Summary
我们提出了一种通过大鼠髓圆锥横断建立逼尿肌活动不足模型的方法。在这些动物中成功刺激了逼尿肌活动不足。该模型可用于研究尿路功能。
Abstract
所提出的协议的目标是通过圆锥髓质横断在大鼠中建立逼尿肌活动不足（DU）模型。在总共40只雌性Wistar大鼠（对照组：10只大鼠;试验组：30只大鼠）中，体重200-220 g，在试验组中，髓圆锥在L4\u2012L5水平进行横断。将所有大鼠在相同的环境条件下饲养和喂养六周。在测试组中，每天进行两次排尿，持续六周，并记录平均残余尿量。两组均行膀胱测量图。记录并计算膀胱的最大膀胱测量容量（MCC），逼尿肌开放压力（DOP）和膀胱顺应性。测试组在手术后，无论是在脊柱休克期间还是之后，都显示出明显的尿潴留。但对照组未见异常。与对照组相比，试验组的MCC和膀胱顺应性显著高于试验组（3.24 ± 2.261 mL vs 1.04 ± 0.571 mL;0.43 ± 0.578 mL/cmH 2 O 对比 0.032 ± 0.016 mL/cmH 2 O），而试验组的DOP低于对照组（20.28 ± 14.022 cmH 2 O与35 ± 13.258 cmH22这种通过圆锥髓质横断建立贫铀动物模型的方法为更好地了解DU的病理生理学提供了绝佳的机会。
Introduction
逼尿肌活动不足（DU）是一种典型的下尿路功能障碍，至今仍在研究中。尽管贫铀已由国际尿失禁协会（ICS）1定义，但使用许多不同的术语来指代这种疾病，例如“逼尿肌衰竭”、“收缩性膀胱”、“逼尿肌反射消失”2。根据国际尿失禁协会 （ICS） 在 2002 年的定义，DU 是一种力量和持续时间减少的收缩，导致膀胱排空时间延长，从而导致无法在正常时间内实现膀胱完全排空。
DU 可能影响 48% 的男性和 12% 的女性（>70 岁）3 伴有下尿路症状。它似乎是多因素的，并且没有有效的治疗方法。据悉，DU在神经源性膀胱功能障碍患者中普遍存在，如多发性硬化症4、糖尿病5、帕金森病6或脑卒中7。贫铀也可由医源性神经损伤引起，例如腹腔镜子宫切除术、前列腺切除术或其他小骨盆的手术干预8.由于缺乏合适的动物模型进行研究，贫铀的病理生理学变化和可用的治疗方法仍然令人困惑。
排尿反射由脊柱-球脊髓通路控制，该通路结合了脑桥排尿中心、骶副交感神经核和更高级的皮质中心9。排尿反射的激活和维持主要取决于感觉信号从膀胱到更高级的皮层中心的定期传输。可以推测感觉功能障碍会导致 DU。
大多数与下尿路功能障碍相关的实验动物研究都集中在膀胱过度活动症（OAB）模型10上。这些模型提供了对OAB病理生理学和预后的合理理解。然而，只有少数 DU 模型被报道，例如脊髓上损伤（局部病变、去脑和大脑中动脉闭塞）、脊髓横断或挫伤、全身性（例如环磷酰胺）或膀胱内给予刺激性或炎症性物质（例如酸、丙烯醛和脂多糖）11，12，13，14.在这些方法中，只有脊髓横断或挫伤法可用于建立DU13的动物模型。由于严重的创伤，涉及脑桥排尿中心和高级皮层中心损伤的尝试被放弃。因此，人们越来越注意在排尿反射中心找到一个准确的位置，以最小的副作用诱导贫铀。
如前所述，诱导贫铀的机制之一是损伤脊髓以损害排尿反射的信号通路。艾伦的减重方法是为了建立脊髓受伤的实验动物而开发的15。但是，没有关于该方法的进一步实验数据。此外，由于部分动物在没有DU的情况下恢复了中风后的脊柱功能，因此不能将其视为生成DU动物模型16的完美方法。
1987年，布雷格曼发现了一种横断脊髓的过程，以生成DU动物模型，并获得了实验数据17。然而，该方法并未应用于建立贫铀动物模型。当时，研究人员仍然对DU的发病机制感到困惑。由于脊髓中与OAB或DU诱导相关的位置彼此相邻，因此他们无法找到脊髓损伤的准确位置以诱导DU17。OAB和DU要么一起引入，要么通过这种方法单独引入。因此，这种方法虽然引入了DU，但它并不精确，不能用于理解DU的发生和处理。
如上所述，缺乏合适的贫铀动物模型是贫铀研究的主要障碍之一。 研究人员一直在寻找一种准确且可管理的模型，可以模拟贫铀的病理学。在过去20年中，即使是贫铀的治疗方案也没有显著改善。总的来说，非常需要描述建立DU动物模型的标准协议。
因此，在本文中，我们描述了一种通过圆锥髓质横断成功建立DU大鼠模型的方法。在L4-L5水平进行横断，以分离髓圆锥。记录并分析膀胱的最大膀胱容量（MCC），逼尿肌开口压力（DOP）和膀胱顺应性以验证方案。下面所述的协议以标准化的方式结合了可行性和可靠性，以建立贫铀动物模型，模拟贫铀的发生和处理。该协议可用作进一步研究DU的技术。
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Protocol
所有大鼠均按照首都医科大学附属北京友谊医院动物实验委员会批准的方案使用。
1. 手术准备、麻醉和手术技术
注意：本研究共获得40只雌性Wistar大鼠，重200-220克。在40只大鼠中，随机选择10只作为对照组，其余作为试验组。所有动物均在首都医科大学附属北京友谊医院动物设施的无菌环境中饲养。
- 通过腹腔注射戊巴比妥钠（40mg / kg）进行全身麻醉。或者，使用3%-4%异氟醚诱导麻醉并将其维持在1%-3%（吸入）。在眼睛上涂抹眼药膏以防止干燥。然后，将大鼠放在手术平台上并提供热支持。
注意：在程序开始时给予镇痛药，如丁丙诺啡，0.05 mg / kg，SC，0.1-0.2 mL。 - 检查麻醉深度是否对脚趾捏没有反应。用剃须刀剃掉整个背部区域的皮毛。
- 用至少 3 个周期的两阶段擦洗（如洗必泰或聚维酮碘）对手术部位进行消毒，然后使用异丙醇。用手术胶带固定四肢，并用手术剪刀在背部做一个约3厘米的正中切口。
- 使用手术剪刀加深皮下组织的切口，并切断附着在脊柱上的肌肉。
- 目视识别并暴露第 13根 肋骨（连接到该肋骨的椎间空间为间隔 T13\u2012L1）。用缝合线标记第 13 根肋骨。
- 识别后，小心地切除附着在脊柱上的肌肉并暴露椎体。切除棘上韧带和棘间韧带，以准确识别脊柱。用手术剪刀和镊子暴露L4-5的水平。
注意：由于存在薄的皮下组织，可以轻松识别棘上韧带。棘上韧带切除后，棘突之间的韧带为棘间韧带。 - 使用凯利镊子仔细解剖L4\u2012L5椎棘突和部分横向突，露出脊髓（图1）。
- 在L4-l5水平完全暴露髓圆锥，并用虹膜切除剪刀完全横断髓圆锥。插入一些组织包装以阻止脊髓的恢复。
- 使用4-0不可吸收缝合线关闭外层皮肤上的覆盖肌肉和皮肤。
- 对于对照组，执行步骤 1.1-u20121.7，并保持髓圆锥完整。按照步骤1.9关闭切口。
2. 动物恢复
- 在手术后的第一个小时内将大鼠保持在温控培养箱（37°C）中，并监测它们直到它们胸骨或积极移动。
注意：完全恢复大约需要半小时。 - 将动物转移到装有足够食物和水的干净笼子中。将老鼠放在单独的笼子里。
注意：当测试组中的大鼠仅在前腿的帮助下移动时，表明横断的成功，而对照组中的大鼠可以正常行走。
3. 后期运营管理
- 腹腔注射青霉素G，一种抗生素（每只动物50，000U / mL）。术后48小时每6-12小时给予丁丙诺啡，0.05mg / kg，SC，0.1-0.2mL等镇痛药。
- 在下胃压迫膀胱以帮助排尿。每天在同一时间（上午 8 点和晚上 8 点）执行此操作两次，持续六周。
注意：逼尿肌正常收缩的丧失是DU的标志。 - 将所有大鼠安置在代谢笼中，每只大鼠都包含一个尿液收集漏斗，放置在先前称重的吸收纸上以监测排尿和尿失禁。
- 收集并注意吸收纸的重量变化，分别指示排尿量（VV）和残余尿量。
4. 尿动力学检查
- 在手术后六周，使用尿动力学测量设备进行膀胱测量图，如下所示。
- 通过将10%水合氯醛注射到腹膜腔（3mL / kg）来麻醉大鼠。
- 压缩膀胱排尿，然后使用胶带将大鼠固定在手术平台上。
- 将硬膜外导管（3F）插入膀胱，并通过三肢管连接尿动力学测量设备，硬膜外导管和输液泵。
- 以0.2mL / min的速度泵送生理盐水以进行尿动力学测量（见 材料表）。记录MCC和DOP以及膀胱的顺应性（通过将膀胱体积除以逼尿肌的压力δ δ计算）。
5. 统计分析
- 使用市售软件执行统计分析。
- 使用柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验来检验数据的正态性。
- 将正态分布变量表示为具有标准差的平均值。使用双尾配对学生 t 检验来比较两组膀胱测量图的参数。
注： p < 0.05表示差值具有统计学意义。
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Representative Results
圆锥髓质横断的整个过程可以由经验丰富的外科医生在45分钟内完成。我们的实验室已经进行了100多例髓圆锥横断手术。成功率超过95%，由大鼠的存活率和成功诱导DU定义。尿动力学试验证实了DU的诱导。
根据我们的经验，贫铀的诱导可以通过残余尿量初步评估。手术后立即观察到尿液潴留。试验组术后第2天出现容量峰值点，体积下降逐渐持续10 d左右。手术后十天，体积达到稳定水平（图2）。观察到术后前10天，平均残余尿量为2.09±1.05mL，术后第10天降至 0.67±0.21mL。但对照组未见异常。
为了确认DU的诱导，需要进行尿动力学测试。测试组和对照组的代表性压力-体积曲线如图3和图4所示。与对照组相比，试验组的MCC和膀胱顺应性显著更高（分别为1.04 ± 0.571 mL vs. 3.24 ± 2.261 mL，p < 0.001和0.032 ± 0.016 mL/cmH 2 O和0.43 ± 0.578 mL/cmH 2 O，p < 0.05）显著降低，而试验组的DOP显著下降（35 ± 13.258 cmH 2 O与20.28 ± 14.022 cmH2O;p < 0.01）。请参阅表 1。
图1：圆锥髓质横断的方法。 （a） 露出第13根肋骨（黑色箭头）。（b） 露出L4和L5椎弓。椎板被龙格破坏以揭开脊髓（黑色箭头）。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：测试组中排尿行为参数变化的时间过程。 值表示为平均值±标准偏差。 请单击此处查看此图的大图。
图 3：测试组中具有代表性的膀胱测量痕迹。 （a） 对膀胱体积明显升高和逼尿肌压力低的大鼠的代表性追踪。（b） 从第二只大鼠进行代表性追踪，该大鼠表现出比平时更高的膀胱体积和略低的逼尿肌压力。在固定输液速度下，测试组的输液时间大不相同。然而，试验组所有大鼠的输注时间明显增加，这意味着膀胱增大。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：对照组中具有代表性的膀胱测量迹线。 （a）膀胱容量正常且输注后膀胱压力逐渐升高的大鼠。（b）膀胱容量正常且输注后膀胱压力逐渐升高的大鼠。在固定输注速度下，对照组中近6分钟的输注时间意味着对照组的膀胱体积相同。 请点击此处查看此图的大图。
| 群 | 箱 | 最大膀胱测量容量（毫升） | 逼尿肌开启压力（厘米高 2O） | 膀胱顺应性 （ml/H2O） |
| 测试组 | 26 | 3.24±2.261 | 022±20.28 | 0.43±0.578 |
| 控制组 | 10 | 1.04±0.571 | 35±13.258 | 0.032±0.016 |
| T 值 | 4.517 | -2.847 | 3.435 | |
| （p=0.000） | （p=0.008） | （p=0.002） | ||
| 使用t检验进行统计分析。数据以平均±SD表示。 | ||||
| p<0.05被认为具有统计学意义。 | ||||
表1：两组代表性的压力-体积曲线。
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Discussion
贫铀是男性和女性下尿路症状的常见原因。这是一个复杂的症状群，几乎没有治疗选择，可以显着降低受影响者的生活质量（Qol）18。尽管人们认为贫铀是多因素的，但对其发病机制的理解仍然很初步。研究表明，贫铀的发病机制可能与肌源性和神经源性因素有关。
在肌源性假说中，观察到患有贫铀的人可能比健康衰老的人经历更显着的逼尿肌收缩力下降。研究发现，逼尿肌收缩力随着年龄的增长而减弱，并且可能受到代谢或神经源性疾病等其他因素的影响。尿动力学评估数据显示，贫铀和排尿后残留与衰老有关19.一项研究表明，22.1% 的男性和 10.8% 的女性（年龄均> 60 岁）报告膀胱排空困难3.此外，这背后的主要原因是逼尿肌收缩力降低。对糖尿病膀胱的研究显示出与DU20中发现的类似的变化。肌肉与胶原蛋白比例的降低导致肌肉细胞之间的空间扩大可能导致逼尿肌收缩力降低。在大多数神经源性膀胱中也发现与年龄相关的循环去甲肾上腺素增加21，22。因此，已经有人尝试通过在动物模型中建立糖尿病来诱导贫铀。但由于缺乏对血糖水平和糖尿病其他并发症的准确控制，这些都失败了。然而，在神经源性假说中，DU被分为三组：排尿反射传出信号中的障碍，启动反射的传入信号的障碍和有缺陷的综合控制23。因此，许多研究人员注意通过神经源性系统成分的准确损伤来建立动物模型。由于神经源性系统的复杂功能，很难确定诱导贫铀的位置。 不幸的是，许多利用神经源性系统损伤来诱导贫铀的尝试都失败了。
我们的协议是通过横断髓圆锥建立贫铀动物模型的第一份报告。在本研究中，脊髓在L4\u2012L5水平上横断，以诱导下骶神经损伤。
手术最关键的一步是在L4\u2012L5水平上识别脊髓，因为大鼠的圆锥髓质又长又细，范围从L1的上侧到L4的下侧。如果脊髓横断在L4上方，则可能会诱发骶上神经损伤。相反，如果横断发生在L5以下，则可能无法根除排尿中心。因此，在L4-L5水平上进行横断手术可以确保排尿中心的传入和传出通路都被破坏，这使得这种方法独一无二。
在试验组中，手术后立即出现尿潴留，残余尿量的变化曲线对应于脊髓损伤休克期期间或之后排尿功能的变化。同时，未观察到经典反射性尿失禁余震阶段，表明膀胱传出神经受损。
我们还发现手术后第一周残余尿液增加，第一周后残留尿液显着减少。残余尿液的变化可能是由出口/括约肌/盆底功能协调受损引起的。因此，在手术后的第一周，突然的破坏导致残余尿液增加，当出口/括约肌/盆底功能的损害在一定程度上重建时，残留尿液下降到稳定水平。
根据ICS设想的贫铀的含义：（1）逼尿肌收缩力太弱，（2）逼尿肌收缩跨度太短，它与膀胱排空不足（排尿效果降低），感觉减退和下尿路症状有关。在比较两组的尿动力学数据后，我们发现最大膀胱测量能力和测试组膀胱的顺应性在术后6周显着增加，而逼尿肌开放压力降低。在这些数据的帮助下，很明显，逼尿肌的收缩力在六周后下降，导致膀胱无法收缩以诱导排尿。
如膀胱压力 - 体积曲线所示，随着最大膀胱容量的增加，排尿没有出现，尽管逼尿肌的压力也被夸大了。没有排尿表明手术通过引起膀胱传入神经排尿障碍来阻断诱导排尿的传入信号。此外，这些特征与DU的病理生理变化相对应。
这项研究也有局限性。例如，应采取重症监护以防止手术后感染。根据我们的经验，髓圆锥横断可能导致下后肢动力受损。此外，滞留尿液的泄漏（由于尿失禁）可能很难快速发现，导致尿液润湿的潮湿笼床与动物下半身之间的持续接触。这可能导致严重的皮肤或尿路感染，这可能是致命的。该协议要求显微外科经验有限的外科医生接受广泛的外科培训以掌握该技术，尤其是髓圆锥的准确识别。
由于膀胱排空受阻的临床症状（例如，尿流速降低、排尿后残余 [PVR] 升高）可能因 DU 而出现，但同样也可能因膀胱流出道梗阻 （BOO）（例如良性前列腺增生、尿道狭窄）而发生。因此，需要定期测试以识别DU和BOO，而无需进行侵入性压力流量研究24 。然而，在我们的模型中，在由逼尿肌收缩能力受损引起的尿动力学测试中没有观察到排尿。同时分析BOO因子具有挑战性，这也是模型的局限性。
综上所述，通过截断圆锥髓质建立贫铀动物模型，为进一步了解贫铀提供了一个理想的动物模型。通过适当的培训和实践，这种手术的成功率可以超过95%。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Wuhan Prosai Company | EY-C1178 | pump for urodynamic measurement |
| 10% chloral hydrate | Shandong Yulong Co., Ltd | H37022673 | 3mL/kg, administered intraperitoneally |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co. LTD | H12020275 | 0.05mg/kg subcutaneously 24h and 48h postoperation |
| Epidural Catheter | Shandong Xinghua Co, Ltd | VABR3L | for urodynamic measurement |
| Penicillin G | Alta Technology Co., Ltd | 1ST5637 | 50,000 unit/ml per animal |
| pentobarbital | Beijing solabo Technology Co., Ltd | NK-WF0001 | 40 mg/kg, administered intraperitoneally |
| Suture line(4-0) | ETHICON | VCP422H | suture the injury |
| Three-limb tube | Shandong Xinghua Co, Ltd | VAB3T | for urodynamic measurement |
| Trace infusion pump | Zhejiang Smith Medical Instrument Co., Ltd | 20162540335 | Pump the saline at a speed of 0.2ml/min for urodynamic measurement |
| Urodynamic measurement equipment | Medical Measurement SystemsB.V. | 08-0467 | urodynamic measurement equipment can not only help the diagnosis of dysuria, but also provide objective materials for treatment and therapeutic effect. It is the most commonly used examination method in clinical diagnosis and treatment of lower urinary tract functional diseases |
| Wistar Rats | HFK Biotechnology Co.Ltd,Beijing ,China | SCXK2012-0023 | 200-220g |
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