Summary
BRCA1 돌연변이를 가진 사람들은 BRCA1 변이체의 기능의 정확한 평가를 보증하는 암 발전의 고위험이 있습니다. 본명, 우리는 살아있는 세포에서 표적 C:G ~T:A 변환을 가능하게 하는 CRISPR 매개 사이토신 베이스 편집기를 사용하여 BRCA1 변이체의 기능적 평가를 위한 프로토콜을 기술했습니다.
Abstract
최근 연구는 형광 기자 의 소사, 배아 줄기 세포 생존 가능성 연구, 치료 약물 기반 감도 검사와 같은 다양한 기능성 평가 방법을 사용하여 BRCA1 유전자 돌연변이와 관련된 위험을 조사했습니다. 그들은 BRCA1 변종을 많이 명확히했지만, 외인성 발현 BRCA1 변종의 사용을 포함하는 이러한 소는 과발현 문제와 관련이 있으며 전사 후 규제에 적용 할 수 없습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 이전에 살아있는 세포에서 표적 뉴클레오티드 대체를 유도하는 CRISPR 매개 사이토신 베이스 편집기를 통해 BRCA1 변이체의 기능적 분석을 위한 방법을 보고했습니다. 이 방법을 사용하여 c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T, c.4986+5G>A 등 기능이 모호한 변종을 확인했으며 CRISPR 미디어 베이스 에디터가 BR1의재분류 에 유용한 도구임을 확인했습니다. 여기에서 CRISPR 기반 사이토신 베이스 편집기를 사용하여 BRCA1 변종의 기능 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 대상 사이트 선택, 기능 분석 및 BRCA1 변형 평가에 대한 지침을 제공합니다.
Introduction
유방암 제1형 감수성유전자(BRCA1)는널리 알려진 종양 억제유전자이다. BRCA1 유전자는 DNA 손상의 복구와 관련이 있기 때문에, 이 유전자에 있는 돌연변이는 개별1에있는 암 발달의 더 중대한 리스크로 이끌어 낼 것입니다. 유방, 난소, 전립선 및 췌장암은 BRCA1 유전자2의승계된 기능 상실 (LOF) 돌연변이에 연결됩니다. BRCA1 변이체의 기능적 평가 및 식별은 다양한 질병을 예방하고 진단하는 데 도움이 될 수 있습니다. BRCA1 변이체의 기능을 해결하기 위해, 배아 줄기 세포 생존성 감수제, 형광 기자 감수제 및 치료약물 기반 감도 감수제3,4,5,6과같은 BRCA1 변종의 병원성을 조사하기 위해 여러 가지 방법이 개발되고 광범위하게 사용되고 있다. 이러한 방법은 BRCA1 변이체의 많은 기능을 평가했지만, 외인성 발현 BRCA1 변이체를 포함하는 방법은 다운스트림 조절, 유전자 투여량 및 단백질 접이식7에영향을 미칠 수 있는 과발현 측면에서 한계를 제기한다. 더욱이, 이러한 소하는 mRNA 접합, 성적증명서 안정성, 번역되지 않은영역8,9의효과와 같은 전사 후 조절에 활용될 수 없다.
CRISPR-Cas9 시스템은 살아있는 세포 및 유기체10에서표적 게놈 편집을 가능하게 합니다. 단일 가이드 RNA를 통해 Cas9는 두 가지 DNA 수리 경로를 활성화하기 위해 특정 게놈 로맥에서 염색체 DNA에서 이중 가닥 브레이크(DSBs)를 유도하여 오류 발생하기 쉬운 비homologous 엔드 결합(NHEJ) 경로 및 오류 없는 homology 지향 수리(HDR)경로(HDR)경로를 활성화할 수 있다. HDR은 정밀한 수리 메커니즘입니다. 그러나, HDR에 대 한 Cas9 핵에 의해 유도 된 DSBs 종종 원치 않는 삽입 및 삭제 결과 (indel) 돌연변이. 추가적으로, DNA 손상을 복구하기 위한 동종 기증자 DNA 템플릿이 필요하고 상대적으로 낮은 효율성을 가지고 있습니다. 최근에는, Cas9 니카아제(nCas9)는 C:G ~T:A 대체를 대상으로 하는 시티딘 데아미나제 도메인과 융합되어 왔으며, 동종 DNA 템플릿및 DNA 이중 가닥 브레이크12,13,14,15에대한 필요 없이. 시토신 베이스 에디터를 사용하여 BRCA1변종(16)의기능적 분석을 위한 새로운 방법을 개발했습니다.
본 연구에서는, CRISPR 매개 사이토신 베이스 에디터, BE314를사용했는데, 이는 효율적인 C:G를 T:A 포인트 돌연변이로 유도하고, BRCA1 변이체의 기능적 평가를 구현하고 여러 BRCA1 변종의 기능을 성공적으로 식별하였다(그림1).
그림 1: 기능 평가를 위한 워크플로에 대한 개요입니다. (A) BRCA1의기능성 평가를 보여주는 회로도. BRCA1의 LOF는 세포 생존에 영향을 미치기 때문에 BRCA1 돌연변이가 병원성일 때, 세포는 통로 수가 증가함에 따라 죽는다. (B) BRCA1의기능성 평가 단계 . 점선 상자는 선택 사항입니다. 그것은 plasmids DNA를 표현하는 gRNA 표현 및 BE3의 공동 형질으로 대체 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
참고: 방법 1(HAP1-BE3 세포주 생성)은 선택 사항입니다. BE3 발현 세포주 대신, BE3-인코딩 플라스미드 DNA는 gRNA 인코딩 플라스미드 DNA와 공동 으로 연관될 수 있다. BE4max와 같은 사이토신 베이스 에디터의 다른 변종도 고효율 베이스 편집에 사용될 수 있습니다.
1. HAP1-BE3 세포주 생성
- 플라스미드 DNA 의 건설
- 렌티바이러스 생산을 위한 렌티베3-블라스미드 DNA를 구성하기 위해, 고충실도 폴리머라제를사용하여 PCR에 의한 PCMV-BE3(재료표)에서 BE3 코딩 서열을 증폭시다. PCR 프라이머를 설계하여 소화된 벡터의 중첩 시퀀스(1.1.2단계로부터)를 포함하여 다음과 같은 이더스모 조립에 대해다음 17:
프라이머-F:5'-TTTGCCGCCA가아가카가카가ACCACCTTC타그A GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3',
프라이머-R:5'-CAGAGAGAAGTGTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTCTCTTTGGG-3'
참고: 밑줄에 표시된 뉴클레오티드는 소화된 벡터와 겹쳐져 있으며 이러한 서열은 사용자가 선택한 대상 벡터에 특이합니다. - 다이제스트 렌티카스9-블라스트(재료표) 37°C에서 1시간 동안 제한 효소, XbaI 및 BamHI(1μg당 1단위)를 함유한 플라스미드 DNA. 소화된 제품을 0.8% 아가로즈 젤로 실행하고 상업용 젤 추출키트(재료 표)를사용하여 적절한 크기의 밴드(8.6 kb)를 정화합니다.
- 증폭된 BE3 PCR 생성물 및 소화된 렌티카스9-블라스트 벡터를 복제하여 이더스모조립키트(재료표)를사용한다. DNA 단편의 총 0.02-0.5 pmol및 벡터:삽입의 1:3 비율을 사용합니다. 조립 제품을 DH5 알파 유능한셀(18)으로변환한다. 암피실린(100 μg/mL)을 함유한 한천 판에 변압제를 넣고 37°C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양한다.
- 여러 개의 식민지를 선택하고 암피실린 (100 μg/mL)을 함유 한 LB (리소제니 국물) 배지의 4 mL에서 접종하고 180 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 문화를 성장시다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 플라스미드 DNA 정제 키트(재료의 표)를사용하여 플라스미드 DNA를 정화합니다.
- DNA 복제 성공을 확인하기 위해, 표준 및 BE3 특이 프라이머(보충 표 1)를사용하여 Sanger 시퀀싱에 의해 각 정제 된 플라스미드 DNA (1.1.5 단계에서)의 BE3 서열을 분석하고 정확한 복제 렌티베3 폭발 구조를 선택합니다.
참고: Sanger 시퀀싱 결과를 분석하기 위해 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 및 CLUSTALW(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)와 같은 여러 도구를 권장했습니다.
- 렌티바이러스 생산을 위한 렌티베3-블라스미드 DNA를 구성하기 위해, 고충실도 폴리머라제를사용하여 PCR에 의한 PCMV-BE3(재료표)에서 BE3 코딩 서열을 증폭시다. PCR 프라이머를 설계하여 소화된 벡터의 중첩 시퀀스(1.1.2단계로부터)를 포함하여 다음과 같은 이더스모 조립에 대해다음 17:
- HAP1-BE3 세포주 세포 배양 및 생성
- 건강한 상태와 적극적으로 분할 상태에서 세포를 유지합니다. 이스코브의 변형된 덜벡코 의 배지내의 배양 HAP1세포(재료표)10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/연쇄절제술을 함유하고 있다. Dulbecco의 수정된 독수리배지(재료 표)에서배양 HEK293T/17 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린/연쇄 절제술을 함유하고 있습니다.
참고 : HAP1 세포는 거의 haploid 세포이기 때문에 유전 연구에 유용합니다. 그러나, 세포는 세포 배양에서 디플로이드 상태로 자발적으로 돌아갈 수 있다. 농축 Hoechst 34580 스테인드 1 n-계량체를 이용한 혼성구는 HAP1세포(19)의haploidy의 유지에 도움이 될 것이다. - 종자 5 x 106 HEK293T/17 셀 100 nm 접시에 1 일 전에 형질 전환. 트랜스펙트 당일, 플라스미드 DNA(렌티베3-블라스트 15μg, 바이러스 포장용 psPAX2 9 μg,2nd 세대 렌티바이러스 포장 시스템의 바이알 봉투용 pMD2.G 6 μg)를 제조사의프로토콜(재료표)20에따라 상업적인 트랜스페션 시약을 사용한다. 배지를 6h 후 트랜스페션에서 변경하고 바이러스 함유 배지를 48h 또는 72h에서 경질 후 변경한다. 0.45 μm 필터를 사용하여 상체를 필터링합니다.
- BE3의 렌티바이러스 입자를 HAP1 세포로 0.1의 MOI(복합감염)로 변환합니다. 적절한 MOI에 맞게 조정하려면 바이러스의 연속적으로 희석된 농도를 사용하십시오. 매체를 제거하고 조정 된 바이러스 성 상수 및 신선한 배양 매체로 대체하십시오.
- 1일 전도 후, 배지를 10 μg/mL의블라스팅딘(재료표)으로변경하고, 세포를 3일 동안 셀리시딘으로 선택한다. blasticidin 선택 후 다음 단계에 대해 생존 셀의 ~10 %를 가진 우물을 선택합니다.
- 블라스팅시딘 선택 후, 단일 클론을 분리하기 위해 96웰 플레이트에 변환된 세포를 0.5 세포/웰밀도로 시드하여 단일 클론(예를 들어, 20mL(200 μL당 0.5세포)에 50개의 세포를 희석시키고 96개의 잘 된 판당 200 μL을 원한다. 2 주 동안 96 웰 플레이트를 배양하고 BE3 활동을 확인하기 위해 단일 식민지를 선택합니다.
- 단일 콜로니를 두 세트로 나누고, BE3 활동을 테스트하기 위한 세트와 유지 보수를 위해 다른 집합을 나눕니다. gRNA의 렌티바이러스 입자를 BE3 활성을 확인하기 위한 세트 중 하나로 변환합니다. T7 엔도누클리스 I(T7E1, 재료표)분석 또는 표적 심층 염기서열분석기(Step 4)21을수행하여 각 콜로니의 돌연변이 주파수를 분석한다. 건강하고 능동적인 BE3가 있는 적절한 단일 클론을 선택합니다.
참고: 정확한 돌연변이 주파수를 검증하려면 T7E1 분석보다 표적 깊은 시퀀싱을 권장합니다. HEK2(5'-GAACACAAGAGAGAGACTGGGGG-'3)는 BE3의 검증대상 사이트입니다.
- 건강한 상태와 적극적으로 분할 상태에서 세포를 유지합니다. 이스코브의 변형된 덜벡코 의 배지내의 배양 HAP1세포(재료표)10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/연쇄절제술을 함유하고 있다. Dulbecco의 수정된 독수리배지(재료 표)에서배양 HEK293T/17 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린/연쇄 절제술을 함유하고 있습니다.
2. GRNA를 대상으로 하는 BRCA1의 설계 및 시공
그림 2: gRNA 플라스미드 DNA의 예. (A)BE3로 표적 서열을 효과적으로 편집하기 위해서는, 표적 C(표적 G)를 5-뉴클레오티드 창 내에 배치하는 NGG PAM(CCN PAM)이 요구된다. NGG PAM은 빨간색으로 표시되고 기본 편집 창은 회색 상자로 표시됩니다. (B)c.8047C>T(H1283Y) 베이스 편집을 위한 gRNA 서열이 표시되고 대상 C:G 쌍이 빨간색으로 표시되고 활성 창은 회색 상자에 의해 강조된다. gRNA 복제의 경우 굵게 표시된 오버행 서열이 5 엔드 모두에 추가됩니다. gRNA에 대한 템플릿은 두 개의 보완적인 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 생성되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
참고: BRCA1 변종의 양수 및 음수 제어는 필수적입니다. 이 연구에서는 c.5252G>A(R1751Q) 및 c.4527C>T(Y1509Y)가 양성 컨트롤로 사용됩니다. c.191G>A(C64Y), 81-1G>A, c.3598C>T(Q1200*)는 병원성 대조군으로 사용됩니다. 각 gRNA의 표적 서열은 보충표 1에나열됩니다.
- NCBI22에서GenBank에서 BRCA1 게놈 서열을 획득하십시오.
- 관심의 돌연변이 주위에 프로토 스페이서 인접 모티프 (PAM) 시퀀스 "NGG"와 "CCN"으로 20 bp 대상 사이트를 검색합니다. 관심의 돌연변이는 GRNA 표적 서열의 PAM-distal 말단인 BE3의 활성 창으로 인해 4-8뉴클레오티드에 위치해야한다. c.8047C>T(H1283Y)-c.5252G>A(R1751Q)-표적 gRNA, 5~TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3및 5°C-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGAA의경우, 3차 면에 사용됩니다. C ~T 및 G에서 A로 의 전환은 각각 NGG 및 CCNPAM(그림 2A)과함께 발생합니다.
참고: BE-Designer(http://www.rgenome.net/be-designer/)(23)는 gRNA 설계를 위한 유용한 웹 기반 도구입니다. - gRNA 당 두 개의 보완적인 올리고뉴클레오티드를 주문; 전방 올리고뉴클레오티드의 경우 가이드 서열의 5엔자 끝에 "CACCG"를 추가하고, 역방향 올리고뉴클레오티드의 경우 5엔드에 "AAAC"를 추가하고 3엔드에 "C"를 추가합니다. 이러한 추가 서열은 이 프로토콜에 사용되는 대상 gRNA 발현 벡터(2.5단계에서)에 특이적이며, 사용자는 대체 gRNA 발현벡터(그림 2B)에대해 조정되어야 한다.
- 100 μM의 최종 농도에서 증류수에서 올리고뉴클레오티드를 재연. 두 개의 보완적인 올리고뉴클레오티드를 T4 계합버퍼(재료 표)로10 μM의 최종 농도로 혼합하고 95°C에서 5분간 가열하여 실내 온도에서 냉각시 냉각시.
- 37°C(재료표)에서 1h에 대한 제한 효소, BsaI(1 μg당 1단위)를 사용하여 pRG2를 소화한다. 소화된 제품을 1% 아가로즈 젤로 실행하고 적절한 크기의 밴드(2.5kb)를 정화합니다.
참고: 고전적인 소화 및 결찰 방법을 사용하는 대신 골든 게이트 복제와 같은 다른 복제 방법을 사용할 수 있습니다. - 제조자의 프로토콜에 따라 구입한 DNA 리개아제(재료표)를 사용하여 벡터DNA에 아닐드 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 리게이트하고 이를 DH5 알파 유능한 세포로 변환(다른 대장균 균주도 사용할 수 있음).
- 암피실린(100 μg/mL)을 함유한 한천 판에 변압제를 추가하고 37°C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양한다. 여러 변압제에서 플라스미드 DNA를 정화하고 U6프로모터(재료표)에서프라임하는 프라이머를 사용하여 Sanger 시퀀싱에 의한 gRNA 서열을 분석합니다.
3. CRISPR 중재 기본 편집 도구를 사용하여 BRCA1 변형 생성
참고: HAP1-BE3 세포주가 사용되지 않으면 BE3-인코딩 플라스미드 DNA가 BRCA1-표적gRNA와 공동 으로 전염될 수 있습니다. BE3 및 gRNA 플라스미드의 공동 배회와 비교하여, HAP-BE3 세포에 gRNA 플라스미드의 트랜스포팅은 우리의 손에 있는 표적 궤적에서 최대 3배까지 효율적인 베이스 편집을 유도합니다.
- 종자 5 x 105 HAP1-BE3 세포 (또는 공동 형질 전환 방법의 경우 HAP1 세포) 24 웰 플레이트에서 잘 1 일 전에. 배양 세포가 적절한 밀도(70%-80% 합류)에 도달할 때 배양 세포.
- Transfect BRCA1-제조 업체의 프로토콜에 따라 구입 한 형질 전환 시약(재료의 표)을사용하여 gRNA를 타겟팅. BRCA1표적 사이트에서 C:G에서 T:A 변환을 유도하기 위해 BRCA1-targeting gRNA(공동 트랜스코딩 방법의 경우 BE3-인코딩 플라스미드 DNA의 1 μg)를 사용합니다. 3-4일마다 37°C및 하위 배양에서 세포를 배양합니다.
- 세포 펠릿을 수확하여 염기 편집 효율을 분석하기 위해 전환 후 3일, 10 일 및 24일 동안 의질 편집 효율성을 분석합니다(전환 후 3일 이후의 샘플은 0일 샘플로 다시 분해되는 것으로 분석됩니다).
- 유전체 DNA 정제 키트(재료표)를 사용하여 게놈DNA를 추출합니다.
참고: 시약의 가변 비율로 DNA에 대한 변액 비율로 형질 전환 조건을 최적화하는 것이 좋습니다. HAP1 트랜스페션에 대한 최적의 상태는 우리 손에 있는 DNA에 시약의 4:1 배급입니다.
4. 일루미나 차세대 염기서열 분석(NGS)에 대한 샘플 준비
그림 3: 차세대 시퀀싱 준비. 1st PCR 프라이머는 게놈 DNA에 BRCA1 표적 사이트를 증폭하도록 설계되었습니다. 2nd PCR 프라이머는 시퀀스가 1st PCR 프라이머 시퀀스보다 내부에 더 많이 위치하도록 설계되었습니다. 2nd PCR 프라이머의 양쪽 끝에 노란색 막대로 표시된 추가 시퀀스가 추가되어 차세대 시퀀싱을 수행하기 위한 필수 시퀀스를 부착했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- BRCA1 대상 사이트를 증폭하기 위해 1st PCR 프라이머를 디자인합니다. 1st PCR 제품의 크기에는 제한이 없지만 특정 영역(그림3)을효율적으로 증폭시키는 것이 좋습니다.
- 1st PCR 제품 내부에 위치한 2nd PCR 프라이머를 디자인합니다. NGS 판독 길이에 따라 앰플리시온의 크기를 고려하십시오(예를 들어, 앰플리턴 제품의 크기는 각 읽기를 병합하기 위해 2 × 150bp 쌍끝 실행에 대해 300 bp보다 작아야 합니다). NGS 분석을 위한 필수 서열을 부착하기 위해, 다음과 같이 2nd PCR 프라이머의 5'끝에 추가 시퀀스를 추가 : 앞으로 프라이머에 대한, 5'끝에 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTTCCGATCT-3'시퀀스를 추가하고, 역 프라이머에 대한, 추가 5'GTGACTGGAGTTCAGACGGGTTTTTTTTTTCC TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
참고: 중첩된 PCR을 사용하여 프라이머가 비대상 시퀀스에 연결되지 않도록 하여 비특이적 결합의 앰플리턴을 줄입니다. - 3개의 시간 지점에서 얻은 게놈 DNA에 BRCA1 표적 사이트를 증폭시합니다. PCR 오류를 최소화하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 고충실도 폴리머라아제사용하십시오. 1st PCR 반응의 경우 15 사이클 에 걸쳐 증폭을 위해 게놈 DNA 100 ng를 사용하십시오. 2nd PCR 반응의 경우 1st PCR 제품의 1 μL을 사용하여 20사이클 이상 증폭하십시오. 2nd PCR 제품의 5 μL을 2% 아가로즈 젤에 실행하고 크기를 확인합니다.
- NGS 분석을 위한 필수 서열을 부착하기 위해 아래에 나열된 프라이머를 사용하여2nd PCR 제품을 증폭시합니다. PCR 반응의 경우,2nd PCR 제품의 1 μL은 고충실도 폴리머라제를 사용하여 최대 30사이클의 증폭에 사용된다.
- 많은 라이브러리를 동시에 풀링하고 시퀀싱할 수 있도록 멀티플렉스 시퀀싱을 수행하려면 고유한 인덱스 시퀀스가 있는 앞으로(D501 – D508) 및 역(D701 – D712) 프라이머를 사용합니다(보충 표 1). 고유한 이중 인덱싱 전략을 수행하기 위해 서로 다른 프라이머 세트를 사용하여 각 샘플을 증폭합니다.
- PCR 제품의 5μL을 2% 아가로즈 젤에 실행하여 크기를 확인하고 상용 PCR 정리키트(재료 표)를사용하여 앰플리턴을 정화합니다. 각 샘플을 동일한 양으로 혼합하여 NGS 라이브러리를 만듭니다.
- 분광광계를 사용하여 260 nm 파장에서 NGS 라이브러리를 정량화하고 반사 액수 버퍼 또는 10m Tris-HCl, pH 8.5를 사용하여 NGS 라이브러리를 1 nM의 농도로 희석한다. 라이브러리 유형에 따라 적절한 하중 농도로 희석된 라이브러리의 100 μL을 준비합니다(예를 들어, Nextera DNA Flex용 라이브러리의 200pM준비).
- 컨트롤로, 키트의 유형에 적합한 희석 된 샘플과 phiX를 결합합니다.
- 라이브러리를 카트리지에 로드하고 제조업체의 프로토콜에 따라 NGS를 실행합니다. 일루미나 iSeq 100 또는 Miseq 시스템은 단일 읽기 또는 페어링 엔드에 대해 최대 300bp의 다양한 길이의 앰플리컨을 시퀀스할 수 있습니다. 기본 편집 효율을 심층 분석하기 위해 대상 앰플리턴당 10,000개 이상의 읽기를 권장했습니다.
5. BRCA1 변종의 기능 성 평가를 위한 기본 편집 효율 분석
- MAUND24를사용하여 기본 편집 효율성을 분석합니다. 기본 편집 효율은 아래에 설명된 대로 계산됩니다.
여러 사이토신이 BE3 활성 창에 존재하는 경우 BRCA1 변종을 평가하기 위한 C ~ T 변환만 고려됩니다. 예를 들어, BE3 활성 창의 시퀀스가 "C4A5T6C7T8,"기본 편집에 의해 생성된 가능한 시퀀스는 "T 4 A 5 T 6 C 7 T8","C4A5T6T7T T 8", "T 4 A 5 T6T7T8","T4A5T 6 T7TT 8"이다. 이때, 위치 4가 원하는 BRCA1 변종에 대한 표적 위치인 경우, "T4A5T6C7T8"시퀀스만 기본 편집 효율을 계산하는 것으로 간주됩니다.
참고: CRISPResso2 25 및 BE분석기(23)와같은 기본 편집 활동을 분석하기 위해 다른 웹 도구도 추천합니다. - BRCA1 변종의 양수 및 음수 제어를 사용하여 결과를 확인합니다. 양성 제어의 기본 편집 효율성은 동일하게 유지되어야하는 반면 병원성 제어의 효율성은 시간이 지남에 따라 감소해야합니다.
- BRCA1 변종의 상대적 기본 편집 효율을 계산하고 병원성을 결정합니다. 0일째와 21일 샘플 간의 유의한 차이는 t-test와같은 적절한 통계 분석을 분석합니다.
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Representative Results
이 프로토콜에 설명된 실험 적 접근은 CRISPR 기반 사이토신 베이스 편집기에서 생성 된 내인성 BRCA1 변종의 기능적 평가를 가능하게합니다. BRCA1 변이체의 기능적 평가를 위한 적당한 세포주를 선택하기 위하여는, 연구원은 BRCA1이 표적으로 한 세포주에서 필수적인 유전자이다는 것을 확인해야 합니다. 예를 들어, 우리는 먼저 CAS9와 gRNA를 HAP1 세포주로 전환하여 BRCA1을 방해하고 표적 깊은 시퀀싱에 의해 돌연변이 주파수를 분석했습니다. 우리는 HAP1 세포주에서 시간이 지남에 따라 돌연변이 주파수가 현저히 감소한다는 것을 발견했습니다(그림 4A). 이러한 결과는 BRCA1이 HAP1 세포주에서 세포 생존가능성을 위한 필수적인 유전자임을 보여주었습니다. C:G ~T:A 대체 변이체가 BRCA1의기능에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 각 돌연변이를 유도할 수 있는 플라스미드 DNA 인코딩 gRNA는 HAP1-BE3 세포주및 대체 주파수로 변형되었다. c.3598C>T(p. Q1200*)의 상대적 대체 주파수는 병원성 변이체로 급격히 감소했지만, 양성 변형인 c.4527C>T(p.Y1509Y)는시간(그림 4B)과비슷한 상태를 유지했다. ClinVar 데이터베이스에서는 c.154C>T(p. L52F), c.3847C>T(p.H1283Y), BRCA1의 c.5056C>T(p.H1686Y)가 불확실한 의미의 변형으로 보고된다. 상기 언급된 방법을 이용하여 이들 변종의 기능을 분석하고 이들 3가지 변종의 뉴클레오티드 치환 주파수가 시간 의존적 방식으로 감소하는 것으로나타났다(도 4B). 이러한 결과에서, 3개의 대체는 BRCA1 기능을 변경하고 병원성 돌연변이로 분류될 수 있었습니다.
그림 4: CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 BRCA1의 기능 연구의 대표적인 결과. (A)BRCA1 중단은 세포 생존가능성에 영향을 미칩니다. HAP1 세포는 각각 BRCA1을대상으로 하는 플라스미드 인코딩 spCas9 및 2gRNAs로 전염되었고, 세포 생존 가능성을 분석하기 위해 표적 심층 시퀀싱을 수행하였다. BRCA1의 돌연변이 주파수는 2개의 독립적인 gRNA로 전염된 세포에 있는 시간 의존적인 방식으로 감소하고, 음성 대조군으로 이용된 CCR5의 돌연변이 주파수는 시간이 지남에 동일하게 유지되었습니다. (B)5개의 BRCA1 변종의 기능평가. HAP1-BE3 세포는 BRCA1 돌연변이를 유도하는 gRNA로 각각 감염되었고, 세포 생존 가능성을 분석하기 위해 표적 심층 시퀀싱을 수행하였다. 상대치대체 주파수는 c.3598C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T, c.4527C>T의 셀에서 시간 의존적인 방식으로 감소했습니다. 오류 막대에는 평균의 표준 오류가 표시됩니다. 별표는 다른 P 값을 나타냅니다: * P&0.05; ** P&0.005., n.s: 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 CRISPR 명상 사이토신 베이스 편집기를 사용하여 BRCA1 변종의 기능 평가를 위한 간단한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 표적 궤적에서 gRNA의 설계 및 그들이 표현되는 플라스미드 DNA의 시공에 대한 방법을 설명합니다. Cytosine 염기 편집기는 활성 창에서 뉴클레오티드 변환을 유도합니다(BE3의 경우, 뉴클레오티드 4-8gRNA 표적 서열의 PAM-말단 말단에서). 활성 창에 있는 모든 사이토신은 백분으로 대체할 수 있기 때문에 연구원은 신중하게 표적 순서를 선택해야 합니다. 더욱이, 5단계에서 설명한 바와 같이, 활성 창내의 다중 사이토신은 BRCA1 변종의 기능을 평가하기 위해 신중하게 분석되어야 한다.
가장 중요한 단계 중 하나는 BRCA1 기능 성 평가를 위한 초기 돌연변이 주파수에 영향을 미치는 표적 세포주에서 의 질염입니다. 초기 돌연변이 빈도를 향상시키기 위해, 연구원은 관심있는 세포주에 전달 방법을 최적화해야 한다. 1단계에서 설명한 바와 같이, 세포주를 발현하는 BE3의 생성은 초기 돌연변이 주파수를 증가시키는 데 유용한 선택이다. 우리는 BE3와 gRNA의 구성 발현이 축적된 뉴클레오티드 변환을 일으킬 수 있기 때문에 HAP1-BE3 세포로 gRNA의 렌티바이러스 변환을 권장하지 않으며, 이러한 결과는 BRCA1 변이체의 기능성 평가를 방해합니다.
이 프로토콜에 도입된 BE3 중재 방법 외에도 BRCA1 변종의 기능 평가를 더욱 확장하기 위해 몇 가지 보완적인 방법을 권장합니다. 먼저, 전술한 바와 같이, 초기 샘플의 돌연변이 주파수는 BRCA1 변이체의 자신감 있는 결과를 얻기 위해 중요하다. 기본 편집 효율성을 높이기 위해 BE4max와 같은 사이토신 베이스 에디터의 변형을 권장합니다. 둘째, BE3는 5'-NGG-3' PAM 서열을 통해 표적 DNA 서열을 인식하며, 이는 다양한 유형의 BRCA1 변이체를 생성하는 데 한계가 있다. 최근에 개발된 Cas9 변종은 변경된 PAM 서열을 가진 유용한 옵션으로, 이 경우 대상 BRCA1 변종26,27,28을확장하는 데 유용한 옵션입니다. 셋째, BE3는 원치 않는 부위에서 실질적인 베이스 편집을 유도하고 오프 타겟 효과는 BRCA1 변종의 기능평가에 영향을 미칠 수있다 29,30,31. BE3의 오프 타겟 효과를 줄이기 위해 gRNA의 표적 부위는 게놈에서 유사한 서열 없이 신중하게 선택해야 합니다. 유전체 및 전사체에서 원치 않는 기본 편집을 감소시키기 위해 개발된 SECURE-BE3 또는 YE1은 유용한옵션(32,33)이다. 앞으로, Cas9 매개 HDR을 기반으로 하는 포화 게놈 편집(SGE) 방법또한 BRCA1 변이체(19)의 기능적 분석을 위한 훌륭한옵션이다. 이 방법은 BRCA1 변이체의 표적 서열 및 뉴클레오티드 위치를 선택하는 데 제한이 없다. 그러나 HDR 기반 접근 방식은 기본 편집기보다 상대적으로 효율적이며 기증자 템플릿14의디자인 및 합성이 추가로 필요합니다. 마지막으로, 환자 유래 BRCA1 변이체는 포인트 돌연변이, 삽입 및 삭제와 같은 다양한 돌연변이 범위를 포함한다. 이들 중, 포인트 돌연변이는 BRCA1 변이체의 주요 인구이며, 이는 C:G에서 T:A 변환까지뿐만 아니라 G:C로의 A:T, C:G에서 G:C로, A:T에서 T:A 변환으로 변환합니다. 이러한 유형의 전환에 대한 기능적 평가를 위해 CRISPR 매개 아데노신 기본 편집자 및 프라임 에디터는 귀중한 옵션34,35입니다. 빠르게 발전하는 게놈 엔지니어링 기술은 보다 다양한 BRCA1 변이체에 대한 기능적 평가를 가능하게 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 한국국립연구재단(2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637, 2018R1A5A2020732)에서 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | NEB | R3136 | Restriction enzyme |
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | Drug for selecting transduced cells |
| BsaI | NEB | R0535 | Restriction enzyme |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | Genomic DNA prep. kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965092 | Medium for HEK293T/17 cells |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000036 | Supplemetal for cell culture |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | Gibson assembly kit |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Gibco | 12440046 | Medium for HAP1 cells |
| lentiCas9-Blast | Addgene | 52962 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection materials |
| pCMV-BE3 | Addgene | 73021 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | Supplemetal for cell culture |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530SQ | High-fidelity polymerase |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Plasmids DNA for virus prep. |
| pRG2 | Addgene | 104174 | gRNA cloning vector |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmids DNA for virus prep. |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | Plasmid DNA prep. Kit |
| QIAquick Gel extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel extraction kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR product prep. kit |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | Ligase for gRNA cloning |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Materials for T7E1 assay |
| XbaI | NEB | R0145 | Restriction enzyme |
References
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