Summary
ラットにおける円錐髄膜剥離による排尿筋活動低下モデルを確立する方法を提示する。排尿筋活動低下は、これらの動物において首尾よく刺激された。このモデルは、尿路機能の研究に使用できます。
Abstract
提示されたプロトコルの目標は、円錐髄膜剥離を通じてラットの排尿筋活動低下(DU)モデルを確立することでした。体重200〜220 gの雌Wistarラット40匹(対照群:10匹、試験群:30匹)で椎弓切除術を行い、試験群では髄膜円錐をL4〜5レベルで切除しました。全てのラットを同じ環境条件下で6週間飼育し、給餌した。試験群では、排尿を1日2回6週間行い、平均残尿量を記録した。膀胱メトログラムは両方のグループで実施されました。最大膀胱測定容量(MCC)、排尿筋開口圧(DOP)、および膀胱のコンプライアンスが記録され、計算されました。試験群は、脊髄ショック中および手術後の両方で、手術後に有意な尿閉を示した。しかし、対照群に異常は認められなかった。対照群と比較した場合、試験群のMCCおよび膀胱のコンプライアンスは試験群よりも有意に高かった(3.24 ± 2.261 mL 対 1.04 ± 0.571 mL;0.43 ± 0.578 mL/cmH 2 O 対 0.032 ± 0.016 mL/cmH 2 O)、試験群のDOPは対照群よりも低かった(20.28 ± 14.022 cmH 2 O vs 35 ± 13.258 cmH2円錐髄膜解離によってDUの動物モデルを確立するこの方法は、DUの病態生理学をよりよく理解する絶好の機会を提供します。
Introduction
排尿筋活動低下症(DU)は、研究が続けられている典型的な下部尿路機能障害である。DUは国際排泄学会(ICS)1によって定義されていますが、この病気を指すために、「排尿筋不全」、「収縮性膀胱」、「排尿筋性反射症」2など、さまざまな用語が使用されています。2002年に国際禁制学会(ICS)によって定義されたDUは、強度と持続時間の低下の収縮であり、その結果、膀胱が排出される時間が長時間増加し、それによって通常の期間内に完全な膀胱排出を達成できなくなります。
DUは、男性の48%、女性の12%(>70歳)3 に、尿路症状が下がる可能性がある。それは多因子性のようであり、効果的な治療法は存在しません。DUは、多発性硬化症4、糖尿病5、パーキンソン病6、脳脳卒中7などの神経因性膀胱機能障害の患者に遍在していることが報告されています。DUは、腹腔鏡下子宮摘出術、前立腺全摘除術、または小骨盤8の他の外科的介入などの医原性神経損傷によっても引き起こされる可能性があります。DUの病態生理学の変化と利用可能な治療法は、研究に適した動物モデルがないため、依然として混乱しています。
排尿反射は、橋排尿中枢、仙骨副交感神経核、およびより上級の皮質中枢を組み合わせた脊髄球脊髄経路によって制御されています9。排尿反射の活性化と維持は、主に膀胱からより上級の皮質センターへの感覚信号の定期的な輸送に依存します。感覚機能障害がDUに寄与すると仮定することができます。
下部尿路機能障害に関連するほとんどの実験動物研究は、過活動膀胱(OAB)モデルに焦点を当てています10。これらのモデルは、OABの病態生理学および予後の合理的な理解を提供する。しかし、報告されているDUモデルはごくわずかであり、例えば、脊髄上損傷(局所病変、衰弱、および中大脳動脈閉塞)、脊髄切断または挫傷損傷、全身性(例:.、シクロホスファミド)または膀胱内投与刺激性または炎症性薬剤(例:.、酸、アクロレイン、およびリポ多糖)11,12,13,14。.これらの方法のうち、DU13の動物モデルを確立する際に使用できるのは、脊髄離断法または挫傷損傷法のみである。橋排尿センターと高次皮質センターの損傷を伴う試みは、重度の外傷のために放棄されました。そのため、排尿反射中枢の正確な位置を見つけて、最小限の副作用でDUを誘発することにますます注意が払われています。
前述のように、DUを誘導するメカニズムの1つは、脊髄を傷つけて排尿反射のシグナル伝達経路を損傷することです。アレンの体重減少法は、脊髄損傷を有する実験動物を確立するために開発された15。ただし、この方法に関するこれ以上の実験データはありません。さらに、動物の一部はDUなしで脳卒中後に脊髄機能を回復したので、DU動物モデル16を生成するための完全な方法とは考えられない。
1987年、ブレグマンはDU動物モデルを生成するために脊髄を切断するプロセスを解明し、実験データ17を取得しました。それにもかかわらず、この方法はDU動物モデルを確立するために適用されなかった。当時、研究者たちはまだDUの病因について混乱していました。OABまたはDUの誘導に関連する脊髄内の位置は互いに隣接しているため、DU17を誘導するための脊髄の損傷部位を正確に見つけることができませんでした。OABとDUは、この方法で一緒にまたは別々に導入されました。そのため、この方法はDUを導入しましたが、不正確であり、DUの発生と処理の理解には使用できませんでした。
上記のように、DUの適切な動物モデルの欠如は、DUの研究の主な障害の1つです。 研究者は、DUの病理をシミュレートできる正確で管理しやすいモデルを継続的に探しています。DUの治療選択肢でさえ、過去20年間に大幅に改善されていません。まとめると、DUの動物モデルを確立するための標準プロトコルを記述することが大いに必要とされている。
そこで本稿では、円錐髄郭清によりDUのラットモデルを首尾よく確立する方法について述べる。円錐髄質を分離するためにL4〜5レベルで切断を行った。最大膀胱測定容量(MCC)、排尿筋開放圧(DOP)、および膀胱のコンプライアンスを記録および分析して、プロトコルを検証しました。以下に述べるプロトコルは、実現可能性と信頼性の両方を標準化された方法で組み合わせて、DU動物モデルを確立し、DUの発生と処理をシミュレートします。このプロトコルは、DUのさらなる研究のための技術として使用することができる。
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Protocol
すべてのラットは、首都医科大学北京友好病院の動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って使用されました。
1.外科的準備、麻酔、および外科的技術
注:本研究では、体重200〜220 gの合計40匹の雌のWistarラットが商業的に入手されました。40匹のラットのうち、10匹を対照群として無作為に選択し、残りを試験群として治療した。すべての動物は、首都医科大学北京友好病院の動物施設の無菌環境に収容されました。
- ペントバルビタールナトリウムを腹腔内投与して全身麻酔を行います(40 mg / kg)。.あるいは、3%〜4%のイソフルランを使用して麻酔を誘発し、1%〜3%(吸入)に維持する。乾燥を防ぐために眼科用軟膏を目に塗ります。次に、ラットを手術プラットフォームに置き、熱サポートを提供します。
注:手順の開始時に、ブプレノルフィン、0.05 mg / kg、SC、0.1〜0.2mLなどの鎮痛薬を投与します。 - つま先のつまみに対する反応の欠如によって麻酔の深さを確認してください。かみそりで背中全体から毛皮を剃ります。
- クロルヘキシジンやポビドンヨードなどの2段階のスクラブとそれに続くイソプロピルアルコールで少なくとも3サイクルの手術部位を滅菌します。手足をサージカルテープで固定し、手術用ハサミで背中の中央値約3cmを切開します。
- 外科用ハサミを使用して皮下組織を通して切開を深くし、脊椎に付着した筋肉を切り落とします。
- 13番目の 肋骨を視覚的に識別して露出させます(その肋骨に接続されている椎間腔は間隔T13\u2012L1です)。縫合糸を使用して13番目の 肋骨に印を付けます。
- 識別後、脊椎に付着した筋肉を注意深く切除し、脊柱を露出させます。脊柱を正確に識別するために、棘上靭帯と棘間靭帯を切除します。外科用ハサミと鉗子でL4〜L5のレベルを公開します。
注:棘上靭帯は、薄い皮下組織が存在するため、簡単に識別できます。棘上靭帯の切除後、棘突起間の靭帯は棘間靭帯である。 - ケリー鉗子を使用して、L4〜5椎骨棘突起と横突起の一部を慎重に解剖し、脊髄を露出させます(図1)。
- 円錐髄をL4〜L5レベルで完全に露出させ、円錐髄錐を虹彩切除ハサミで完全に横断します。脊髄の回復をブロックするために、組織パッキングを挿入します。
- 4-0非吸収性縫合糸を使用して、外側の皮膚層の上に横たわる筋肉と皮膚を閉じます。
- コントロールグループについては、手順1.1〜7を実行し、円錐髄をそのまま残します。ステップ1.9に従って切開部を閉じます。
2.動物の回復
- 術後最初の1時間はラットを温度管理されたインキュベーター(37°C)に入れ、胸骨または活発に動くまで監視します。
注:完全に回復するには約30分かかります。 - 動物を十分な食物と水の入った清潔なケージに移します。ラットを別々のケージに入れてください。
注:切断の成功は、テストグループのラットが前足の助けを借りてのみ動くのに対し、コントロールグループのラットは正常に歩くことができた場合に示されます。
3. 運用後管理
- 抗生物質であるペニシリンG(動物あたり50,000 U / mL)を腹腔内に注射します。.術後48時間、ブプレノルフィン、0.05 mg / kg、SC、0.1〜0.2 mLなどの鎮痛薬を6〜12時間ごとに投与します。.
- 排尿を助けるために下腹部で膀胱を圧迫します。これを1日2回、同時に(午前8時と午後8時)6週間実行します。
注:排尿筋の正常な狭窄の喪失は、DUの象徴です。 - すべてのラットを代謝ケージに入れ、それぞれに尿収集漏斗を事前に計量した吸収紙の上に置き、排尿と失禁を監視します。
- 排尿量(VV)を示す吸収紙の重量変化と残留尿量を別々に収集してメモします。
4.尿流動態検査
- 術後6週間で、以下のように尿流動態測定装置を用いて膀胱鏡検査を行う。
- 10%抱水クロラールを腹腔(3 mL / kg)に注射してラットを麻酔します。.
- 排尿のために膀胱を圧縮し、次にテープを使用してラットを手術プラットフォームに固定します。
- 硬膜外カテーテル(3F)を膀胱に挿入し、尿流動態測定装置、硬膜外カテーテル、輸液ポンプを三肢チューブで接続します。
- 尿流動態測定のために生理食塩水を0.2 mL / minの速度でポンプで送ります( 材料の表を参照)。MCCとDOP、および膀胱のコンプライアンス(膀胱容積δ排尿筋の圧力で割って計算δ記録します)。
5.統計分析
- 市販のソフトウェアを使用して統計分析を実行します。
- コルモゴロフ-スミルノフ検定を使用して、データの正規性を検定します。
- 正規分布変数を標準偏差の平均値で表します。両側対応のスチューデント のt検定を使用して、両方のグループの膀胱メトログラムのパラメーターを比較します。
注: p < 0.05は、差に統計的有意性があることを示します。
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Representative Results
円錐髄膜切開の全手順は、経験豊富な外科医によって45分以内に完了することができます。当研究室では、100例以上の円錐髄膜切開手術を行ってきました。成功率は、ラットの生存率とDUの誘導の成功によって定義されるように、95%以上です。尿流動態検査によりDUの誘導が確認された。
我々の経験に基づいて、DUの誘導は、残留尿量によって事前に評価することができます。尿の貯留は手術直後に観察されました。試験群では術後2日目に体積のピーク点が現れ、体積の減少は約10日間徐々に持続した。術後10日で容量は安定したレベルに達しました(図2)。術後10日間は平均残尿量が2.09 ± 1.05 mLであったが,術後10日目には 0.67 ± 0.21 mLに減少した。しかし、対照群に異常は認められなかった。
DUの誘導を確認するには、尿流動態検査を実施する必要があります。試験群と対照群の代表的な圧力体積プロファイルを図3および図4に示します。対照群と比較すると、試験群のMCCおよび膀胱のコンプライアンスは試験群で有意に高かった(1.04 ± 0.571 mL vs 3.24 ± 2.261 mL、p < 0.001および0.032 ± 0.016 mL/cmH2O対0.43 ± 0.578 mL/cmH 2 O、p < 0.05)が、試験群のDOPは有意に減少した(35 ± 13.258 cmH 2 O vs 20.28 ± 14.022 cmH2O;p < 0.01)。表 1 を参照してください。
図1:円錐髄膜の解離方法。 (a)13番目の肋骨(黒い矢印)を露出させる。(b)L4およびL5椎弓を露出させる。椎板は、脊髄のマスクを外すためにロンジュールによって破壊されました(黒い矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:テストグループにおける排尿動作パラメータの変化の経時変化。 値はSD±平均値で表されます。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:テストグループの代表的な膀胱測定トレース。 (a)有意に上昇した膀胱容積および低い排尿圧を示すラットからの代表的な追跡。(b)膀胱容積の上昇と通常よりわずかに低い排尿筋圧を示す2番目のラットからの代表的なトレース。固定注入速度では、テストグループの注入時間はかなり異なります。しかしながら、試験群の全ラットの注入時間は有意に増加し、これは膀胱の肥大を意味する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:対照群における代表的な膀胱測定痕跡。 (a)膀胱容積が正常で、注入により膀胱圧を徐々に上昇させるラット。(b)膀胱容積が正常で、注入により膀胱圧を徐々に上昇させるラット。固定注入速度では、ほぼ6分間の対照群の注入時間は、対照群全体で同じ膀胱容積を示すことを意味します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 群 | ケース | 最大膀胱測定容量(ml) | 排尿筋開口圧(cmH2O) | 膀胱のコンプライアンス(ml / H2O) |
| テストグループ | 26 | 3.24±2.261 | 022±20.2814 | 0.43±0.578 |
| コントロールグループ | 10 | 1.04±0.571 | 35±13.258 | 0.032±0.016 |
| T値 | 4.517 | -2.847 | 3.435 | |
| (p=0.000) | (p=0.008) | (p=0.002) | ||
| 統計解析はt検定を用いて行った。データはSD±平均値として提示されます。 | ||||
| p<0.05は統計的に有意であると考えられた。 | ||||
表1:2つのグループの代表的な圧力-体積プロファイル。
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Discussion
DUは、男性と女性の両方の下部尿路症状の一般的な原因です。これは、影響を受けた人々の生活の質(Qol)を大幅に低下させる可能性のある治療オプションがほとんどない複雑な症状の星座です18。DUは多因子性であると考えられているが、その病因の理解は初歩的なままである。研究によると、DUの病因は筋原性および神経原性の要因に関連している可能性があります。
筋原性仮説では、DUの人は健康な老化の人よりも排尿筋収縮性の有意な低下を経験する可能性があることが観察されました。排尿筋収縮性は年齢とともに低下し、おそらく代謝性疾患や神経原性疾患などの他の要因の影響を受けていることがわかりました。尿流動態評価からのデータは、DUおよびボイド後の残留物が19歳の老化と関連していることを示した。ある研究によると、男性の22.1%と女性の10.8%(すべて60歳>)が膀胱排出の困難を報告しました3。さらに、この主な原因は、排尿筋の収縮性の低下でした。糖尿病性膀胱の研究では、DU20に見られるような変化が示されています。筋肉とコラーゲンの比率が低下し、筋肉細胞間のスペースが広がると、排尿筋収縮性が低下する可能性があります。循環ノルエピネフリンの加齢に伴う増加は、ほとんどの神経因性膀胱においても見出されている21,22。したがって、動物モデルにおいて真性糖尿病を確立することによってDUを誘導する試みがなされている。しかし、これらは血糖値の正確な制御の欠如と糖尿病の他の合併症のために失敗しました。しかし、神経原性仮説では、DUは、排尿反射の遠心性信号の障害、反射を開始する求心性信号の障害、および統合制御の欠陥の3つのグループに分類されました23。そのため、多くの研究者は、神経生殖器系コンポーネントの正確な損傷によって動物モデルを確立することに注意を払いました。神経生殖器系の機能は複雑であるため、DUを誘導する位置を特定することは困難です。 残念ながら、神経因性系の損傷を使用してDUを誘導する多くの試みは失敗しています。
私たちのプロトコルは、円錐髄質の切断によってDU動物モデルを確立した最初の報告です。本研究では、脊髄をL4〜L5のレベルで切断し、下部仙骨神経の損傷を誘発した。
手術の最も重要なステップは、ラットの円錐髄膜が長くて細く、L1の上側からL4の下側までの範囲であるため、L4〜L5のレベルで脊髄を特定することです。脊髄がL4より上に切断されると、高等仙骨神経に損傷を与える可能性があります。逆に、L5以下で切断が行われると、排尿中心が根絶されない可能性があります。したがって、L4〜L5のレベルで解離手術を行うことで、排尿中心の求心性経路と遠心性経路の両方が確実に破壊され、この方法がユニークになります。
試験群では,術直後の尿貯留がみられ,残存尿量の変動プロファイルは脊髄損傷ショック期中またはショック期後の排尿機能の変化に対応していた。同時に、古典的な反射性尿失禁の余震段階は観察されず、膀胱への遠心性神経が損傷していることが示唆されました。
また,術後1週目に残尿が増加し,1週目以降は有意に減少した。残留尿の変化は、出口/括約筋/骨盤底機能の協調障害によって引き起こされる可能性があります。.そのため、術後1週間で突然の混乱で残尿が増加し、出口・括約筋・骨盤底機能の障害がある程度再構築されると、残尿は安定したレベルまで減少しました。
ICSによって考案されたDUの意味によると、(1)排尿筋収縮力が弱すぎ、(2)排尿筋収縮スパンが短すぎるため、膀胱排出の不足(排尿効果の低下)、感覚の低下、および下部尿路症状に関連しています。両群の尿流動態データを比較したところ、最大膀胱測定能力と膀胱のコンプライアンスは術後6週間で劇的に増加し、排尿筋開口圧は低下した。これらのデータの助けを借りて、排尿筋の収縮性は6週間後に減少し、膀胱が収縮不能になり、排尿を誘発することが明らかになりました。
膀胱圧-容積プロファイルに示されているように、最大膀胱測定能力の増加に伴い、排尿は現れませんでしたが、排尿筋圧も誇張されていました。排尿がないことは、手術が膀胱求心性神経排尿障害を引き起こすことによって、排尿を誘発する求心性信号を遮断することを示しました。さらに、これらのプロファイルは、DUの病態生理学的変化に対応する。
この研究にも限界があります。例えば、手術後の感染を防ぐために集中的な注意を払うべきです。私たちの経験から、円錐髄郭清は下肢のモチベーションの低下につながる可能性があります。さらに、(失禁による)滞留尿の漏れは、尿で濡れた湿ったケージベッドと動物の下半身との間の絶え間ない接触をもたらす迅速に見つけることが困難な場合があります。これは、重度の皮膚または尿路感染症につながる可能性があり、致命的となる可能性があります。このプロトコルでは、顕微手術の経験が限られている外科医が、技術、特に円錐髄質の正確な識別を習得するために広範な外科的トレーニングを受ける必要があります。
障害のある膀胱排出の臨床的ハイライト(例:.、尿流量の減少、排尿後残留物[PVR]の上昇)は、DUが原因で発生する可能性がありますが、同様に膀胱流出閉塞(BOO)が原因で発生する可能性があります(例:.、良性前立腺肥大症、尿道狭窄)。.そのため、侵襲的な圧力流研究24 なしでDUおよびBOOを認識するための定期的な試験が必要とされる。しかし、我々のモデルでは、排尿筋狭窄能の障害による尿流動態検査では排尿は観察されません。BOO係数を同時に分析することは困難であり、これもモデルの限界です。
結論として、円錐髄膜をトランセクトすることによってDUの動物モデルを設定することは、DUのさらなる理解のための望ましい動物モデルを提供する。適切なトレーニングと練習により、この手術は95%以上の成功率で行うことができます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
何一つ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline | Wuhan Prosai Company | EY-C1178 | pump for urodynamic measurement |
| 10% chloral hydrate | Shandong Yulong Co., Ltd | H37022673 | 3mL/kg, administered intraperitoneally |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co. LTD | H12020275 | 0.05mg/kg subcutaneously 24h and 48h postoperation |
| Epidural Catheter | Shandong Xinghua Co, Ltd | VABR3L | for urodynamic measurement |
| Penicillin G | Alta Technology Co., Ltd | 1ST5637 | 50,000 unit/ml per animal |
| pentobarbital | Beijing solabo Technology Co., Ltd | NK-WF0001 | 40 mg/kg, administered intraperitoneally |
| Suture line(4-0) | ETHICON | VCP422H | suture the injury |
| Three-limb tube | Shandong Xinghua Co, Ltd | VAB3T | for urodynamic measurement |
| Trace infusion pump | Zhejiang Smith Medical Instrument Co., Ltd | 20162540335 | Pump the saline at a speed of 0.2ml/min for urodynamic measurement |
| Urodynamic measurement equipment | Medical Measurement SystemsB.V. | 08-0467 | urodynamic measurement equipment can not only help the diagnosis of dysuria, but also provide objective materials for treatment and therapeutic effect. It is the most commonly used examination method in clinical diagnosis and treatment of lower urinary tract functional diseases |
| Wistar Rats | HFK Biotechnology Co.Ltd,Beijing ,China | SCXK2012-0023 | 200-220g |
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