRCA1 باستخدام أدوات تحرير قاعدة CRISPR بوساطة

ملاحظة: إذا لم يتم استخدام خطوط خلايا HAP1-BE3، يمكن أن يكون CO-transsmid ترميز الحمض النووي BE3 -1 مع BRCA1-استهداف GRNA. بالمقارنة مع co-transfection من BE3 وGRNA plasmids، transfection من plasmid GRNA إلى خلايا HAP-BE3 تحفز كفاءة تحرير قاعدة تصل إلى 3 أضعاف في مكان الهدف في أيدينا.

  1. البذور 5 × 105 HAP1 - BE3 الخلايا (أو خلايا HAP1 في حالة أساليب co-transfection) في بئر في 24-جيدا لوحات 1 يوم قبل transfection. في وقت transfection ، والخلايا الثقافة للوصول إلى كثافة مناسبة (التقاء 70 ٪-80٪).
  2. Transfect BRCA1-استهداف gRNAs باستخدام الكواشف transfection شراؤها (جدول المواد) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدام 1 ميكروغرام من BRCA1-استهداف gRNAs (مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد BE3-ترميز في حالة أساليب النقل المشترك) للحث C:G إلى T: تحويل في المواقع المستهدفة BRCA1. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية والثقافة الفرعية كل 3-4 أيام.
  3. حصاد الكريات الخلية 3 و 10 و 24 يوما بعد transfection لتحليل كفاءة تحرير قاعدة (عينات من 3 أيام بعد transfection يتم تحليلها regrading كما عينات اليوم 0).
  4. استخراج الحمض النووي الجينوم باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومية(جدول المواد).
    ملاحظة: نوصي بتحسين ظروف النقل مع نسبة متغيرة من الكاشف إلى الحمض النووي. الحالة المثلى لTRANS1 هو 4:1 حصة من الكاشف إلى الحمض النووي في أيدينا.

4. إعداد العينة لتسلسل الجيل التالي من إيلومينا (NGS)

Figure 3
الشكل 3: التحضير لتسلسل الجيل التالي. تم تصميم التمهيديPCR 1 لتضخيم الموقع المستهدف BRCA1 على الحمض النووي الجينومي. تم تصميم التمهيديPCR nd 2 بحيث تقع تسلسله داخل أكثر من تسلسل التمهيدي PCR 1st. تمت إضافة تسلسلات إضافية تظهر كشريط أصفر على طرفي التمهيدي الثاني PCR لإرفاق التسلسلات الأساسية لتنفيذ تسلسل الجيل التالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تصميم التمهيديات 1ST PCR لتضخيم مواقع BRCA1 المستهدفة. على الرغم من عدم وجود قيود على حجم المنتج 1ST PCR، من المستحسن حجم المنتج من <1 كيلوبايت لتضخيم بكفاءة منطقة معينة(الشكل 3).
  2. تصميم2 PCR التمهيدية التي تقع داخل المنتج PCR 1st. النظر في حجم amplicon وفقا لNGS طول القراءة (على سبيل المثال، يجب أن يكون حجم المنتج amplicon أصغر من 300 bp لمدة 2 × 150 bp الزوجية نهاية تشغيل لدمج كل يقرأ). من أجل إرفاق تسلسلات أساسية لتحليل NGS، إضافة تسلسلات إضافية إلى 5' نهاية التمهيديات2 PCR على النحو التالي: ل التمهيديات إلى الأمام، إضافة 5'-ACACTCTTTCACACACGACGCTCCCGATCT-3' تسلسل إلى 5'، وبالنسبة لل التمهيديات العكسية، إضافة 5'-GTGACTGAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTGTGCCTTCTTCCG ATCT-3'تسلسل إلى نهاية 5'
    ملاحظة: استخدمنا PCR متداخلة لتقليل amplicon من الربط غير محددة عن طريق منع التمهيديات من إرفاق تسلسل غير الهدف.
  3. تضخيم المواقع المستهدفة BRCA1 على الحمض النووي الجينومي التي تم الحصول عليها من ثلاث نقاط زمنية. استخدام البوليميراز عالية الدقة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للتقليل من أخطاء PCR. بالنسبة لتفاعل PCR1st، استخدم 100 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي للتضخيم على مدى 15 دورة. بالنسبة لتفاعل PCRالثاني، استخدم 1 ميكرولتر من منتج PCR1 لتضخيمه على مدى 20 دورة. تشغيل 5 ميكرولتر من المنتج2 PCR nd على 2٪ agarose هلام وتأكيد حجم.
  4. من أجل إرفاق تسلسلات أساسية لتحليل NGS، تضخيم المنتج2 PCR nd باستخدام التمهيديات المذكورة أدناه. بالنسبة لتفاعل البوليميراز المتعدد الكلور، يتم استخدام 1 ميكرولتر من منتج PCRالثاني للتضخيم حتى 30 دورة باستخدام البوليميراز عالي الدقة.
    1. لتنفيذ تسلسل تعددي لأعداد كبيرة من المكتبات التي سيتم تجميعها وتسلسلها في وقت واحد، استخدم إلى الأمام (D501 – D508) وعكس (D701 – D712) التمهيدية، التي لها تسلسل فهرس فريد(الجدول التكميلي 1). تضخيم كل عينة باستخدام مجموعات التمهيدي مختلفة لإجراء استراتيجية الفهرسة المزدوجة فريدة من نوعها.
    2. تشغيل 5 ميكرولتر من المنتج PCR على 2٪ agarose هلام لتأكيد حجم، وتنقية amplicon باستخدام PCR التجارية تنظيف عدة (جدول المواد). اخلط كل عينة بكميات متساوية لإنشاء مكتبة NGS.
  5. كمي مكتبة NGS في الطول الموجي 260 نانومتر باستخدام الطيف الضوئي وتمييع مكتبة NGS لتركيز 1 nM باستخدام عازلة resuspension أو 10 mM تريس HCl، درجة ح H 8.5. إعداد 100 ميكرولتر من المكتبة المخففة لتركيز التحميل المناسب اعتمادا على أنواع المكتبة (على سبيل المثال، إعداد 200 pM من المكتبة لـ Nextera DNA Flex).
    1. كتحكم، والجمع بين phiX مع العينة المخففة المناسبة لنوع من عدة.
    2. قم بتحميل المكتبة على الكارتريدج و قم بتشغيل NGS وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. Illumina iSeq 100 أو نظم مسيك يمكن تسلسل amplicons من طول مختلف يصل إلى 300 BP لقراءة واحدة أو الاقتران نهاية. أوصينا أكثر من 10،000 يقرأ لكل أمبيركون الهدف لتحليل متعمق لكفاءة تحرير قاعدة.

5. تحليل كفاءة التحرير الأساسي للتقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1

  1. تحليل كفاءة التحرير الأساسي باستخدام MAUND24. يتم حساب كفاءة التحرير الأساسي كما هو موضح أدناه.
    Equation 1
    إذا كانت السيتوسينات متعددة موجودة في إطار BE3 النشطة، فقط تحويل C إلى T التي تستهدف لتقييم البديل BRCA1 يعتبر. على سبيل المثال، إذا كانت تسلسلات إطار BE3 النشطة هي "C4A5T6C7T8،" التسلسلات المحتملة التي تم إنشاؤها بواسطة تحرير القاعدة هي "T4A5T6C7T8" ، "C4A5T 6 T7T8" ، و "T4A5T6T7T8". في هذا الوقت، إذا كان الموقف 4 هو الموضع المستهدف لـ BRCA1 المتغير المطلوب، ثم فقط "T4A5T6C7T8" يعتبر تسلسل لحساب كفاءة التحرير الأساسي.
    ملاحظة: نوصي أيضا أدوات ويب أخرى لتحليل نشاط تحرير قاعدة مثل CRISPResso225، و BE-محلل23.
  2. تحقق من النتائج باستخدام عناصر التحكم الإيجابية والسلبية لمتغيرات BRCA1. وينبغي أن تظل كفاءة التحرير الأساسي للرقابة الحميدة كما هي، في حين أن كفاءة الرقابة المسببة للأمراض ينبغي أن تنخفض بمرور الوقت.
  3. حساب كفاءة التحرير الأساسي النسبي لمتغيرات BRCA1 وتحديد إمراضيتها. يتم تحليل الاختلافات الهامة بين يوم 0 و 21 عينات التحليل الإحصائي المناسب مثل t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تمكن النهج التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول من التقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1 الذاتية التي تم إنشاؤها بواسطة محررات قاعدة السيتوسين المستندة إلى CRISPR. لتحديد خطوط الخلايا المناسبة للتقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1 ، يجب على الباحثين التأكد من أن BRCA1 هو جين أساسي في خطوط الخلايا المستهدفة. على سبيل المثال، نحن أول كاس 9 المصابة وgRNAs في خطوط خلايا HAP1 لتعطيل BRCA1 وتحليل ترددات الطفرات من خلال التسلسل العميق المستهدفة. وجدنا أن ترددات الطفرات انخفضت بشكل ملحوظ مع مرور الوقت في خطوط خلايا HAP1(الشكل 4A). وأظهرت هذه النتائج أن BRCA1 هو الجين الأساسي لصلاحية الخلية في خطوط خلايا HAP1. للتحقيق فيما إذا كان C:G إلى T: A المتغيرات البديلة تؤثر على وظيفة BRCA1، تم نقل الحمض النووي plasmids gRNAs ، والتي يمكن أن تحفز كل طفرة ، إلى خطوط خلايا HAP1-BE3 وتم تحليل ترددات الاستبدال. وانخفضت ترددات الاستبدال النسبية لـ c.3598C> T (p. Q1200*)، وهو متغير مسبب للأمراض، انخفاضاً كبيراً، في حين أن ترددات c.4527C> T (p.Y1509Y)، وهو متغير حميد، ظلت متشابهة مع مرور الوقت(الشكل 4B). في قاعدة بيانات كلينفار، تم الإبلاغ عن c.154C> T (p. L52F) وc.3847C> T (p.H1283Y) وc.5056C> T (p.H1686Y) من BRCA1 على أنها متغيرات ذات أهمية غير مؤكدة. قمنا بتحليل وظيفة هذه المتغيرات باستخدام الطرق المذكورة أعلاه ووجدنا أن ترددات استبدال النيوكليوتيدات لهذه المتغيرات الثلاثة انخفضت بطريقة تعتمد على الوقت (الشكل 4B). من هذه النتائج، غيرت الاستبدالات الثلاثة وظيفة BRCA1 ويمكن تصنيفها على أنها طفرات مسببة للأمراض.

Figure 4
الشكل 4: النتائج التمثيلية للدراسة الوظيفية لـ BRCA1 باستخدام أنظمة CRISPR-Cas9. (A)اضطراب BRCA1 يؤثر على صلاحية الخلية. تم نقل خلايا HAP1 مع ترميز بلازميد spCas9 واثنين من gRNAs استهداف BRCA1، على التوالي ، وتم تنفيذ التسلسل العميق المستهدف لتحليل جدوى الخلية. وانخفضت ترددات الطفرات من BRCA1 بطريقة تعتمد على الوقت في الخلايا التي تُصاب باثنين من الـ gRNAs المستقلين، وظلت ترددات الطفرات في CCR5، التي كانت تستخدم كتحكم سلبي، كما هي مع مرور الوقت. (ب)التقييمات الوظيفية لخمسة متغيرات من طراز BRCA1. وقد تم إصابة خلايا HAP1-BE3 بطفرات الـ GRNAs المسببة لطفرات BRCA1 على التوالي، وتم إجراء تسلسل عميق مستهدف لتحليل صلاحية الخلية. وانخفضت ترددات الاستبدال النسبية بطريقة تعتمد على الزمن في خلايا c.3598C> T، c.154C> T، c.3847C> T، وc.5056C> T وc.4527C> T ظلت على حالها. تظهر أشرطة الخطأ الخطأ القياسي في الوسط. تشير العلامات النجمية إلى قيم P مختلفة: * P<0.05; ** P<0.005., n.s: غير مهم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة للتقييمات الوظيفية لمتغيرات BRCA1 باستخدام محرر قاعدة السيتوسين المتأملة CRISPR. ويصف البروتوكول أساليب تصميم الـ gRNAs عند موضع الهدف وبناء الـ DNAs البلازميد التي يتم التعبير عنها منها. المحررات قاعدة Cytosine حث تحويل النيوكليوتيدات في نافذة نشطة (في حالة BE3, النوكليوتيدات 4-8 في نهاية PAM-distal من تسلسل الهدف GRNA). يجب على الباحث اختيار بعناية تسلسل الهدف لأن جميع السيتوسينات في النافذة النشطة يمكن أن تحل محلها thymines. وعلاوة على ذلك، كما هو موضح في الخطوة 5، ينبغي تحليل السيتوسينات المتعددة في نافذة نشطة بعناية لتقييم وظيفة المتغيرات BRCA1.

واحدة من أهم الخطوات هي عملية نقل الدم في خط الخلية المستهدفة، مما يؤثر على تردد الطفرة الأولية للتقييمات الوظيفية BRCA1. لتحسين وتيرة الطفرة الأولية ، يجب على الباحثين تحسين طرق التسليم إلى خط الخلية من الفائدة. كما هو موضح في الخطوة 1، فإن توليد خطوط الخلية التي تعبر عن BE3 هو خيار مفيد لزيادة تكرار الطفرة الأولية. نحن لا نوصي تحويل العدسي الفيروسي من الجيش الملكي النيبالي في خلايا HAP1-BE3، لأن التعبير التأسيسي لـ BE3 و GRNA يمكن أن يسبب تحويل النيوكليوتيدات المتراكمة، وتتداخل هذه النتائج مع التقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1.

وبالإضافة إلى الأساليب التي تم إدخالها في هذا البروتوكول بواسطة BE3، يوصى بعدة طرق تكميلية لزيادة توسيع التقييمات الوظيفية لمتغيرات BRCA1. أولاً، وكما هو موضح أعلاه، فإن تكرار الطفرة في العينة الأولية مهم من أجل الحصول على نتائج واثقة من متغيرات BRCA1. لزيادة كفاءة التحرير الأساسي، يوصى باستخدام أنواع مختلفة من برامج تحرير قاعدة السيتوسين، مثل BE4max. ثانياً، إنّ نظام BE3 يتعرف على تسلسل الحمض النووي المستهدف من خلال تسلسل PAM 5'-NGG-3، وهو قيد في توليد أنواع مختلفة من متغيرات BRCA1. تم تطويرها مؤخرا Cas9 المتغيرات مع تغيير تسلسل PAM هي خيار مفيد في هذه الحالة لتوسيع قابلة لاستهداف BRCA1 المتغيرات26,27,28. ثالثا ، و BE3 يدفع تحرير قاعدة كبيرة في المواقع غير المرغوب فيها وتأثير خارج الهدف يمكن أن تؤثر على التقييم الوظيفي للبدائل BRCA129،30،31. ولتقليل الأثر غير المستهدف لـ BE3، ينبغي اختيار المواقع المستهدفة من الـ gRNAs بعناية دون أي تسلسلات مماثلة في الجينوم. SECURE-BE3 أو YE1، والتي وضعت للحد من تحرير قاعدة غير المرغوب فيها في الجينوم و النسخ هي الخيار المفيد32،33. جيئة وذهابا ، وتشبع تحرير الجينوم (SGE) طريقة تستند إلى Cas9 بوساطة HDR أيضا خيارات كبيرة للتحليل الوظيفي للبدائل BRCA119. لا يوجد قيد على الطريقة لتحديد تسلسلات الهدف و مواضع النوكليوتيدات لمتغيرات BRCA1. غير أن النهج القائم على تقرير التنمية البشرية أقل كفاءة نسبيا من المحررين الأساسيين، كما أنه يتطلب تصميم وتوليف نماذج المانحين14. وأخيراً، تتضمن متغيرات BRCA1 المشتقة من المريض مجموعة مختلفة من الطفرات مثل طفرات النقطة، والإدراجات، والحذف. من هذه الطفرات نقطة هي السكان الرئيسيين من BRCA1 المتغيرات، والتي ليست فقط C:G إلى T:A التحويل، ولكن أيضا A:T إلى G:C، C:G إلى G:C، و A:T إلى T:A التحويلات. إلى التقييمات الوظيفية لهذه الأنواع من التحويلات، CRISPR بوساطة adenosine قاعدة المحررين والمحررين هي قيمةخيارات 34،35. وستمكن تكنولوجيات هندسة الجينوم السريعة التطور من إجراء تقييمات وظيفية لمتغيرات BRCA1 الأكثر تنوعا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (المنح 2017M3A9B4062419، 2019R1F1A1057637، و 2018R1A5A2020732 إلى Y.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI NEB R3136 Restriction enzyme
Blasticidin Thermo Fisher Scientific A1113903 Drug for selecting transduced cells
BsaI NEB R0535 Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504 Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco 11965092 Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum Gibco 16000036 Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium Gibco 12440046 Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast Addgene 52962 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027 Transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985070 Transfection materials
pCMV-BE3 Addgene 73021 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140 Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530SQ High-fidelity polymerase
pMD2.G Addgene 12259 Plasmids DNA for virus prep.
pRG2 Addgene 104174 gRNA cloning vector
psPAX2 Addgene 12260 Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit Qiagen 28704 Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit NEB M2200 Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I NEB M0302 Materials for T7E1 assay
XbaI NEB R0145 Restriction enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  2. Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).
  3. Millot, G. A., et al. A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance. Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).
  4. Santos, C., et al. Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).
  5. Starita, L. M., et al. A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function. American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).
  6. Anantha, R. W., et al. Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance. Elife. 6, (2017).
  7. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  8. Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs. Frontiers in Genetics. 6, 242 (2015).
  9. Saunus, J. M., et al. Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR. Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).
  10. Knott1, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361, 866-869 (2018).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Hess, G. T., et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).
  13. Kim, K., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).
  14. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  15. Park, D. S., et al. Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos. Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).
  16. Kweon, J., et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).
  17. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  19. Findlay, G. M., et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).
  20. Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries. PLoS One. 13 (6), 0199473 (2018).
  21. Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).
  22. Sayers, E. W., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).
  23. Hwang, G. H., et al. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 19 (1), 542 (2018).
  24. Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).
  25. Clement, K., et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).
  26. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  27. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  28. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. , (2020).
  29. Kim, D., et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).
  30. Zuo, E., et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364 (6437), 289-292 (2019).
  31. Jin, S., et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 364 (6437), 292-295 (2019).
  32. Grunewald, J., et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).
  33. Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).
  34. Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
  35. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 168، CRISPR-Cas، تحرير قاعدة، BE3، BRCA1، التقييم الوظيفي، هندسة الجينوم
التقييم الوظيفي لمتغيرات <em>BRCA1</em> باستخدام محررات قاعدة CRISPR-بوساطة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

See, J. E., Shin, H. R., Jang, G.,… More

See, J. E., Shin, H. R., Jang, G., Kweon, J., Kim, Y. Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors. J. Vis. Exp. (168), e61557, doi:10.3791/61557 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter