Summary
BRCA1突然変異を有する人々は、BRCA1変異体の機能の正確な評価を保証する癌を発症するリスクが高い。本明細書において、生細胞における標的C:GからT:A変換を可能にするCRISPR媒介シトシンベースエディタを用いたBRCA1変異体の機能評価用プロトコルについて説明した。
Abstract
最近の研究では、蛍光レポーターアッセイ、胚性幹細胞生存アッセイ、治療用薬物ベースの感受性アッセイなどの様々な機能評価方法を用いて 、BRCA1 遺伝子変異に関連するリスクを調査しています。彼らは多くの BRCA1 変異体を明らかにしているが、外因的に発現した BRCA1 変異体の使用を含むこれらのアッセイは過剰発現の問題に関連しており、転写後の調節には適用できない。これらの制限を解決するために、我々は以前、生細胞における標的ヌクレオチド置換を誘導するCRISPR媒介シトシン塩基エディタを介して BRCA1 変異体の機能分析方法を報告した。この方法を使用して、c.-97C>T、c.154C>T、c.3847C>T、c.5056C>T、c.4986+5G>Aなど、関数があいまいなままのバリアントを特定し、CRISPRメディア化された基本エディタが BR1の不確定な変異体の再分類に役立つことを確認しました。ここでは、CRISPRベースのシトシンベースエディタを用いた BRCA1 変異体の機能解析用プロトコルについて説明する。このプロトコルは、ターゲット・サイトの選択、機能分析、 および BRCA1 バリアントの評価に関するガイドラインを提供します。
Introduction
乳癌タイプ1感受性遺伝子(BRCA1)は、広く知られている腫瘍抑制遺伝子である。BRCA1遺伝子はDNA損傷の修復に関連しているため、この遺伝子の変異は、個体1における癌発症のリスクが高くなる。乳癌、卵巣癌、前立腺癌、および膵臓癌はBRCA1遺伝子2の遺伝性機能喪失(LOF)突然変異に関連している。BRCA1変異体の機能評価および同定は、様々な疾患の予防および診断に役立つ可能性がある。BRCA1変異体の機能に対処するために、胚性幹細胞生存アッセイ、蛍光レポーターアッセイ、および治療用薬物ベースの感受性アッセイ3、4、5、6などのBRCA1変異体の病原性を調査するために、いくつかの方法が開発され、広く使用されている。これらの方法は多くのBRCA1変異体の機能を評価しているが、外因的に発現したBRCA1変異体を含む方法は、下流の調節、遺伝子投与量、およびタンパク質折りたたみ7に影響を及ぼす可能性のある過剰発現の点で制限をもたらす。さらに、これらのアッセイは、mRNAスプライシング、転写安定性、および非翻訳領域8,9の効果などの転写後の調節に利用することができない。
CRISPR-Cas9システムは、生きている細胞および生物10における標的ゲノム編集を可能にする。単一ガイドRNAを介して、Cas9は、エラーが起こりやすい非相同性末端結合(NHEJ)経路およびエラーを起こしやすい相同性指向修復(HDR)経路11の2つのDNA修復経路を活性化するために、特定のゲノム遺伝子座で染色体DNA中の二本鎖切断(DSB)を誘導することができる。HDR は、正確な修復メカニズムです。しかし、HDRのCas9ヌクレアーゼによって誘導されたDSBは、しばしば望ましくない挿入および欠失(indel)突然変異をもたらす。さらに、DNA損傷を修復するための相同なドナーDNAテンプレートが必要であり、効率が比較的低い。最近、Cas9ニッカーゼ(nCas9)は、C:GからT:Aの置換を標的とするシチジンデアミネーゼドメインと融合しており、相同なDNAテンプレートおよびDNA二重鎖破断12、13、14、15を必要としない。シトシンベースエディタを用いて、BRCA1バリアント16の機能解析のための新しい方法を開発しました。
本研究では、BRCA1変異体の機能評価を実施するために、効率的なC:GからT:A点突然変異を誘導するCRISPR媒介シトシンベースエディタBE314を用いて、いくつかのBRCA1変異体の機能を同定することに成功した(図1)。
図 1: 機能評価のワークフローの概要(A) BRCA1の機能評価を示す回路図。 BRCA1 のLOFは細胞の生存率に影響を与えるので 、BRCA1 突然変異が病原性である場合、細胞は通過数が増加するにつれて死ぬ。(B) BRCA1の機能評価の段階 。ドット ボックスはオプションです。それは、プラスミドDNAを発現するgRNAとBE3の共トランスフェクションに置き換えることができる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
注: 方法 1 (HAP1-BE3 セルラインの生成) はオプションです。BE3発現細胞株を構築する代わりに、BE3コード系プラスミドDNAをgRNAコードプラスミドDNAと共にトランスフェクトすることができる。BE4max のようなシトシンベースエディタの他のバリアントも、高効率なベース編集に使用できます。
1. HAP1-BE3細胞株の生成
- プラスミドDNAの構築
- レンチウイルス産生用レンチベ3ブラストプラスミドDNAを構築するために、高忠実度ポリメラーゼを用いたPCRによりpCMV-BE3(材料表)でBE3コード配列を増幅する。次のように、等熱アセンブリの(ステップ1.1.2から)消化されたベクターの重複する配列を含むPCRプライマーを設計します。
プライマー F: 5'-TTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTCTAGA GCCGCCACCACCACCGAGッカガッカガグ-3',
プライマー-R: 5'- カラガGTTGtTTTGCGGGATCCCCGCCCCCCCCCCCCCCCCCGCCCGCCCGCCCGCTTCCTCTTCTTGGG-3'
注:下線付きのヌクレオチドは、消化されたベクターと重なり、これらの配列は、ユーザーが選択した宛先ベクトルに固有になります。 - 制限酵素を用いたプラスミドDNAをダイジェストlentiCas9ブラスト(材料表)、XbaIおよびBamHI(1μgあたり1単位)37°Cで1時間用いた。 0.8%アガロースゲルで消化された製品を実行し、市販のゲル抽出キット(材料表)を使用して適切なサイズのバンド(8.6 kb)を精製します。
- 等熱アセンブリキット(材料表)を使用して、増幅されたBE3 PCR産物と消化されたlentiCas9-Blastベクターをクローン化します。合計で0.02-0.5 pmolのDNA断片とベクターの1:3比を使用してください:insert.アセンブリ製品をDH5アルファコンピテントセル18に変換します。アンピシリン(100 μg/mL)を含む寒天プレートに形質転換体を加え、37°Cで一晩インキュベートします。
- いくつかのコロニーを選び、アンピシリン(100 μg/mL)を含むLB(リソジニーブロス)培地の4mLでそれらを接種し、180 rpmで振る培養器で培養を成長させます。
- メーカーのプロトコルに従って、市販のプラスミドDNA精製キット(材料表)を使用してプラスミドDNAを精製します。
- DNAクローニングの成功を確認するには、標準およびBE3特異的プライマー(補足表1)を用いたサンガーシーケンシング(補足表1)を用いて、精製されたプラスミドDNAのBE3配列(ステップ1.1.5から)を解析し、正確なクローンレンティBE3-ブラスト構築物を選択します。
注: サンガーシーケンスの結果を分析するには、BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) や CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) などのツールを推奨します。
- レンチウイルス産生用レンチベ3ブラストプラスミドDNAを構築するために、高忠実度ポリメラーゼを用いたPCRによりpCMV-BE3(材料表)でBE3コード配列を増幅する。次のように、等熱アセンブリの(ステップ1.1.2から)消化されたベクターの重複する配列を含むPCRプライマーを設計します。
- HAP1-BE3細胞株の細胞培養および生成
- 健康な状態で、積極的に分割状態で細胞を維持します。イスコベの修飾されたダルベッコの培地中のHAP1細胞は、10%のウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む。10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコの修飾イーグル培地(材料表)の培養HEK293T/17細胞。
注:HAP1細胞は、ほぼハプロイド細胞であるため、遺伝子研究に有用である。しかし、細胞は細胞培養において自発的に二分状態に戻ることができる。濃縮Hoechst 34580染色1n-フローサイトメトリーを使用した集団は、HAP1細胞19のハプロイディの維持に有用である。 - 種子5 x 106 HEK293T/17細胞をトランスフェクションの1日前の100 nm皿に置く。トランスフェクションの日に、プラスミドDNA(15μgのLentiBE3-blast、9 μgのpsPAX2、ウイルス包装用psMD2.G、第2 世代レンチウイルス包装システムのバイアルエンベロープ用6μg)を、製造業者のプロトコル(材料表)に従った市販トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクションします。トランスフェクション後6時間で培地を交換し、トランスフェクション後48時間または72時間でウイルス含有培地を収穫する。0.45 μmフィルターを使用して上清をフィルターします。
- 0.1のMOI(感染の多重度)でBE3のレンチウイルス粒子をHAP1細胞にトランスデュースする。適切なMOIを調整するには、ウイルスの連続希釈濃度を使用します。培地を取り出し、調整されたウイルス上清および新鮮な培養培地に置き換えます。
- トランスダクションの翌日、培地をブラストシジン(材料表)含有培地10μg/mLに変更し、トランスデューセド細胞をブラストシジンで3日間選択します。ブラストシジジンを選択した後、次のステップのために生存細胞の〜10%のウェルを選択します。
- ブラストシジン選択後、トランスデューシングされた細胞を0.5細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種し、単一クローンを単一のクローン(例えば、20mL(200 μLあたり0.5細胞あたり0.5細胞)培地およびアリコット200μLで培養液に50個の細胞を希釈する。96ウェルプレートを2週間インキュベートし、単一のコロニーを選んでBE3活性を確認します。
- 単一のコロニーを2つのセットに分割し、1つはBE3活動をテストするためのセットとメンテナンス用の他のセットに分けます。gRNAのレンチウイルス粒子をセットの1つにトランスデュースし、BE3活性を確認する。T7エンドヌクレアーゼI(T7E1、材料表)アッセイを用いて、または標的深いシーケンシング技術を実施して各コロニーの突然変異頻度を解析する(ステップ4)21。正常で、高活性の BE3 を持つ適切な単一クローンを選択します。
注: 正確な突然変異周波数を検証するために、T7E1アッセイよりもターゲットの深いシーケンシングをお勧めします。HEK2(5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGG-'3)は、BE3のターゲットサイトを十分に検証しています。
- 健康な状態で、積極的に分割状態で細胞を維持します。イスコベの修飾されたダルベッコの培地中のHAP1細胞は、10%のウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む。10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコの修飾イーグル培地(材料表)の培養HEK293T/17細胞。
2. GRNAを対象とする BRCA1 の設計と構築
図2:gRNAプラスミドDNAの例を示す。(A)BE3で標的配列を効果的に編集するためには、標的C(標的G)を5ヌクレオチドウィンドウ内に配置するNGG PAM(CCN PAM)が必要である。NGG PAM は赤で表示され、ベース編集ウィンドウは灰色のボックスで表示されます。(B) c.8047C>T (H1283Y) ベース編集の gRNA シーケンスが示され、ターゲット C:G ペアが赤で表示され、アクティブウィンドウがグレーのボックスで強調表示されます。gRNAクローニングの場合、太字で示されたオーバーハング配列は、5ʹ両端に追加されます。gRNA用のテンプレートは、2つの相補オリゴヌクレオチドをアニールすることによって生成した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
注: BRCA1 バリアントの正と負の制御は必須です。この研究では、c.5252G>A (R1751Q) および c.4527C>T (Y1509Y) が良性コントロールとして使用されています。c.191G>A(C64Y)、81-1G>A、およびc.3598C>T(Q1200*)は病原性コントロールとして使用されます。各gRNAの標的配列は 補足表1に記載されている。
- NCBI22のGenBankからBRCA1ゲノム配列を取得します。
- 目的の突然変異の周りにプロトスペース隣接モチーフ(PAM)配列「NGG」と「CCN」を用いて20-bp標的部位を検索します。対象の変異は、gRNA標的配列のPAM遠位末端に4〜8ヌクレオチドを配置すべきである。c.8047C>T(H1283Y)-およびc.5252G>A(R1751Q)ターゲティングgRNA、5ʹ-TCAGGAACATCACCTTAGG-AGG-3ʹおよび5ʹ-CCA-CCAAGGTCCAAGCGAG-3ʹの場合、太字のウィンドウでのシーケンスはアクティブです。C から T への変換と G から A への変換は、それぞれ NGG および CCN PAM で発生します (図 2A)。
注: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 は、gRNA 設計に役立つ Web ベースのツールです。 - gRNAあたり2つの相補オリゴヌクレオチドをオーダーする。フォワードオリゴヌクレオチドの場合、ガイド配列の5ʹ端に「CACCG」を加え、逆オリゴヌクレオチドの場合は、5'の端に「AAAC」、3'末端に「C」を加えます。これらの追加配列は、このプロトコルに使用される宛先gRNA発現ベクター(ステップ2.5から)に特異的であり、ユーザは代替gRNA発現ベクター用に調整されるべきである(図2B)。
- 蒸留水中のオリゴヌクレオチドを100μMの最終濃度で再懸濁し、2つの相補オリゴヌクレオチドをT4ライゲーションバッファー(材料表)で最終濃度10μMに混合し、95°Cで5分間加熱し、室温で冷却してアニーリングします。
- 制限酵素を用いた消化pRG2、BsaI(1μgあたり1単位)を37°Cで1時間(材料表)で1時間使用する。1%アガロースゲルで消化された製品を実行し、適切なサイズのバンド(2.5 kb)を精製します。
注:古典的な消化およびライゲーション法を使用する代わりに、ゴールデンゲートクローニングなどの他のクローニング方法を使用することができます。 - 製造者のプロトコルに従って購入したDNAリガーゼ(材料表)を用いてアニールオリゴヌクレオチド二重鎖をベクターDNAにリゲートし、それらをDH5αコンピテント細胞に変換する(その他の大腸菌株も使用できる)。
- アンピシリン(100 μg/mL)を含む寒天プレートに形質転換体を加え、37°Cで一晩インキュベートします。 いくつかの形質転換体からプラスミドDNAを精製し、U6プロモーターでプライムするプライマーを使用してサンガーシーケンシングによってgRNA配列を分析する(材料表)。
3. CRISPR媒介ベース編集ツールを用いた BRCA1 バリアントの作成
注: HAP1-BE3細胞株を使用しない場合、BE3コードプラスミドDNAは BRCA1標的gRNAと共にトランスフェクトすることができます。BE3とgRNAプラスミドの共トランスフェクションと比較して、HAP-BE3細胞へのgRNAプラスミドのトランスフェクションは、当社の手の中の標的座で最大3倍の効率的な塩基編集を誘導します。
- 種子5 x 105 HAP1-BE3細胞(または共トランスフェクション法の場合はHAP1細胞)を、トランスフェクションの1日前に24ウェルプレートでウェルあたり。トランスフェクション時に、培養細胞は適切な密度(70%~80%合流)に達する。
- 製造者のプロトコルに従って購入したトランスフェクション試薬(材料表)を用いたトランスフェクトBRCA1ターゲティングgRNA。BRCA1標的部位でC:GからT:Aへの変換を誘導するには、1μgのBRCA1標的gRNA(共トランスフェクション法の場合には1μgのBE3コード化プラスミドDNA)を使用します。37°Cで細胞をインキュベートし、3〜4日ごとにサブカルチャーを行います。
- 細胞ペレットを収穫し、トランスフェクション後24日目に塩基編集効率を分析する(トランスフェクション後3日目からのサンプルは、0日目のサンプルとして再採点を分析する)。
- ゲノムDNA精製キット(材料表)を用いてゲノムDNAを抽出する。
注:試薬とDNAの比率が可変でトランスフェクション条件を最適化することを推奨します。HAP1トランスフェクションの最適条件は、当社の手の中のDNAに対する試薬の4:1配給です。
4. イルミナ次世代シーケンシング(NGS)のサンプル調製
図 3: 次世代シーケンシングの準備第1のPCRプライマーは、ゲノムDNA上のBRCA1標的部位を増幅するように設計された。第2のPCRプライマーは、その配列が1番目のPCRプライマー配列よりも内側に位置するように設計されました。黄色のバーとして示された追加の配列を、次世代シーケンシングを行うために必要な配列を付けるため、2番目のPCRプライマーの両端に追加した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
- BRCA1標的部位を増幅する1st PCRプライマーを設計します。1st PCR 製品のサイズに制限はありませんが、特定の領域を効率的に増幅するために、製品サイズを <1 kb にすることをお勧めします (図 3)。
- 第1 PCR 製品内にある 2番目の PCR プライマーを設計します。NGS 読み取り長さに応じてアンプリコンのサイズを考慮してください(例えば、アンプリコン製品のサイズは、各読み取りをマージするために2×150 bpペアエンドランの場合、300 bp未満でなければなりません)。NGS分析に必須の配列を付けるためには、フォワードプライマーの5'末端に追加の配列を追加します:フォワードプライマーの場合は、5'-ACACTCTTCCC TACACGACGCTCTTCCGATCT-3'シーケンスを5'末端に追加し、逆プライマーに5'-GTACTGGAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCTCTCT CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT'
注: 入れ子になった PCR を使用して、プライマーが非ターゲットシーケンスに付着するのを防ぐことで、非特異的結合の増幅を減らしました。 - 3つの時点から得られたゲノムDNA上のBRCA1標的部位を増幅する。PCR エラーを最小限に抑えるために、製造元のプロトコルに従って高忠実度のポリメラーゼを使用します。1st PCR反応では、15サイクル以上の増幅に100ngのゲノムDNAを使用してください。2回目のPCR反応では、1st PCR産物の1μLを使用して20サイクル以上の増幅を行います。2nd PCR産物の5μLを2%アガロースゲルで実行し、サイズを確認します。
- NGS分析に必須の配列を取り付けるために、下記のプライマーを用いて2番目 のPCR産物を増幅します。PCR反応では、2nd PCR産物の1μLが、高忠実度ポリメラーゼを使用して最大30サイクルの増幅に使用されます。
- 多数のライブラリを同時にプールおよびシーケンス化する多重シーケンスを実行するには、前方 (D501 - D508) および逆 (D701 – D712) プライマーを使用します。異なるプライマーセットを使用して各サンプルを増幅し、ユニークなデュアルインデックス作成戦略を実施します。
- 2%アガロースゲル上でPCR産物の5μLを実行してサイズを確認し、市販のPCRクリーンアップキット(材料表)を使用して増幅を精製します。NGS ライブラリを作成するには、各サンプルを同じ量で混合します。
- 分光光度計を使用して260 nm波長のNGSライブラリを定量化し、再懸濁バッファーまたは10 mM Tris-HCl、pH 8.5を使用してNGSライブラリを1 nMの濃度に希釈します。ライブラリタイプに応じて適切な負荷濃度に希釈したライブラリの100 μLを準備します(例えば、Nextera DNA Flex用にライブラリの200 pMを準備します)。
- コントロールとして、キットの種類に適した希釈サンプルとphiXを組み合わせます。
- ライブラリをカートリッジにロードし、製造元のプロトコルに従って NGS を実行します。イルミナ iSeq 100 またはミセクシステムは、シングル読み取りまたは対端の場合、最大 300 bp までのさまざまな長さのアンプリコンをシーケンスできます。ベース編集効率の詳細な分析のために、ターゲットアンプリコンあたり10,000以上の読み取りを推奨しました。
5. BRCA1バリアントの機能評価のためのベース編集効率の分析
- MAUND24を使用してベース編集効率を分析します。ベース編集効率は、以下に説明するとおりに計算されます。
BE3 アクティブウィンドウに複数のシトシンが存在する場合、BRCA1バリアントの評価を対象とする C から T への変換のみが考慮されます。例えば、BE3アクティブウィンドウのシーケンスが「C4A5T6C7T8」である場合、ベース編集によって生成される可能性のあるシーケンスは「T4A5T6C7T8」、及び「T4 A5 T6 T7T8」と「T4A5T6T7T8」である。このとき、位置4が目的のBRCA1バリアントのターゲットポジションである場合、ベース編集効率を計算するために「T4A5T6C7T8」配列のみが考慮される。
注: CRISPResso225、BE アナライザー23など、ベース編集アクティビティの解析に使用する他の Web ツールも推奨します。 - BRCA1バリアントの正と負の制御を使用して結果を検証します。良性制御のベース編集効率は変わらないはずですが、病原性制御の制御は時間の経過とともに減少するはずです。
- BRCA1変異体の相対ベース編集効率を計算し、その病原性を決定します。0 日目と 21 日目のサンプルの有意な差は、t -testなどの適切な統計分析で分析されます。
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Representative Results
このプロトコルに記載された実験的アプローチは、CRISPRベースのシトシンベースエディタによって生成される内因性 BRCA1 変異体の機能評価を可能にする。 BRCA1 変異体の機能評価に適切な細胞株を選択するには、研究者は 、BRCA1 が標的細胞株に不可欠な遺伝子であることを確認する必要があります。例えば、まずCas9とgRNAをHAP1細胞株にトランスフェクトして BRCA1 を破壊し、標的深いシーケンシングによって突然変異周波数を分析しました。HAP1細胞株では経時の変異頻度が有意に減少することがわかった(図4A)。これらの結果は 、BRCA1がHAP1 細胞株における細胞生存率に不可欠な遺伝子であることを示した。C:G~T:A置換変異体が BRCA1の機能に影響を与えるかどうかを調べるため、各変異を誘導する可能性のあるプラスミドDNAコードGRNAをHAP1-BE3細胞株にトランスフェクトし、置換周波数を解析した。病原性変異体であるc.3598C>T(p.Q1200*)の相対的置換周波数は劇的に減少したのに対し、良性変異体であるc.4527C>T(p.Y1509Y)の相対置換周波数は時間と同様のままでした(図4B)。ClinVar データベースでは 、BRCA1 の c.154C>T (p. L52F)、c.3847C>T (p.H1283Y)、および brCA1 の c.5056C>T (p.H1686Y) が不確実な有意性のバリアントとして報告されています。我々は、上記の方法を用いてこれらの変異体の機能を分析し、これら3つの変異体のヌクレオチド置換頻度が時間依存的に減少することを発見した(図4B)。これらの結果から、3つの置換はBRCA1機能を変化させ、病原性突然変異として分類することができた。
図4 CRISPR-Cas9システムを用いたBRCA1の機能研究の代表的な結果(A) BRCA1 の破壊は細胞の生存率に影響を与える。HAP1細胞を BRCA1を標的とするプラスミドをそれぞれspCas9および2つのgRNAをコードしてトランスフェクトし、細胞生存率分析のために標的深いシーケンシングを行った。BRCA1の突然変異頻度は、2つの独立したgRNAを導入した細胞において時間依存的に減少し、陰性対照として使用されたCCR5の突然変異頻度は時間の経過とともに同じままであった。(B) 5 つの BRCA1 バリアントの機能評価。HAP1-BE3細胞をそれぞれBRCA1変異を誘導するgRNAをトランスフェクトし、細胞生存率分析のために標的深いシーケンシングを行った。c.3598C>T、c.154C>T、c.3847C>T、およびc.5056C>Tの細胞では相対的な置換頻度は時間依存的に減少し、c.4527C>Tの相対的な置換頻度は同じままでした。誤差範囲は平均の標準誤差を示します。アスタリスクは異なる P 値を示します: * P<0.05;** P<0.005.n.s: 重要ではありません。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、CRISPR-瞑想されたシトシンベースエディタを用いた BRCA1 変異体の機能評価のための簡単な方法を説明する。プロトコルは、標的遺伝子座におけるgRNAの設計とそれらが発現するプラスミド・ドナの構築のための方法を記述する。シトシン塩基エディタは、活性ウィンドウでヌクレオチド変換を誘導する(BE3の場合、gRNA標的配列のPAM-遠位末端のヌクレオチド4〜8)。アクティブウィンドウ内のすべてのシトシンをチミンに置き換えることができるので、研究者は慎重にターゲット配列を選択する必要があります。さらに、ステップ5で説明したように、アクティブウィンドウ内の複数のシトシンを慎重に分析して BRCA1 バリアントの機能を評価する必要があります。
最も重要なステップの1つは 、BRCA1 機能評価の初期突然変異頻度に影響を与える標的細胞株におけるトランスフェクションである。初期突然変異頻度を改善するために、研究者は対象となる細胞株への送達方法を最適化すべきである。ステップ1で説明したように、細胞株を発現するBE3の生成は、初期突然変異頻度を増加させる有用な選択肢である。Be3およびgRNAの構成発現が累積ヌクレオチド変換を引き起こす可能性があるため、HAP1-BE3細胞へのgRNAのレンチウイルス伝達は推奨されておらず、これらの結果は BRCA1 変異体の機能評価を妨げる。
このプロトコルで導入されたBE3仲介方法に加えて、BRCA1バリアントの機能評価をさらに拡張するために、いくつかの補完的な方法が推奨される。まず、上記のように、BRCA1変異体の確実な結果を得るためには、初期サンプルにおける突然変異頻度が重要である。ベース編集効率を高めるには、BE4max などのシトシンベースエディタのバリアントを推奨します。第二に、BE3は5'-NGG-3'PAM配列を介して標的DNA配列を認識し、これは様々なタイプのBRCA1変異体を生成する際の制限である。最近開発された PAM シーケンスを持つ Cas9 バリアントは、ターゲットとなるBRCA1バリアント26、27、28を拡張するのに便利なオプションです。第三に、BE3は望ましくない部位での実質的な塩基編集を誘導し、オフターゲット効果はBRCA1変異体29、30、31の機能評価に影響を与える可能性がある。BE3のオフターゲット効果を低減するために、gRNAの標的部位はゲノム内の類似した配列なしで慎重に選択されるべきである。ゲノムおよびトランスクリプトームにおける不要な塩基編集を低減するために開発されたSECURE-BE3またはYE1は、便利なオプション32、33です。第4に、Cas9媒介性HDRに基づく飽和ゲノム編集(SGE)法も、BRCA1変異体19の機能解析のための素晴らしい選択肢である。この方法は、BRCA1変異体の標的配列およびヌクレオチド位置を選択する場合に制限はない。しかし、HDRベースのアプローチは、ベースエディタよりも比較的効率が低く、さらにドナーテンプレート14の設計と合成が必要です。最後に、患者由来のBRCA1変異体には、点突然変異、挿入、および欠失などの様々な範囲の突然変異が含まれる。これらのうち、点突然変異はBRCA1変異体の主要な集団であり、C:GからT:Aへの変換だけでなく、A:TからG:C、C:GからG:C、およびA:TからT:Aへの変換でもあります。これらのタイプの変換の機能評価に、CRISPR仲介アデノシンベースエディタとプライムエディタは、貴重なオプション34、35です。ゲノム工学技術の急速な開発により、より多様なBRCA1変異体の機能評価が可能になります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、韓国国立研究財団(助成金2017M3A9B4062419、2019R1F1F1F1057637、2018R1A5A2020732 Y.K.に支援されました)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | NEB | R3136 | Restriction enzyme |
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | Drug for selecting transduced cells |
| BsaI | NEB | R0535 | Restriction enzyme |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | Genomic DNA prep. kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965092 | Medium for HEK293T/17 cells |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000036 | Supplemetal for cell culture |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | Gibson assembly kit |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Gibco | 12440046 | Medium for HAP1 cells |
| lentiCas9-Blast | Addgene | 52962 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection materials |
| pCMV-BE3 | Addgene | 73021 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | Supplemetal for cell culture |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530SQ | High-fidelity polymerase |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Plasmids DNA for virus prep. |
| pRG2 | Addgene | 104174 | gRNA cloning vector |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmids DNA for virus prep. |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | Plasmid DNA prep. Kit |
| QIAquick Gel extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel extraction kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR product prep. kit |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | Ligase for gRNA cloning |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Materials for T7E1 assay |
| XbaI | NEB | R0145 | Restriction enzyme |
References
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