Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את microcirculation כלילית ברקמת לב מורין חי על ידי ניטור ex vivo של לחץ זלוף העורקים וזרימה השומרת על הלחץ, כמו גם רכיבי עץ כלי דם כולל מיטות נימי pericytes, כמו עורק הספל הוא משומר ולחץ.
Abstract
טון עורקי כלילית יחד עם פתיחה או סגירה של נימים במידה רבה לקבוע את זרימת הדם cardiomyocytes בלחץ זלוף מתמיד. עם זאת, קשה לעקוב אחר השינויים הדינמיים של העורקים הכליליים ונימים בלב כולו, בעיקר בשל התנועה שלה פועם ללא הפסקה. כאן אנו מתארים שיטה המאפשרת ניטור של קצב זלוף העורקים, לחץ ושינויים בקוטר של העורקים ונימים בשרירי הפפילרי הימניים של העכבר. עורק מחיצת העכבר הוא cannulated ו perfused בזרימה מתמדת או לחץ עם האחר נמדד באופן דינמי. לאחר זלוף עם לקטין שכותרתו פלואורסצנטית (למשל, אלקסה פלואור-488 או -633 שכותרתו חיטה-נבט Agglutinin, WGA), העורקים ונימים (וכלי דם אחרים) בשריר פפילרי החדר הימני מחיצה יכול להיות בתמונה בקלות. לאחר מכן ניתן למדוד את השינויים בקוטר כלי השיט בנוכחות או בהיעדר התכווצויות לב. כאשר חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית באו לידי ביטוי, ניתן היה לפקח על תכונות ספציפיות. לדוגמה, פריטיטים הוצגו בלבבות עכברים שהביעו NG2-DsRed. שיטה זו סיפקה פלטפורמה שימושית כדי ללמוד את הפונקציות הפיזיולוגיות של pericytes נימי בלב. הוא מתאים גם לחקר ההשפעה של ריאגנטים על זרימת הדם בלב על ידי מדידת קוטר כלי הדם / נימי ואת הלחץ הזוהר העורקי בו זמנית. הכנה זו, בשילוב עם מערכת הדמיה אופטית מתקדמת, מאפשרת לחקור את זרימת הדם ואת שליטתה ברמה התאית והמולקולרית בלב בתנאים כמעט פיזיולוגיים.
Introduction
תקנה מתאימה לזרימת לחץ כלילית מבטיחה אספקת דם מספקת ללב כדי לענות על דרישותיו המטבוליות1. עם זאת, רק לאחרונה התברר כיצד זרימת הלחץ הכלילי מוסדר באופן דינמי בלב, למרות מחקרים מקיפים שבוצעו ב vivo ו במבחנה בעשורים האחרונים. אחת הסיבות לכך היא הקושי להקים מודל עבודה פיזיולוגי למחקרים כאלה עקב פעימות הלב המתמידות. ללא קשר, הוקמו מגוון שיטות לתצפית על כלי הדם הכליליים ברקמות או בבעלי חיים חיים, אך אף אחת משיטות אלה לא הצליחה להשיג מיקוד קבוע /יציב ומדידות הלחץ, הזרימה וקוטר המיקרו-וסקולרי בו זמנית2,3. ההדמיה הישירה של כלי הדם העורקיים הכליליים בלב פועם הוצגה לפני עשרות שנים4,3, אבל מדידות הקוטר בכלי קטן היה מאתגר ואת הפונקציות הספציפיות של סוגי תאים מיוחדים רבים הקשורים microcirculation היה מרגיז באותה מידה. אפילו השיטה סטרובוסקופית ומערכת אובייקטיבית צפה לא יכול לספק את המידע לעיל בו זמנית5. עם זאת, כמות משמעותית של מידע בעל ערך הושגה באמצעות הטכנולוגיות הנ"ל, אשר עזרו לנו להבין יותר על הרגולציה של זרימת דם כלילית6. השיטה שאנו מתארים במאמר זה תסייע לאחת לחקור ולהבין בפירוט כיצד רכיבים של עורקים כליליים, העורקים והמיקרו-וסקולטורה מגיבים באופן שונה לגירויים ולדרישות מטבוליות.
מודל העבודה שהקמנו כדי להמשיך במחקרים אלה נבנה על העבודה הקודמת של ווסטרהוף ואח'2. בעקבות קנולציה של עורק המחיצה של לב העכבר, תמיסת מלח פיזיולוגית שימשה כדי להחדיר את העורק כדי לשמור על myocytes ורכיבים אחרים של רקמת הלב ניזונו. לחץ הזלוף העורקי, הזרימה וקוטר כלי הדם היו במעקב בין פונקציות פיזיולוגיות אחרות באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים מתאימים. שיטה זו מאפשרת לנו לדמיין את מיטת המיקרו-כלילית תחת לחץ פיזיולוגי ברקמה חיה וללמוד לראשונה את המנגנונים התאיים שבבסיס ויסות המיקרו-סירקולציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הטיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות של אוניברסיטת מרילנד בולטימור והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרה פרוטוקולים.
1. הכנת הפתרונות
הערה: הכינו פתרונות מראש. שני סוגים של פתרונות בסיסיים משמשים בניסויים: (1) פתרונות מלוחים פיזיולוגיים (PSS) עבור superfusate אמבטיה ו (2) הפתרונות של טירודה עבור לומן perfusate. מבעבע מתמשך עם CO 2 ישצורך לשמור על ה- pH של PSS. הפתרון של Tyrode HEPES-אגירה משמש לומן במקום PSS כדי למנוע בועות הולך לתוך כלי, שכן בועות יפגעו בתאי האנדותל7 ולחסן את הזרימה.
- פתרון PSS: ראה את הנוסחה וההרכב של פתרון PSS בטבלה 1. הפוך 10 L של Ca2 +ללא גלוקוז PSS מלאי פתרון ולאחסן בטמפרטורת החדר. 1 שעה לפני כל הליך, להוציא 1 L של פתרון המניה בועה עם 5% CO2 (74% N2 ו 21% O2) כדי לשמור על ה- pH של הפתרון ב ~ 7.4. הוסף 1.8 גרם גלוקוז ו 1.8 מ"ל CaCl2 (1 M מלאי)8.
הערה: הוסף Ca2+ רק לאחר מבעבע כאשר pH הוא ~ 7.4, אחרת, Ca2 + יהיה זירז. - הפתרון של Tyrode: ראה את הנוסחה וההרכב של הפתרון של Tyrode בטבלה 1. לסנן את הפתרון (0.22 מיקרומטר) ומאוחסן ב 4 °C (69 °F) לשימוש עתידי9.
- הפתרון של Tyrode עם BDM (2,3-בוטנדיונה monoxime): להוסיף BDM כמעכב myofilament הפיך כדי למנוע התכווצות של myocytes10. לשקול 600 מ"ג BDM ולהוסיף 200 מ"ל של הפתרון של Tyrode. מערבבים את הפתרון עם BDM עד שהוא מומס לחלוטין. אין צורך בסינון נוסף.
- אחסן את הפתרון של Tyrode המכיל BDM ב 4 °C (60 °F) לשימוש עתידי.
2. הכנה קאמרית
- מעיל הן תא ניתוח תא ניסיוני מראש עם polydimethylsiloxane (PDMS) בעקבות ההוראות שסופקו על ידי היצרן.
- מלאו את תא הניתוק בתמיסה של Tyrode המכילה BDM.
- הפעל את הצ'ילר 1 שעה לפני ההליך. הגדר את הטמפרטורה ב 4 מעלות צלזיוס.
3. הכנת קנולה
- הפעל את פולר המיקרופיפט. בחר את ההגדרות בהתאם להוראות היצרן.
- קח צינור זכוכית בורוסיליקט נקי (הקוטר החיצוני והפנימי של צינורות הזכוכית המשמשים היה 1.2 מ"מ ו 0.69 מ"מ בהתאמה).
- הכנס צינור זכוכית לתוך מלחציים מחורצים של פולטר סאטר פיפטה עם חוט חימום פלטינה בצורת U.
- הפעל את המושך כדי לייצר שתי קנולה, כל אחד עם קצה דק ארוך.
- חותכים את הקצה של כל קנולה באמצעות זוג דק של מספריים תחת מיקרוסקופ לנתח כדי להפוך את הקוטר הסופי של הקצה סביב 100 כדי 150 מיקרומטר.
- אש ללטש את קצה הצינורית לחתוך מעט סביב הקצוות החדים.
- לכופף את הצינורית לאורך הפיר באמצעות חוט פלטינה (מחומם עם שליטה עדינה) ממוקם בצד של הפיר כ 2 מ"מ מקצה. הזווית של העיקול בקנולה צריכה להיות סביב 45 מעלות.
- הכנס את הקצה הפתוח של הצינורית למחזיק תא מיוגרף הלחץ והדק את המדידה. חבר מזרק 5 מ"ל מלא עם הפתרון של Tyrode לצד השני של המדידה. חברו את הצינורית למיקרו-מניפולטור המותקן בתא (ראו איור 1 ואיור 2).
- ממלאים את הצינור בתמיסה של Tyrode באמצעות המזרק (5 מ"ל), שוטפים אותו, את הצינור ואת המחבר של בועות אוויר.
- לפני פרוצדורת הצינור, מדדו את לחץ הזלוף בתוך הצינורית על פני טווח זרימה נתון (50 עד 300 μL/min, איור 3). עשה זאת רק כאשר נעשה שימוש בקנולה חדשה.
הערה: לחץ הזלוף בתוך הצינורית פרופורציונלי לזרימה ומותאם ליניארי(איור 3).
4. חילוץ לב העכבר
- שים עכבר C57BL/6 (או מין, 8-16 שבועות) בתיבת ההרדמה המחוברת למיכלי isoflurane וחמצן.
- הפעל מיכל חמצן ולהתחיל את זרימת isoflurane. המתן ~ 5 דקות עד שהעכבר מורדם לחלוטין.
- לאחר הרדמה הוקמה, להוציא את העכבר מתוך תיבת הרדמה ולהזריק הפרין IP (לתוך חלל הצפק, 360 יחידות, 0.5 מ"ל / עכבר) כדי למנוע היווצרות קריש דם בכלי הדם. ואז להחזיר את העכבר לתיבת ההרדמה.
- 10 דקות לאחר הפרין כבר מוזרק, להזיז את העכבר למיטה מחוממת בתנוחה סופית לייצב את כפותיו באמצעות סרט תיוג. שמור את העכבר תחת הרדמה מלאה עם isoflurane באמצעות חרוט האף.
- הרם את עור הבטן של העכבר מעל הסרעפת עם מלקחיים והשתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך ולחשוף את הסרעפת.
- חותכים את הסרעפת ואת עצם החזה. פתח את החזה.
- לנתח את הלב מתוך חלל בית החזה, חיתוך קרוב ככל האפשר לקיר בית החזה הגבי.
- מניחים את הלב לתוך הפתרון של Tyrode קר כקרח המכיל 30 מ"מ BDM.
- נקה את הלב כדי להסיר את רקמות החיבור כגון ריאות.
- מעבירים את הלב לתא הניתוק המצונן מראש, המלא בתמיסה של טיירוד המכילה 30 מ"מ BDM.
5. הכנה וקנציה של עורק מחיצה
- תדליק את משאבת הסרוו. הגדר את משאבת הסרוו למצב "זרימה". תן לו לרוץ במהירות גבוהה עד הצינור מלא עם הפתרון של Tyrode שישמש כדי לחלחל לומן כלי הדם. ודא שאין בועות בצינורות. אז תנמיך את המהירות.
- הצמד את הלב אל PDMS, הימנעות כל נזק לאזור האמצעי של הלב.
- הסר גם את האטריה הימנית וגם השמאלית. חותכים לפתוח את החדר הימני ולהסיר את הקיר הימני ללא חדרית באמצעות מיקרוסקופ מנתח.
- לחשוף ולזהות את עורק המחיצה. מניחים חוט ניילון (קוטר 30 מיקרומטר) מתחת לעורק המחיצה וקושרים קשר רופף לשימוש עתידי.
הערה: ניתן לזהות בקלות את עורק המחיצה באמצעות מיקרוסקופ מנתח. עורק המחיצה הוא עורק ראשי על מחיצה שמקורו בעורק הכלילי הנכון ברוב המקרים. - הסר את הקיר השמאלי ללא חדרים באמצעות מספריים עדינות.
- מעבירים את הכנת שריר הפפילרי לתא הניסוי שבו הוצבה הצינורית. התא מלא בתמיסה של טיירוד המכילה BDM. החלק התחתון של תא זה מצופה בשכבה דקה (~ 2 מ"מ) של PDMS.
- להתאים את המיקום של הצינורית (באמצעות micromanipulator) כדי לאפשר קנולציה של עורק המחיצה. הדק את הקשר.
- לאבטח את שריר הפפילרי באמצעות סיכות קטנות לרצפת התא, כך המטרה מיקרוסקופ יש תצוגה ברורה של כלי הדם. שימו לב לזווית ולמיקום הצינורית והבטיחו שקצה הצינורית מקביל לקיר העורקים.
- בדיקת קנולציה על ידי גירוש הדרגתי של הפתרון מהמזרק דרך הצינורית. אם כל האלמנטים לתפקד כראוי, שאריות דם בשריר הפפילרי ייצא הרקמה בתחילת תהליך זה ורק הפתרון של Tyrode ייראה מאוחר יותר.
6. ייצוב ההכנה
- הפעל את המשאבה peristaltic שיספק את פתרון superfusion. ואז כל הזמן superfuse ההכנה באמבטיה עם PSS גזים מראש בקצב של 3-4 מ"ל / דקה.
- הפעל את בקר הטמפרטורה עבור פתרון superfusion. להתאים את הטמפרטורה של superfusate האמבטיה ~ 35-37 מעלות צלזיוס.
- חבר את הצינורית למשאבת הסרוו. קרא את הלחץ המוצג על בקר סרוו הלחץ.
- לפקח על הזרימה והלחץ. הזרימה (μL/min) ולחץ זלוף העורקים (מ"מ ח"ג) הם דיגיטציה באמצעות דיגיטייזר ומתועדים באמצעות תוכנה משויכת (איור 2).
- להתאים את הזרימה כדי להגדיר את הלחץ ~ 10 מ"מ ש"ג ולתת לו לרוץ במשך ~ 10 דקות.
- להגביר את זרימת הפתרון הזוהר כדי להפוך את הלחץ של העורק ~ 60 מ"מ.ג. השג את לחץ הזלוף הסופי של העורק עצמו על ידי חיסור טיפת הלחץ של הצינורית (איור 3).
הערה: אם מצב "לחץ" על בקר סרוו לחץ נבחר, הלחץ הזוהר מוגדר ~ 60 מ"מ ח"ג לניסויים אלה. לאחר מכן נטר את שינוי הזרימה. - תן לדגימה לייצב ~ 30-60 דקות על ידי ניטור רמות הזרימה ו / או הלחץ. עלייה הדרגתית של לחץ עורקי נצפתה בדרך כלל בתחילת זלוף לאחר קנולציה. מדינה יציבה חדשה תקום מעצמה ב-30 דקות(איור 4).
- ליזום ניסוי לאחר לחץ זלוף מיוצב (בזרימה מתמדת).
7. טעינת ההכנה עם אגלוטינין נבט חיטה מתויג פלואורסצנטי (WGA)
- הכן את הפתרון של Tyrode המכיל אלקסה-פלואור-488 מצומד WGA על ידי הוספת 100 מיקרוגרם של WGA מצומד לתוך 5 מ"ל של הפתרון של Tyrode.
- בזהירות לעבור perfusate מן הפתרון של Tyrode נורמלי אחד המכיל WGA מתויג פלואורסצנטי. חשוב להחליף בזהירות את perfusate, כך בועות לא הציגו.
- לאחר ~ 30 דקות של זלוף WGA או כאשר פתרון WGA עומד להיגמר, לשנות את perfusate בחזרה לפתרון הרגיל של Tyrode.
8. הדמיה קונפוקלית של עורקים ונימים
- הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלית של דיסק Nipkow.
- השתמש במיקרוסקופ כדי לאתר את עורק המחיצה באמצעות מטרת הספק נמוך (4x) במצב אור משודר.
הערה: עורק Septal יכול להיות ממוקם על ידי ביצוע המיקום של הצינורית. - התחל הדמיה confocal עם confocal דיסק מסתובב ובחר לייזר עירור 488 ננומטר, הגדלה אובייקטיבית 40x ולהתאים את עוצמת הלייזר ואת קצב הדגימה (10 - 500 ms לתמונה).
- הגדר עמדות דימות עליונות ותחתונות עבור המיקרוסקופ הקונפוקאלי כדי להגדיר את טווח ההדמיה והזן את הפרמטרים עבור הדמיית מחסנית z.
- הגדר את גודל השלב כפי שהומלץ עבור המערכת הנמצאת בשימוש או הגדר את גודל השלב כרצונך.
- בחר בהגדרות של הגדרת מחסנית z ו/או הגדרות סידרת הזמן.
- בחר או הגדר תיקיה חדשה לאחסון התמונה החדשה.
- לחץ על "הפעל" כדי להתחיל להקליט הדמיה לניתוח עתידי (איור 5).
9. ניסוי vasodilator לדוגמה: vasodilation הנגרמת על ידי פינצ'ידיל (וידאו 1).
- הכן פתרון מלאי פינצ'ידיל (100 מ"מ ב- DMSO) ומאוחסן ב- 4 °C (60 °F).
- הכן 10 מ"ל של הפתרון של Tyrode. הוסף 10 μL של פתרון מניית pinacidil כדי להפוך את הריכוז הסופי של pinacidil 100 μM.
- תמונה שריר הפפילרי בהגדלה נמוכה (4x המטרה) כדי לכלול את עורק המחיצה ואת עורקי הענף.
- החלף פתרון לומינלי לפינצ'ידיל המכיל פתרון.
10. ניסויים לדוגמה לבקרת זרימת דם: לחץ זלוף עורקי הנגרם על ידי vasoconstrictor עולה בזרימה מתמדת (איור 6)
- הכינו פתרון מלאי אנדותלין-1 (ET-1) (10 מיקרומטר) ומאוחסנים ב-20°C(20°C).
- הכן 10 מ"ל של הפתרון של Tyrode. הוסף 10 μL של פתרון מניית ET-1 (10 מיקרומטר) כדי להפוך את הריכוז הסופי של ET-1 10 nM.
- להקליט את הלחץ הזוהר עם זרימה מתמדת תמונה שריר הפפילרי.
- החלף פתרון לומינלי לפתרון המכיל ET-1.
11. תמונות לדוגמה של נימי עם פריצילים (איור 7)
- להקריב עכבר מהונדס NG2DsRedBAC כמתואר בסעיף 4 של פרוטוקול זה.
- לחלץ את הלב, cannulate את עורק המחיצה ולטעון את המדגם עם Alexa-Fluor-488 מצומד WGA בעקבות פרוטוקולים 5-7.
- תמונה שריר הפפילרי ב 488 ננומטר ו 560 ננומטר עירור, ו 510-525 ננומטר, 575-625 ננומטר פליטה באמצעות confocal. לחץ העורקים יהיה סביב 40 מ"מ.ג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאשר סמן כלי דם פלואורסצנטי הוא perfused לומן כלי דם (כאן WGA מצומד עם Alexa Fluor-488), ניתן לדמיין עצי כלי דם שלמים כפי שמוצג באיור 5 (פאנל שמאלי) באמצעות מיקרוסקופ confocal במהירות גבוהה. הגדלה נוספת מאפשרת הדמיה של נימי בפירוט(איור 5, לוח ימני). מאז המערכת בלחץ תומך ניטור מתמיד של לחץ לומינלי, הכנה זו יכולה לשמש לשינויים עמית בקוטר העורקים עם לחץ עורקי. וידאו 1 מראה כי כאשר pinacidil, ATP רגיש K+ ערוץ (KATP)אגוניסט הוגש מן לומן, קוטר העורקים הוגדלה. איור 6 מראה שכאשר יושם vasoconstrictor ET-1 מהלומן, קוטר העורקים ירד, והלחץ הזוהר הוגבר כאשר הזרימה נקבעה קבועה.
בשל יכולות ברזולוציה גבוהה של מיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם סמני תא ספציפיים, הליך זה יכול לשמש גם כדי לדמיין סוגי תאים רבים אחרים הקשורים microcirculation. כאן, השתמשנו בעכבר (עכבר מהונדס NG2DsRedBAC) המבטא חלבון פלואורסצנטי DsRed תחת מקדם ספציפי pericyte (NG2) ותייג את כלי עם WGA-Alexa Fluor 488. זה מאפשר לנו לדמיין בו זמנית גם את הנימים (הירוקים) וגם את הצמיגים (אדום) בשריר הפפילארי של העכבר (איור 7) בתנאים שמחקות טוב יותר את הפיזיולוגיה בבעלי חיים חיים.
איור 1: כינון עורק המחיצה של העכבר.
(A) תמונת אור משודרת מציגה דוגמה לשריר הפפילרי המזנון. מיקרומניפולטור, קנולה ודגימה (מחיצה עם שריר הפפילרי הימני) מסומנים כתוויות. (B) מדגם זום ב- A מראה את שריר הפפילרי ואת עורק המחיצה הקנונית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ציוד ששימש בכל הניסויים.
(A)המרכיבים העיקריים של ההתקנה המשמשים בניסוי. (B) הדיאגרמה ממחישה את הקשרים בין הכנת שריר הפפילרי לבין ציוד הניסוי לבקרה פיזיולוגית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מדידת לחץ בתוך הצינורית.
(A) דוגמה כדי להראות כיצד התנגדות קנולה נקבעה על ידי מדידת לחץ בתוך הצינורית על פני טווח של זרימה (50-300 μl / min). (B) היחסים של הלחץ בתוך הצינורית עם זרימה מ 6 קנולה. הלחץ בתוך הצינורית היה פרופורציונלי לזרימה והיה כשיר על ידי הביטוי Pc = 0.08f-12.25, שבו Pc כמו לחץ בתוך הצינורית, f כמו זרימה. N = 6 קנולה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: לחץ זלוף משתנה במהלך התייצבות בזרימה מתמדת.
(A)הקלטה טיפוסית של לחץ זלוף במהלך ייצוב בזרימה מתמדת (~ 250 μL / min). שים לב לעלייה בלחץ זלוף לאחר 30 דקות של ייצוב. (B) הסטטיסטיקה מראה את לחץ הזלוף לפני ואחרי הייצוב כאשר הטון פותח. הזרימה הממוצעת של העורקים כדי לשמור על הלחץ הראשוני (~ 60 מ"מ ח"ג) היא 201.7 ± 8.6 μL / min (n = 45 עכברים). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הדמיה של נימים ועורקים.
(A) התמונה מציגה את העורקים ונימים שהיו עמוסים נבט חיטה agglutinin (WGA). (B) הגדלת התצוגה של האזור בתיבה ב- A. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ET-1 מגביר את הלחץ הזוהר ומפחית את קוטר העורקים.
(A)קוטר העורקים השתנה עם היישום של ET-1 (10 nM). (ב)פרופילי הפלואורסצנטיות של WGA המראים את שינוי הקוטר על ידי ET-1. קוטר העורק בא לידי ביטוי במרחק שבין עוצמת השיא של הפלואורסצנטיות על דופן העורקים. (C)הלחץ הלומינלי גדל בנוכחות ET-1 (10 nM) בזרימה מתמדת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: נימי עם פריצילים מעכבר NG2-DsRed.
פריציטים לב (אדום) ונימים (ירוק) צולמו בלחץ (40 מ"מ-ח"ג) ועכבר מחודד שריר פפילר ימני. החלונית הימנית, התמונות המוגדלות של האזורים הארוזים בחלוניות השמאליות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: כלי דם הנגרמים על ידי פינצ'ידיל. פינצ'ידיל (100 מיקרומטר) הוחל מהלומן. וסודיליציה נראתה בעץ העורקים. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
| ההרכב של תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS) | |||
| ריאגנטים | ריכוז סופי (mM) | משקל מולקולרי | g/10 ליטר |
| נקלה (נקל) | 112 | 58.44 | 65.45 |
| KCl | 5 | 74.55 | 3.73 |
| MgSO4 | 1.2 | 120.37 | 1.44 |
| NaH2PO4 | 1.2 | 119.98 | 1.44 |
| נהקו3 | 24 | 84.01 | 20.16 |
| גלוקוז | 10 | 180.16 | להוסיף 1.8 גרם גלוקוז 1 ליטר PSS לפני השימוש |
| CaCl2 | 1.8 | 110.99 | להוסיף 1.8 מ"ל 1 M CaCl2 כדי 1 ליטר PSS לפני השימוש |
| הרכב הפתרון של טיירוד | |||
| ריאגנטים | ריכוז סופי (mM) | משקל מולקולרי | ז/ל |
| נקלה (נקל) | 140 | 58.44 | 8.18 |
| KCl | 5 | 74.55 | 0.37 |
| NaH2PO4 | 0.33 | 119.98 | 0.04 |
| היפס (היפס) | 10 | 238.3 | 2.38 |
| גלוקוז | 5.5 | 180.16 | 0.99 |
| CaCl2 | 1.8 | 110.99 | להוסיף 1.8 מ"ל 1 M CaCl2 פתרון |
| MgCl2.6H2O | 0.5 | 203.3 | להוסיף 0.5 מ"ל 1 M פתרון MgCl2 |
| הערה: כוונן את ה-pH ל-7.4 עם 1 M NaOH. | |||
טבלה 1: הרכב הפתרונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבודה הנוכחית, הצגנו שיטת אקס ויו פשוטה להפליא אך מעשית מאוד לחקר המיקרו-סירקולציה כלילית בלב בתנאים פיזיולוגיים. שיטה זו שונתה מחקירות מכניות באמצעות חולדות2. התוספת המאתגרת הייתה טכנולוגיית ההדמיה במהירות גבוהה וברזולוציה אופטית גבוהה. לכן, הצלחנו לנצל את מערכות ההדמיה האופטית המתקדמות הזמינות כיום באופן מסחרי. על ידי ניתוח זהיר ומיקום של הכנת שריר הפפילרי מתפקד בתנוחה חיובית, הצלחנו לדמיין arterioles, עורקים נימי מראש, נימים, ו venules, כמו גם את pericytes והצליחו למדוד לחץ עורקי ו / או זרימה תוך שליטה על השני. השינויים בקוטר העורקים ונימי היו במעקב באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב גבוה. השילוב של התמונות האופטיות והזלוף הפנימי של תמיסת מלח פיזיולוגית הופך את ההכנה הזו לעוזרת בהערכת השפעת הטיפולים הביו-רפואיים, כמו גם בחקר המנגנונים המעורבים בוויסות הפיזיולוגי והפתולוגי של זרימת הדם בלב1.
שרירי הפפילרי הלב היו בשימוש נרחב במחקר של פיזיולוגיה לב במשך שנים רבות. עם זאת, היעדר זלוף גורע מן הפיזיולוגיה אם מאפיינים של "עבודה" או "מטבוליזם" או "פעילות חשמלית" נחשבים. ברור, שרירים פפילריים שאינם perfused הם כמובן לא פיזיולוגיים. אף על פי כן, לפני עשרות שנים, Westerhof ואח 'עשה את ההכנה papillary דק בלחץ מן החולדה ללמוד את תקנת זרימת הדם2, אבל הכנה זו לא שימשה בעכברים כפי שעשינו כאן, בשל קשיי הטיפול. חוקרים אלה גם לא הצליחו לדמיין את הפרטים הדרושים כדי לקבוע כיצד התרחשה ויסות זרימת הדם. התמזל מזלנו שעורק המעי הגס של העכבר הוא בקוטר של כ -100 מיקרומטר בלחץ זלוף של ~ 60 מ"מ מ"ג, קטן מזה בחולדה, אך גדול מספיק לעבודתנו. כהערה מעשית, יש לתת תשומת לב מיוחדת להכנת הצינורית והצינורות המחוברים. הימנעו מבועות בצינורות ובקנולה. בועות נלכדות בקלות באזור המחובר וחוסמות או מעוותות את זרימת הדם. לכן, בדוק שוב אזורים אלה. בנוסף, זה יהיה מועיל להשתמש קנולה עם קצה גדול יחסית כל עוד הוא קטן מספיק כדי להיכנס לעורק, כי קנולה גדולה שומרת על העורק פתוח ומאפשר זרימה חלקה. אם נצפתה עלייה פתאומית ובלתי צפויה בלחץ (בזרימה מתמדת) במהלך ההקלטה, סביר מאוד שקצה הצינורית נדבק לקיר העורקים או שהקנולה נחסמה על ידי פסולת רקמה. לכן, המיקום של הצינורית חשוב מאוד לשמור על זרימה ולחץ יציב. ככל שהקנולציה מהירה יותר, כך טוב יותר לרקמה. זה מוביל להתאוששות מהירה יותר של הפונקציה הפיזיולוגית שלה. אנו ממליצים כי הזמן בילה על קנול לא יעלה ~ 45 דקות (מיצוי הלב עד להשלמת cannulation).
עם זאת זהיר אחד יכול להיות, שיטה זו פשוטה לכאורה לוקח בפועל כדי מושלמת. לפעמים ההכנה אינה מגיבה לכל גירוי, ללא קשר לטיפול שנלקח במהלך הניתוח או המהירות והיעילות של ההליך כולו. טמפרטורת האמבטיה צריכה להיות קבועה בין 35 ל 37 מעלות צלזיוס. דבר חשוב נוסף הוא להפעיל בדיקת ייחוס שגרתית לתפקוד רקמות (לדוגמה, התגובה ל- KCl) עבור כל ניסוי, לפני או אחרי שהניסוי שלך נעשה. אנו משתמשים ב-ET-1 או KCl (70 מ"מ) כהפניות. לבסוף, חשוב מאוד לבדוק ולקבוע כי הצינורית עדיין במקום כאשר הניסוי נעשה. התעלם מהנתונים אם הצינורית אינה במקומה או אם העורק שבור או מעוות על ידי קצה הצינורית. שני דברים חשובים שראוי לציין מתמקדים ב"תנועת ההכנה" וב"ניתוח נתונים". גם ב"שקט", ההכנה עדיין זזה (וידאו 1). תנועה מינורית אינה בעיה עבור הדמיה קונפוקלית של דיסק מסתובב במהירות גבוהה. הורדת לחץ זלוף או שימוש חוסמי ערוץ Na+ יכול למנוע או למזער את התנועה מבלי להפריע לתפקוד כלי microvascular. עשינו ניתוח לא מקוון של הנתונים שנרכשו באמצעות ImageJ-win64 (פיג'י) ו / או MATLAB עם תוכנה מותאמת אישית למדידות קוטר כלי שיט. איננו מפרטים את ניתוח הקוטר כאן מכיוון שכל תוכנה (למשל, Vasotracker11 ) אמורה להיות מסוגלת לנתח את השינויים בקוטר.
על ידי שילוב של חקירות פיזיולוגיות עם טכניקות הדמיה אופטית מיקרוסקופיה קונפוקלית במהירות גבוהה, הכנה זו יכולה להיות בשימוש נרחב 1) לבדוק את ההשפעה הרגולטורית של תרופות חדשות על זרימת הדם בלב; 2) מחקר תקשורת בין תאית (בין ובין קרדיומיוציטים, תאי אנדותל נימיים, pericytes ותאי שריר חלקים עורקיים, פיברובלסטים); ו -3) למד את השינוי הפונקציונלי הדינמי של סוגי תאים שונים באמצעות עכברים מהונדסים מתויגים פלואורסצנטיים1. שיטה זו כוללת הדמיה של חלקים מרקמת הלב עם רשתות תחת פיזיולוגיה "קרובה". למרות שאנו עשויים להיות מסוגלים לחקות בתנאי vivo על ידי צעד ההכנה ו / או כולל כמה כדוריות דם אדומות perfusate, זה לא יכול להחליף הדמיה vivo אמיתי עם מגוון רחב של נטל חילוף החומרים והעבודה. זה לא יכול לשמש על בעלי החיים הגדולים גם בשל עומק מוגבל של תצוגה של מיקרוסקופ confocal. עם זאת, זה צריך להיות כלי שימושי בחקר המנגנונים המולקולריים והתאית שבבסיס ויסות מיקרו-סירקולציה כלילית בבעלי חיים קטנים כולל עכבר וחולדה. רעיונות דומים ניתן להרחיב ולאמץ במחקר של בקרת זרימת הדם ברקמות או איברים אחרים כולל אך לא מוגבל למערכת העיכול, הלבלב, בלוטת התריס, בלוטות הלימפה, הכבד, הכליות, שריר השלד, המוח12, רשתית, גרעינים, עצם, עור, רחם, האשכים, השחלות, יותרת הכליה, שומן וכו '. גישה זו תשפר ותקדם את ההבנה של בקרת זרימת הדם ומנגנונים רגולטוריים ברמות התאיות והמולקולריות בתנאים פיזיולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המרכז להנדסה וטכנולוגיה ביו-רפואית (BioMET); NIH (1U01HL1116321) ו -(1R01HL142290) ואיגוד הלב האמריקאי 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (בג"ץ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
References
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
