Summary
Le persone con mutazioni BRCA1 hanno un rischio più elevato di sviluppare il cancro, il che giustifica una valutazione accurata della funzione delle varianti BRCA1. Nel presente documento, abbiamo descritto un protocollo per la valutazione funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando editor di base citosina mediati da CRISPR che consentono la conversione da C:G a T:A mirata nelle celle viventi.
Abstract
Studi recenti hanno studiato i rischi associati alle mutazioni geniche BRCA1 utilizzando vari metodi di valutazione funzionale come test fluorescenti dei reporter, test di vitalità delle cellule staminali embrionali e test terapeutici di sensibilità a base di farmaci. Sebbene abbiano chiarito molte varianti brca1, questi test che coinvolgono l'uso di varianti BRCA1 espresse esogenamente sono associati a problemi di sovraespressione e non possono essere applicati alla regolamentazione post-trascrizionale. Per risolvere queste limitazioni, abbiamo precedentemente segnalato un metodo per l'analisi funzionale delle varianti BRCA1 tramite l'editor di base di citosina mediato da CRISPR che induce una sostituzione mirata dei nucleotidi nelle cellule viventi. Utilizzando questo metodo, abbiamo identificato varianti le cui funzioni rimangono ambigue, tra cui c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T e c.4986+5G>A, e abbiamo confermato che gli editor di base mediati da CRISPR sono strumenti utili per riclassificare le varianti di significato incerto in BRCA1. Qui, descriviamo un protocollo per l'analisi funzionale delle varianti BRCA1 utilizzando l'editor di base citosina basato su CRISPR. Questo protocollo fornisce linee guida per la selezione dei siti di destinazione, l'analisi funzionale e la valutazione delle varianti BRCA1.
Introduction
Il gene della suscettibilità al cancro al seno di tipo 1(BRCA1)è un gene soppressore tumorale ampiamente noto. Poiché il gene BRCA1 è correlato alla riparazione del danno al DNA, le mutazioni in questo gene porterebbero a un maggiore rischio di sviluppo del cancro in unindividuo 1. I tumori al seno, alle ovaie, alla prostata e al pancreas sono legati a mutazioni ereditarie della perdita di funzione (LOF) del gene BRCA1 2. La valutazione funzionale e l'identificazione delle varianti BRCA1 possono aiutare a prevenire e diagnosticare le varie malattie. Per affrontare la funzione delle varianti BRCA1, sono stati sviluppati diversi metodi e ampiamente utilizzati per indagare la patogenicità delle varianti BRCA1 come test di vitalità delle cellule staminali embrionali, test fluorescenti dei reporter e test terapeutici di sensibilità a base di farmaci3,4,5,6. Sebbene questi metodi abbiano valutato la funzione di molte varianti BRCA1, i metodi che coinvolgono varianti BRCA1 espresse esogenamente pongono limitazioni in termini di sovraespressione che potrebbero influenzare la regolazione a valle, il dosaggio genico e il ripiegamento proteico7. Inoltre, questi saggi non possono essere sfruttati per la regolazione posttrascrizionale come l'affezione dell'mRNA, la stabilità della trascrizione e l'effetto della regionenon tradotta 8,9.
Il sistema CRISPR-Cas9 consente un editing mirato del genoma nelle cellule viventi e negliorganismi 10. Attraverso un RNA a guida singola, Cas9 può indurre rotture a doppio filamento (DSB) nel DNA cromosomico a loci genomici specifici al fine di attivare due percorsi di riparazione del DNA: percorso di terminazione non disomologa (NHEJ) soggetto a errori e percorso di riparazione diretta dall'omologia (HDR) privo dierrori 11. L'HDR è un meccanismo di riparazione preciso; tuttavia, i DSB indotti dalla nucleasi Cas9 per HDR spesso si trae da mutazione indesiderata di inserimento ed eliminazione (indele). Inoltre, ha bisogno di modelli di DNA donatori omologhi per riparare i danni al DNA e ha un'efficienza relativamente bassa. Recentemente, la nickasi Cas9 (nCas9) è stata fusa con domini di deaminasi citidina per indirizzare le sostituzioni da C:G a T:A, senza la necessità di modelli di DNA omologhi e rotture a doppio filamento di DNA12,13,14,15. Utilizzando l'editor di base citosina, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per l'analisi funzionale delle varianti BRCA116.
In questo studio, abbiamo utilizzato l'editor di base di citosina mediato da CRISPR, BE314, che induce mutazioni puntili efficienti da C:G a T:A, per implementare la valutazione funzionale delle varianti BRCA1 e ha identificato con successo le funzioni di diverse varianti BRCA1 (Figura 1).
Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro per la valutazione funzionale. (A) Schema che mostra la valutazione funzionale di BRCA1. Poiché l'LOF di BRCA1 influisce sulla vitalità cellulare, quando la mutazione BRCA1 è patogena, le cellule muoiono all'aumentare del numero di passaggi. (B) Fasi della valutazione funzionale della BRCA1. La casella punteggiata è facoltativa. Può essere sostituito dalla co-trasfezione del GRNA che esprime e BE3 che esprime DNA di plasmidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
NOTA: il metodo 1 (generazione di linee cellulari HAP1-BE3) è facoltativo. Invece di costruire una linea cellulare che esprime BE3, il DNA plasmide codificante BE3 può essere co-trasfetto con DNA plasmide codificante con gRNA. Altre varianti di editor di base citosina, come BE4max, possono anche essere utilizzate per l'editing di base altamente efficiente.
1. Generazione di linee cellulari HAP1-BE3
- Costruzione di DNA plasmide
- Per costruire il DNA plasmide lentiBE3-blast per la produzione di lentivirus, amplificare le sequenze di codifica BE3 in pCMV-BE3(Table of Materials)da PCR utilizzando polimerasi ad alta fedeltà. Progettare il primer PCR in modo che contenga sequenze sovrapposte del vettore digerito (dal passaggio 1.1.2) per l'assemblaggio isotermico comesegue 17:
primer-F: 5'-TTTGCCGCCAGAACAGGACCGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3',
primer-R: 5'-CAGAGAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTCTTCTTCTTGGG-3'
NOTA: I nucleotidi mostrati in sottolineati sono sovrapposti al vettore digerito e queste sequenze saranno specifiche del vettore di destinazione scelto dall'utente. - Digerire il DNA plasmide lentiCas9-blast(Table of Materials)con gli enzimi di restrizione, XbaI e BamHI (1 unità per 1 μg) per 1 h a 37 °C. Eseguire il prodotto digerito su un gel di agarosio allo 0,8% e purificare le bande di dimensioni appropriate (8,6 kb) utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale(Table of Materials).
- Clonare il prodotto PCR BE3 amplificato e il vettore lentiCas9-Blast digerito utilizzando il kit di assemblaggio isotermico (Table of Materials). Utilizzare un totale di 0,02-0,5 pmol di frammenti di DNA e un rapporto 1:3 di vector:insert. Trasformare il prodotto di assemblaggio in celle DH5 alpha-competent18. Aggiungere i trasformatori su una piastra di agar contenente ampicillina (100 μg/mL) e incubare la piastra durante la notte a 37 °C.
- Raccogliere diverse colonie e inocularle in 4 mL di terreno LB (brodo di lisogenia) contenente ampicillina (100 μg/mL) e far crescere la coltura in un'incubatrice tremante a 180 giri/min.
- Purificare il DNA plasmide utilizzando un kit commerciale di purificazione del DNA plasmide(Table of Materials)secondo i protocolli del produttore.
- Per confermare il successo della clonazione del DNA, analizzare le sequenze BE3 di ogni DNA plasmide purificato (dal passaggio 1.1.5) sequenziando Sanger utilizzando primer standard e specifici be3 (Tabella complementare 1) e selezionare l'esatto costrutto di esplosione lentiBE3 clonato.
NOTA: Per analizzare i risultati del sequenziamento di Sanger, abbiamo consigliato diversi strumenti come BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) e CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
- Per costruire il DNA plasmide lentiBE3-blast per la produzione di lentivirus, amplificare le sequenze di codifica BE3 in pCMV-BE3(Table of Materials)da PCR utilizzando polimerasi ad alta fedeltà. Progettare il primer PCR in modo che contenga sequenze sovrapposte del vettore digerito (dal passaggio 1.1.2) per l'assemblaggio isotermico comesegue 17:
- Coltura cellulare e generazione di linee cellulari HAP1-BE3
- Mantenere le cellule in una condizione sana e in uno stato di divisione attiva. Cellule HAP1 di coltura nel mezzo di Dulbecco modificato di Iscove ( Tabella deimateriali) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina. Cellule DI coltura HEK293T/17 nel mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (Tabella dei Materiali) contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina.
NOTA: La cellula HAP1 è utile per la ricerca genetica perché è quasi cellule aploidi. Tuttavia, le cellule possono tornare spontaneamente a uno stato diploide nella coltura cellulare. L'arricchimento Hoechst 34580 macchiato 1n-popolazione utilizzando la citometria di flusso sarà utile per il mantenimento dell'aploidia delle cellule HAP119. - Semina 5 x 106 cellule HEK293T/17 su un piatto da 100 nm 1 giorno prima della trasfezione. Il giorno della trasfezione, trasfezionare il DNA plasmide (15 μg di lentiBE3-blast, 9 μg di psPAX2 per l'imballaggio virale e 6 μg di pMD2.G per busta di fiala di sistema di imballaggio lentiviraledi seconda generazione) utilizzando reagenti di trasfezione commerciale secondo i protocolli del produttore(Tabella dei materiali)20. Cambiare il mezzo a 6 ore dopo la trasfezione e raccogliere il mezzo contenente virus a 48 ore o 72 h dopo la trasfezione. Filtrare il supernatante utilizzando un filtro da 0,45 μm.
- Trasdurre le particelle lentivirali di BE3 nelle cellule HAP1 ad un MOI (molteplicità di infezione) di 0,1. Per adattarsi a un MOI appropriato, utilizzare concentrazioni di virus diluite in serie. Rimuovere il mezzo e sostituirlo con un supernatante virale regolato e un mezzo di coltura fresco.
- Un giorno dopo la trasduzione, modificare il mezzo a 10 μg/mL di mezzo contenente blastidina (Tabella deimateriali)e selezionare le cellule trasdutte per 3 giorni con blasticidina. Dopo la selezione della blastidina, selezionare un pozzo con ~10% di cellule sopravvissute per il passaggio successivo.
- Dopo la selezione della blastidina, seminare le cellule trasdute su piastre di 96 pozza ad una densità di 0,5 cellule/pozzo al fine di isolare singoli cloni (ad esempio, diluire 50 cellule in 20 mL (0,5 celle per 200 μL) mezzo di coltura e aliquota 200 μL per pozzo in 96 piastra del pozzo). Incubare le piastre a 96 pozzi per 2 settimane e scegliere le singole colonie per confermare l'attività BE3.
- Dividi le singole colonie in due set, uno per testare l'attività BE3 e l'altro per la manutenzione. Trasdurre le particelle lentivirali dei gRNA in uno degli insiemi per confermare l'attività BE3. Analizzare la frequenza di mutazione di ogni colonia utilizzando il saggio T7 endonucleasi I (T7E1, Table of Materials)o eseguendo la tecnica di sequenziamento profondo mirato (fase 4)21. Selezionare singoli cloni appropriati integri e con un BE3 altamente attivo.
NOTA: Per convalidare le frequenze esatte di mutazione, si consiglia il sequenziamento profondo mirato rispetto al saggio T7E1. HEK2 (5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-'3) è un sito di destinazione ben convalidato per BE3.
- Mantenere le cellule in una condizione sana e in uno stato di divisione attiva. Cellule HAP1 di coltura nel mezzo di Dulbecco modificato di Iscove ( Tabella deimateriali) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina. Cellule DI coltura HEK293T/17 nel mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (Tabella dei Materiali) contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina.
2. Progettazione e costruzione di BRCA1 destinati ai gRNA
Figura 2: Un esempio di DNA plasmide del gRNA. (A) Per modificare efficacemente la sequenza di destinazione con BE3, è necessario un PAM NGG (CCN PAM) che posiziona la destinazione C (destinazione G) all'interno di una finestra a cinque nucleotidi. NGG PAM viene visualizzato in rosso e la finestra di modifica di base è rappresentata da una casella grigia. (B) Viene indicata la sequenza di gRNA per la modifica di base c.8047C>T (H1283Y) e le coppie C:G di destinazione sono mostrate in rosso mentre la finestra attiva è evidenziata da una casella grigia. Per la clonazione del gRNA, le sequenze di sporgenza indicate in grassetto vengono aggiunte sia alle estremità 5ʹ'alto. I modelli per il gRNA sono stati generati ricottura dei due oligonucleotidi complementari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
NOTA: I controlli positivi e negativi delle varianti BRCA1 sono essenziali. In questo studio, c.5252G>A (R1751Q) e c.4527C>T (Y1509Y) sono usati come controlli benigni. c.191G>A (C64Y), 81-1G>A e c.3598C>T (Q1200*) sono usati come controlli patogeni. Le sequenze bersaglio di ciascun gRNA sono elencate nella tabella complementare 1.
- Ottenere la sequenza del genoma BRCA1 da GenBank a NCBI22.
- Cerca nei siti bersaglio a 20 bp la sequenza PAM (Protospacer Adjacent Motif) "NGG" e "CCN" intorno alla mutazione di interesse. La mutazione di interesse dovrebbe essere localizzata in 4-8 nucleotidi nell'estremità pam-distale delle sequenze bersaglio del gRNA a causa della finestra attiva di BE3 è di 4-8 nucleotidi nell'estremità pam-distale delle sequenze bersaglio del gRNA14. Nel caso di gRNA con destinazione c.8047C>T (H1283Y) e c.5252G>A (R1751Q), 5ʹ-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3ʹ e 5ʹ-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-3ʹ, le sequenze in grassetto sono finestre attive. Le conversioni da C a T e da G a A si verificano rispettivamente con NGG e CCN PAM (Figura 2A).
NOTA: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 è utile strumenti basati sul web per la progettazione di gRNA. - Ordinare due oligonucleotidi complementari per gRNA; per gli oligonucleotidi in avanti, aggiungere "CACCG" all'estremità 5ʹ della sequenza guida, e per gli oligonucleotidi inversi, aggiungere "AAAC" all'estremità 5 ' e "C" all'estremità 3 '. Queste sequenze aggiuntive sono specifiche del vettore di espressione gRNA di destinazione (dal passaggio 2.5) utilizzato per questo protocollo e gli utenti devono essere regolati per vettori di espressione gRNA alternativi (Figura 2B).
- Mescolare gli oligonucleotidi complementari in acqua distillata ad una concentrazione finale di 100 μM. Mescolare i due oligonucleotidi complementari ad una concentrazione finale di 10 μM con tampone di legatura T4 (Tabella deimateriali)e scaldarli a 95 °C per 5 minuti e raffreddarli a temperatura ambiente per la ricottura.
- Digerire pRG2 utilizzando l'enzima di restrizione BsaI (1 unità per 1 μg) per 1 h a 37 °C(Tabella dei materiali). Eseguire il prodotto digerito con gel di agarosio all'1% e purificare la banda di dimensioni appropriate (2,5 kb).
NOTA: Invece di utilizzare un metodo classico di digestione e legatura, è possibile utilizzare altri metodi di clonazione come la clonazione golden gate. - Legare il duplex oligonucleotide ricotto al DNA vettoriale utilizzando la ligasi del DNA acquistata (Tabella deimateriali)secondo il protocollo del produttore e trasformarli in cellule alfa-competenti DH5 (possono essere utilizzati anche altri ceppi E. coli ampiamente utilizzati per il sottocloning).
- Aggiungere i trasformatori a una piastra di agar contenente ampicillina (100 μg/mL) e incubare la piastra durante la notte a 37 °C. Purifica il DNA plasmide da diversi trasformatori e analizza le loro sequenze di gRNA sequenziando Sanger usando primer che si innescano al promotore U6(Table of Materials).
3. Creazione di varianti BRCA1 utilizzando strumenti di modifica di base mediati da CRISPR
NOTA: Se non vengono utilizzate linee cellulari HAP1-BE3, il DNA plasmide codificante BE3 può essere co-trasfetto con gRNA di targeting BRCA1. Rispetto alla co-trasfezione dei plasmidi BE3 e gRNA, la trasfezione del plasmide gRNA alle cellule HAP-BE3 induce un editing di base efficiente fino a 3 volte al locus bersaglio nelle nostre mani.
- Seme 5 x 105 cellule HAP1-BE3 (o cellule HAP1 in caso di metodi di co-trasfezione) per pozzo in piastre a 24 po porsi 1 giorno prima della trasfezione. Al momento della trasfezione, le cellule di coltura raggiungono una densità appropriata (confluenza del 70%-80%).
- Transfect BRCA1-targeting gRNA utilizzando i reagenti di trasfezione acquistati (Table of Materials) secondo il protocollo del produttore. Utilizzare 1 μg di gRNA di targeting BRCA1(con 1 μg di DNA plasmide codificante BE3 in caso di metodi di co-trasfezione) per indurre la conversione da C:G a T:A nei siti target BRCA1. Incubare le cellule a 37 °C e sottocultura ogni 3-4 giorni.
- Raccogliere i pellet cellulari 3, 10 e 24 giorni dopo la trasfezione per analizzare l'efficienza di editing di base (i campioni da 3 giorni dopo la trasfezione vengono analizzati riclassizzandosi come campioni del giorno 0).
- Estrarre il DNA genomico utilizzando il kit di purificazione genomica del DNA( Table of Materials).
NOTA: Si consiglia di ottimizzare le condizioni di trasfezione con rapporto variabile tra reagente e DNA. La condizione ottimale per la trasfezione HAP1 è la razione 4:1 di reagente al DNA nelle nostre mani.
4. Preparazione del campione per il sequenziamento illumina di nuova generazione (NGS)
Figura 3: Preparazione per il sequenziamento di nuova generazione. Il primer PCR 1st è stato progettato per amplificare il sito target BRCA1 sul DNA genomico. Il2° primer PCR è stato progettato in modo tale che le sue sequenze si trovino più all'interno delle 1st sequenze di primer PCR. Sequenze aggiuntive mostrate come barra gialla sono state aggiunte ad entrambele estremità del 2 ° primer PCR per collegare le sequenze essenziali per eseguire il sequenziamento di nuova generazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Progettare iprimir PCR 1 st per amplificare i siti di destinazione BRCA1. Sebbene non vi siano restrizioni sulle dimensioni del prodotto PCR 1st, si consiglia una dimensione del prodotto di <1 kb per amplificare in modo efficiente un'area specifica (Figura 3).
- Progetta i primir PCR2° situati all'interno del prodottoPCR 1 st. Si consideri la dimensione dell'amplicon in base alla lunghezza di lettura NGS (ad esempio, la dimensione del prodotto amplicon deve essere inferiore a 300 bp per 2 × 150 bp di esecuzionepaired-end per unire ogni lettura). Al fine di allegare sequenze essenziali per l'analisi NGS, aggiungere sequenze aggiuntive all'estremità 5' deiprimir PCR 2' come segue: per i primer forward, aggiungere 5 sequenze '-ACACTCTTTCCCTACACACCGCTCTTCCGATCT-3' all'estremità 5', e per i primer inversi, aggiungere 5'-GTGACTGTGTGTAGACGTGTGCTCTTCCG ATCT-3' all'estremità 5'.
NOTA: abbiamo usato PCR annidato per ridurre l'amplicon dell'associazione non specifica impedendo ai primer di attaccarsi a sequenze non di destinazione. - Amplificare i siti bersaglio BRCA1 sul DNA genomico ottenuto da tre punti di tempo. Utilizzare la polimerasi ad alta fedeltà secondo il protocollo del produttore per ridurre al minimo gli errori PCR. Per la reazione PCR1 st, utilizzare 100 ng di DNA genomico per l'amplificazione su 15 cicli. Per la secondareazione PCR, utilizzare 1 μL del prodotto PCR 1st per l'amplificazione su 20 cicli. Eseguire 5 μL del 2° prodotto PCR con il 2% di gel di agarosio e confermare le dimensioni.
- Al fine di collegare le sequenze essenziali per l'analisi NGS, amplificare ilsecondo prodotto PCR utilizzando i primer elencati di seguito. Per la reazione PCR, 1 μL del2 ° prodotto PCR viene utilizzato per l'amplificazione fino a 30 cicli utilizzando polimerasi ad alta fedeltà.
- Per eseguire il sequenziamento multiplex per un gran numero di librerie da raggruppare e sequenziare contemporaneamente, utilizzare primer forward (D501 – D508) e reverse (D701 – D712), che hanno una sequenza di indice univoca (Tabella supplementare 1). Amplifica ogni campione utilizzando diversi set di primer per condurre l'esclusiva strategia di doppia indicizzazione.
- Eseguire 5 μL del prodotto PCR con gel di agarosio al 2% per confermare le dimensioni e purificare l'amplicon utilizzando un kit di pulizia PCR commerciale(Table of Materials). Mescolare ogni campione in quantità uguali per creare una libreria NGS.
- Quantificare la libreria NGS a una lunghezza d'onda di 260 nm usando spettrofotometri e diluire la libreria NGS alla concentrazione di 1 nM usando tampone di resuspensione o Tris-HCl da 10 mM, pH 8,5. Preparare 100 μL della libreria diluita alla concentrazione di carico appropriata a seconda dei tipi di libreria (ad esempio, preparare 200 pM della libreria per Nextera DNA Flex).
- Come controllo, combinare phiX con il campione diluito appropriato per il tipo di kit.
- Caricare la libreria sulla cartuccia ed eseguire NGS in base al protocollo del produttore. I sistemi Illumina iSeq 100 o Miseq possono sequenziare gli ampliconi di varie lunghezze fino a 300 bp per l'estremità single-read o accoppiata. Abbiamo consigliato oltre 10.000 letture per amplicon target per un'analisi approfondita dell'efficienza di editing di base.
5. Analisi dell'efficienza di editing di base per la valutazione funzionale delle varianti BRCA1
- Analizzare le efficienze di modifica di base utilizzando MAUND24. L'efficienza di modifica di base viene calcolata come descritto di seguito.
Se nella finestra attiva be3 sono presenti più citosine, viene presa in considerazione solo la conversione da C a T destinata alla valutazione della variante BRCA1. Ad esempio, se le sequenze della finestra attiva BE3 sono "C4A5T6C7T8",le possibili sequenze generate dalla modifica di base sono "T4A5T6C7T8", "C4A5T6T7T8",e "T4A5T6T7T8". In questo momento, se la posizione 4 è la posizione di destinazione per la variante BRCA1 desiderata, allora solo la sequenza ""T4A5T6C7T8" è considerata per calcolare l'efficienza di editing di base.
NOTA: Si consigliano anche altri strumenti Web per l'analisi dell'attività di modifica di base come CRISPResso225e BE-analyzer23. - Verificare i risultati utilizzando controlli positivi e negativi delle varianti BRCA1. Le efficienze di modifica di base del controllo benigno dovrebbero rimanere le stesse, mentre quelle del controllo patogeno dovrebbero diminuire nel tempo.
- Calcolare l'efficienza di modifica di base relativa delle varianti BRCA1 e determinarne la patogenicità. Le differenze significative tra i campioni del giorno 0 e del giorno 21 vengono analizzate analisi statistiche appropriate come il test t.
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Representative Results
Gli approcci sperimentali descritti in questo protocollo consentono la valutazione funzionale delle varianti endogene BRCA1 generate dagli editor di base citosina basati su CRISPR. Per selezionare linee cellulari appropriate per la valutazione funzionale delle varianti BRCA1, i ricercatori dovrebbero confermare che BRCA1 è un gene essenziale nelle linee cellulari mirate. Ad esempio, abbiamo prima trasfetto Cas9 e gRNA in linee cellulari HAP1 per interrompere BRCA1 e analizzato le frequenze di mutazione con sequenziamento profondo mirato. La Corte ha riscontrato che le frequenze di mutazione sono diminuite significativamente nel tempo nelle linee cellulari HAP1 (Figura 4A). Questi risultati hanno dimostrato che BRCA1 è un gene essenziale per la vitalità cellulare nelle linee cellulari HAP1. Per indagare se le varianti sostituite da C:G a T:A influenzano la funzione di BRCA1, i plasmidi che codificano il DNA dei gRNA, che potrebbero indurre ogni mutazione, sono stati trasfetati nelle linee cellulari HAP1-BE3 e le frequenze di sostituzione sono state analizzate. Le frequenze di sostituzione relative di c.3598C>T (p. Q1200*), una variante patogena, sono diminuite drasticamente, mentre quelle di c.4527C>T (p.Y1509Y), una variante benigna, sono rimaste simili con il tempo(Figura 4B). Nel database ClinVar, c.154C>T (p. L52F), c.3847C>T (p.H1283Y) e c.5056C>T (p.H1686Y) di BRCA1 sono segnalati come varianti di significato incerto. Abbiamo analizzato la funzione di queste varianti utilizzando i metodi sopra menzionati e abbiamo scoperto che le frequenze di sostituzione dei nucleotidi di queste tre varianti sono diminuite in modo dipendente dal tempo (Figura 4B). Da questi risultati, le tre sostituzioni alterano la funzione BRCA1 e potrebbero essere classificate come mutazioni patogene.
Figura 4: Risultati rappresentativi dello studio funzionale di BRCA1 con sistemi CRISPR-Cas9. (A) L'interruzione di BRCA1 influisce sulla vitalità delle cellule. Le cellule HAP1 sono state trasfette con codifica plasmide spCas9 e due gRNA rivolte brca1, rispettivamente, e il sequenziamento profondo mirato è stato eseguito per l'analisi della vitalità cellulare. Le frequenze di mutazione di BRCA1 diminuirono in modo dipendente dal tempo nelle cellule trasfette da due gRNA indipendenti, e le frequenze di mutazione del CCR5, che era usato come controllo negativo, rimasero le stesse nel tempo. (B) Valutazioni funzionali di cinque varianti BRCA1. Le cellule HAP1-BE3 sono state trasfette con gRNA che inducevano rispettivamente mutazioni BRCA1 e il sequenziamento profondo mirato è stato eseguito per l'analisi della vitalità cellulare. Le frequenze di sostituzione relative sono diminuite in modo dipendente dal tempo nelle celle di c.3598C>T, c.154C>T, c.3847C>T e c.5056C>T e quelle di c.4527C>T sono rimaste invariate. Le barre di errore mostrano l'errore standard della media. Gli asterischi denotano valori P diversi: * P<0.05; ** P<0.005., n.s: non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive un metodo semplice per le valutazioni funzionali delle varianti BRCA1 utilizzando l'editor di base citosina meditato da CRISPR. Il protocollo descrive i metodi per la progettazione di gRNA al locus bersaglio e la costruzione dei DNA plasmidici da cui sono espressi. Gli editor di base citosina inducono la conversione nucleotidica in una finestra attiva (nel caso di BE3, nucleotidi 4-8 nell'estremità pam-distale delle sequenze bersaglio del gRNA). Il ricercatore dovrebbe scegliere attentamente le sequenze bersaglio perché tutte le citosine nella finestra attiva possono essere sostituite alle timine. Inoltre, come descritto nel passaggio 5, più citosi in una finestra attiva devono essere attentamente analizzate per valutare la funzione delle varianti BRCA1.
Uno dei passaggi più importanti è la trasfezione nella linea cellulare target, che influisce sulla frequenza di mutazione iniziale per le valutazioni funzionali BRCA1. Per migliorare la frequenza iniziale della mutazione, i ricercatori dovrebbero ottimizzare i metodi di consegna alla linea cellulare di interesse. Come descritto nel passaggio 1, la generazione di linee cellulari che esprimono BE3 è un'opzione utile per aumentare la frequenza iniziale della mutazione. Non raccomandiamo la trasduzione lentivirale del gRNA nelle cellule HAP1-BE3, perché l'espressione costitutiva di BE3 e gRNA potrebbe causare la conversione cumulativa del nucleotide, e questi risultati interferiscono con la valutazione funzionale delle varianti BRCA1.
Oltre ai metodi mediati BE3 introdotti in questo protocollo, si raccomandano diversi metodi complementari per estendere ulteriormente le valutazioni funzionali delle varianti BRCA1. In primo luogo, come descritto sopra, la frequenza di mutazione nel campione iniziale è importante per ottenere risultati sicuri delle varianti BRCA1. Per aumentare l'efficienza di modifica di base, si consigliano varianti di editor di base citosina, come BE4max. In secondo luogo, il BE3 riconosce la sequenza di DNA bersaglio attraverso le sequenze PAM 5'-NGG-3', che è una limitazione nella generazione di vari tipi di varianti BRCA1. Le varianti Cas9 sviluppate di recente con sequenze PAM modificate sono un'opzione utile in questo caso per estendere le varianti BRCA1 targetable 26,27,28. In terzo luogo, il BE3 induce un sostanziale editing di base in siti indesiderati e l'effetto fuori bersaglio potrebbe influenzare la valutazione funzionale delle varianti BRCA129,30,31. Per ridurre l'effetto off-target dell'BE3, i siti bersaglio dei gRNA dovrebbero essere scelti con cura senza sequenze simili nel genoma. SECURE-BE3 o YE1, che si è sviluppato per ridurre l'editing di base indesiderato nel genoma e nel trascritomasono utili opzione 32,33. Forth, un metodo di editing del genoma di saturazione (SGE) basato su HDR mediato da Cas9 è anche ottime opzioni per l'analisi funzionale delle varianti BRCA119. Il metodo non ha limiti per la selezione delle sequenze bersaglio e delle posizioni nucleotidiche delle varianti BRCA1. Tuttavia, l'approccio basato su HDR è relativamente meno efficiente degli editor di base e richiede inoltre la progettazione e la sintesi dei modelli di donatore14. Infine, le varianti BRCA1 derivate dal paziente includono vari intervallo di mutazioni come mutazioni puntili, inserimenti ed eliminazioni. Di queste, le mutazioni puntili sono la popolazione principale delle varianti BRCA1, che non sono solo conversioni da C:G a T:A, ma anche da A:T a G:C, da C:G a G:C e da A:T a T:A conversioni. Per le valutazioni funzionali di questo tipo di conversioni, gli editor di base adenosina mediati da CRISPR e i Prime Editor sono opzionipreziose 34,35. Il rapido sviluppo delle tecnologie di ingegneria del genoma consentirà valutazioni funzionali di varianti BRCA1 più diversificate.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Research Foundation of Korea (sovvenzioni 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 e 2018R1A5A2020732 a Y.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | NEB | R3136 | Restriction enzyme |
| Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | Drug for selecting transduced cells |
| BsaI | NEB | R0535 | Restriction enzyme |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | Genomic DNA prep. kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965092 | Medium for HEK293T/17 cells |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000036 | Supplemetal for cell culture |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | Gibson assembly kit |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium | Gibco | 12440046 | Medium for HAP1 cells |
| lentiCas9-Blast | Addgene | 52962 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Transfection materials |
| pCMV-BE3 | Addgene | 73021 | Plasmids DNA for lentiBE3 cloning |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | Supplemetal for cell culture |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530SQ | High-fidelity polymerase |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Plasmids DNA for virus prep. |
| pRG2 | Addgene | 104174 | gRNA cloning vector |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmids DNA for virus prep. |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | Plasmid DNA prep. Kit |
| QIAquick Gel extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel extraction kit |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR product prep. kit |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200 | Ligase for gRNA cloning |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Materials for T7E1 assay |
| XbaI | NEB | R0145 | Restriction enzyme |
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