Summary
此方法允许在大鼠中胃肌的三种类型的运动单元中记录抽搐和泰坦收缩力和作用电位。单个电机单元的功能隔离是由轴翁的电刺激引起的。
Abstract
本工作概述了运动单元 （MUs） 的功能隔离，这是一种标准电生理学方法，用于确定实验大鼠中后体肌肉（如中侧胃部、鞋底或植物性肌肉）的运动单元特征。该方法的一个关键要素是将电刺激装置应用到与心根隔离的电机轴上。刺激可以以恒定或可变的脉冲间间隔提供。此方法适用于不同成熟阶段（幼年、成人或老年人）的动物实验。此外，该协议可用于研究大量干预引起电机单元的变异性和可塑性的实验。这些实验的结果可以增强肌肉生理学的基本知识，并转化为实际应用。本程序侧重于记录和刺激 MUs 的手术准备，重点是实现制备稳定性和结果可重复性的必要步骤。
Introduction
运动单位 （MUs） 是骨骼肌的最小功能单位。因此，了解它们的功能、可塑性和收缩性，以及力调节的机制，对于肌肉生理学的进步至关重要。对于许多肌肉，主要是实验动物的后肢肌肉，都记录了MUS的基本收缩特性及其生理类型的比例。然而，MU属性的可塑性和MU力调节机制尚未完全了解。
所述方法的原理是广泛去功能性后肢肌肉，除了被调查的一和腰椎骨的拉明切除术，以准备薄的腹根，每个包含一个单一的"功能"电机轴，电刺激记录MU的力量和作用潜力。使用本文中描述的技术，在一次成功的实验中，可以分离出一半以上的中胃肌肉的M。大鼠中肠胃由平均52 MUs（雌性）或57 MUs（雄性）三种生理类型组成：S（慢速）、FR（快速耐药）和FF（快速可肥胖）1、2，具有可变收缩特性3。对于比较对照组和实验组中 MUs 的平均值的实验，需要隔离和记录每个组 10-30 M。关键是，单个 MUs 可在超过一小时的时间段内获得刺激。此外，由于此技术允许记录 MU 力和作用电位，因此此方法适用于研究与力产生相关的现象、评估疲劳的影响以及观察力和作用电位之间的关系。
先前的研究已经证实，MU收缩特性是塑料的，可以通过许多干预措施进行调节。使用此处所述技术的实验已对大鼠中侧胃膜4或其他后肢肌肉进行了实验，以及对猫肌肉7的实验，使用类似的单 MU 隔离方法。另一组实验使用以可变脉冲间间隔提供的刺激列车，提供了有关电机控制过程的观察，结果一般将注意力转向刺激的历史，包括甚至一个刺激的时间尺度变化的相当大的影响，对力生产8、9至关重要。
也可以使用替代方法研究 MUs。首先，一种方法就是直接刺激莫托龙。伯克使用细胞内刺激的莫托龙在猫中腹胃和鞋底与玻璃微电极用于平行用于确定这些神经元的电生理特性1，10。提出了其他方法来研究人类肌肉中的MUs，这需要大大降低干预。对于所有这些方法，刺激和记录电极入到肌肉或神经，并记录从手指或从脚的力量。其中第一种方法用于研究第一个后体间肌肉中的 MUs。对于这种肌肉，收缩与低力，在肌电图记录与针电极插入到肌肉的行动电位只有一个活动马达单元被识别。然后，平行记录并遵循每个动作电位记录的肌肉力片段被平均（尖峰触发平均）。这种方法能够从肌肉力记录11中提取一个运动单元的力。然而，这个程序的方法弱点是，没有单一的抽搐力，而是一个片段的泰塔尼奇收缩是平均的。人类MUs也可以使用第二种方法，使用插入肌肉12的电极进行肌肉内电微刺激研究，该电极刺激一个斧头树的片段，从而激活单个运动单元。第三种方法是将电极插入神经中的微刺激。当电极在神经中只激活一个马达轴时，只有一个马达单元收缩13。这些最后的方法有一些限制，包括录音的稳定性和质量，道德限制和获得实验材料。该协议在70世纪和80世纪14年的猫中被广泛使用。
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Protocol
所有程序都需要得到当地道德委员会的批准，并遵守欧盟关于动物护理的准则以及保护动物的国家法律。
注：参与此程序的每个实验者都必须接受基本外科手术培训，并且必须获得执行动物实验的有效许可证。
1. 麻醉
- 用五巴比妥钠的内皮内注射麻醉大鼠（初始剂量为60mg=kg-1）。
- 大约 5 分钟后，通过用钝钳捏住大鼠的耳朵或前肢检查麻醉深度。仅在未观察到反射操作时，请转到协议的下一步。
- 在手术过程中，每10-15分钟检查一次动物的反射动作，如果动物对运动挤压有反应，则补充麻醉（通常，10mg+kg-1+h-1钠五巴比妥，IP）。
2. 手术
- 通过剃毛在左后肢从脚跟到臀部（第一部分，肌肉和神经隔离），右后肢从脚跟到臀部（第二段，接地电极），以及从尾部到胸腔的背面（第三段，拉明切除术）来为手术做准备。由于实验的急性性质，防腐剂是没有必要的。
- 将大鼠放在其腹部加热垫上（37 °C ± 1 °C）
- 拉明切除术
- 使用锋利的剪刀，将皮肤沿着脊柱从囊切到胸椎。
- 将皮肤与底层肌肉分开。
- 使用钝尖剪刀，切掉囊和腰椎旋转过程的两侧的长肌。
- 将 S1 椎骨识别为最低段。使用锋利的剪刀，切割并去除从L6到L2椎骨的旋转过程。接下来，使用细的隆弗，去除横向过程L6-L2，并在L6 + L2段上进行拉明切除术（先是横向过程，然后是层，从L6椎段开始），以暴露杜拉母体覆盖的脊髓的腰椎部分。小心不要切割圣骨和L1旋转过程，这将被用作动物固定固定的点。
- 使用锋利的剪刀，在L2椎段水平，在拉明切除术的上边界切割脊髓（其骨骼碎片）和背部和腹根。放置小块干凝胶泡沫以阻止出血。接下来，在裸露的脊髓部分上放置一根细而盐碱浸湿的棉布。
- 中胃肌肉及其神经的隔离
- 使用锋利的剪刀，在左后肢的后侧，从跟腱到臀部进行纵向切割。
- 用钳子抓住皮肤，将皮肤与切口两侧的底层肌肉分开。
- 找到膝盖关节后面，被二头肌肌肌肉覆盖的罂粟花。使用剪刀，在肌肉的前部和后部之间做一个切口。
- 向上移动，切开二头肌的两个头，一直到臀部，以暴露坐骨神经。
- 使用钝钳和剪刀，将横向与胃肠肌肉的中背部头部分离，并切断中胃肌肉的远点插入（跟腱）。尽可能长时间地保留跟腱的碎片，以便用它来连接到力传感器。
- 识别中胃神经 （MG） 神经。使用钳子和剪刀，切割坐骨神经的所有剩余抵押品，包括后二头肌和半丁肌的抵押品。保持供血血管到中胃血管完好无损。
- 通过跟腱线程非弹性连结，并作出三节。
- 将盐水浸泡的棉布放在暴露的神经和肌肉下。
- 使用锯齿形钳，在操作区域上关闭皮肤。
- 使用锋利的剪刀，在皮肤和下层结缔组织沿左后肢前侧进行2厘米切口，用金属夹固定（3.1.6）。
3. 记录和刺激的准备
- 椎柱和腿部固定和肌肉排列
- 使用钢夹，将夹子放在头骨上，固定左后肢。
- 将大鼠放在定制的可调框架（隔离铜线，1毫米），用四个连体将皮肤拉起拉明切除术周围的皮瓣，将皮肤缝合到框架上，以便在裸露的脊髓上形成石蜡油池（大小约为 50 mm x 50 mm）。
- 使用杜蒙#55钳子，抬起脊髓交汇处的杜拉母体，将其切到囊骨并收回。
- 使用钝玻璃棒，分开左右的后腹根在连续的水平，注意不要损坏他们。
- 用温暖（37°C）石蜡油填充脊髓上池，覆盖裸露的腹和后根。
- 将大鼠放在定制铝板上（长 260 毫米，宽度 120 毫米，高度 80 毫米），带一个池（长 135 毫米，宽 100 毫米，深度 45 毫米），用于连接到闭环加热系统的后圈。盘子是动物固定和实验的地方。
- 用金属棒固定放在左后肢上的夹子，以固定印地安器。
- 通过将钢夹放在囊骨和 L1 椎骨上固定动物身体，并消除与呼吸运动相关的有效记录中的人工制品，修复椎柱。
- 通过跟腱将左中肠胃肌与非弹性连体连接到力传感器（符合 50 μm/250 mN，测量范围 0-1000 mN）。
- 使用温度探头和自动系统，为后肢填充热 （37 °C） 石蜡油，以覆盖中胃肌，并保持油温在 37 °C ± 1 °C。
- 用于作用电位记录和刺激的电极的放置
- 插入双极银线电极通过中间胃肌的中间部分，垂直于其长轴。沿着肌肉的长轴保持两个电极之间的距离约 5 mm。这些电极将用于记录电机单元作用电位 （MUAP）。将电极连接到低噪声放大器。
- 将操作肌肉拉伸到 100 mN 的被动张力，由力传感器控制。对于大鼠中肠胃，在此拉伸的三种类型的MUs发展最高的抽搐力15。
- 使用锋利的钝剪刀，在右后肢的皮肤上做一个2厘米的切口，并插入一个银线电极作为参考电极。
- 将定制的绝缘金属板（尺寸 30 mm x 13 mm）放在裸露的脊柱根上方并固定。将左对心和后根（L4、L5 和 L6）放在板上。
- 将盐水加入由皮肤在拉明切除术周围形成的池中。盐水水平应低于绝缘板。
- 将银线刺激电极（两根银线，直径0.5毫米，长度50毫米）放在裸露的脊柱根部上方，在油中放在板上方的正极3毫米，而盐碱中的负极（添加到池中，板下方）并连接到刺激器。
4. 电机单元记录
- 使用电矩形脉冲进行刺激（0.1 ms 持续时间，振幅高达 0.5 V），选择心根（L4、L5 和 L6）;腹根刺激引起肌肉收缩，而后根没有这种效果。从板中消除后根。对于中腹胃，大多数轴星在L5心根中。
- 使用一对杜蒙 #55 钳子和放大镜，将 L5 或 L4 心根分割成非常细的轴子束（用钳子抓住腹根的切端，将根皮剥离开去）;将其中一个束放在银线电极上，并刺激（0.1 ms 矩形振幅脉冲，振幅高达 0.5 V），以实现单个 MU 的活动。固体支撑（金属棒）对于操作细束轴子非常有用，这些轴子可用作使用钳子的手支撑。另请注意，需要额外的光源。
- 通过逐步增加刺激的强度，根据抽搐收缩和行动潜在刺激的"全有或全无"特征确定单个 MU。在阈值周围的刺激下仔细测试唤起的活动。
- 当多个 MU 在研究的肌肉中收缩，增加力水平以及增加振幅或改变动作电位的形状可见时，请回到步骤 4.2 并再次分割轴子束。请注意，大鼠中肠胃中最强的 MU 的抽搐力比最弱的动搐力大约 70 倍，当非常强的 MU 抽搐第二个时，弱 MU 可能并不明显。另请注意，某些 M 的肌肉纤维位于电极的录制区域外，在电图中不可见;在这种情况下，刺激幅度的变化可能对力产生影响，但对作用潜力没有影响。
- 用实验目的所需的刺激方案刺激马达装置。对于计算所有基本电机单元收缩和作用潜力特性所需的基本刺激方案，请包括以下内容。
- 在 1 Hz 时包括 5 个刺激（记录和平均 5 次抽搐;平均消除噪音，这对最弱的 MUs 尤其重要）。
- 包括一系列刺激在10，20，30，40，50，60，75，100和150赫兹频率，持续时间为500ms（这些录音允许计算力-频率关系，最大泰塔力在150赫兹，以及下垂在20-40赫兹刺激）。
- 包括疲劳测试（40 Hz频率为14次刺激的火车，每秒钟重复4分钟）。
- 在上面的协议的所有元素之间包括至少 10 s 的时间间隔。
- 使用连续的隔离电机单元重复此过程。
- 终止实验，使用致命剂量的五巴比妥钠（180mg=kg-1）对动物实施安乐死。
5. 电子设备
注：定制的计算机程序控制刺激器，提供创建可变刺激模式的可能性，包括步骤4.4中所示的模式。该程序与模拟到数字转换器配合使用（MUAP 和强制录像至少为 10 kHz）。
- 通过模拟到数字转换器与示波器并行将交流放大器连接到计算机。
- 通过模拟到数字转换器与示波器并行将力传感器连接到计算机。在实验过程中，使用力传感器控制被动肌肉力。请注意，在实验过程中，被动力可能会降低;因此，有必要增加肌肉长度，以保持被动肌肉力恒定。
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Representative Results
当确保稳定的记录条件时，可以在记录的基础上计算运动单元收缩和作用电位参数。 图 1 提供了快速 MU 的单抽搐的代表性记录。上部轨迹显示电机单元作用电位。刺激传递和运动单元作用潜力的启动之间的延迟是由于从心根到肌肉的传导时间。 图 2 显示了快速 MU 的未熔断破伤风力和电机单元作用电位列车的代表性记录。
图 1：快速 MU 的单抽搐的代表性记录。在力轨上，有马达单元作用潜力。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：快速 MU（中间记录）的未熔断破伤风力的代表性记录、电机单元作用电位（上部记录）和应用刺激列车的时间位置（下图）。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
如果由有经验的科学家正确执行，所述方案的手术部分应在大约两个小时内完成。在手术过程中，应特别注意保持动物的生理状况稳定，特别是体温和麻醉深度，应通过评估针和戒断反射来系统地控制。手术后，应该可以保持稳定的记录条件至少6小时。
关键的实验程序从将心根分割成非常薄的细丝开始，导致单个运动轴与所研究的肌肉分离。事实上，心根的细丝含有轴星组内侧不同的肌肉的后肢;然而，因为所有肌肉，除了研究的一个被除神经化，当刺激捆绑的轴子只包含一个轴到研究的中胃，它是可能的，只在这个研究的肌肉唤起单MU收缩。在成功识别唤起的活动为单个 MU 收缩后，可以记录一组力记录（单抽搐、未熔断破伤风、疲劳测试），这些记录对于将 MU 分类为三种生理类型之一至关重要。这种技术的优点是能够在一个实验中记录多达30个单元;此外，MUs可以立即分类为快速或慢类型的基础上，"sag"的存在1，3。此外，根据未熔合的泰塔尼奇收缩力记录16的轮廓，可将MUs归类为快速脂肪或快速抗药性，精度非常高。当无法执行经典疲劳测试时，可以使用最后一种方法。值得注意的是，快速/慢速MU分类也可以用20赫兹索引17完成。
拟议的刺激方案（步骤4.4）可适应研究的需要。这组特殊的刺激能够记录抽搐（计算基本的抽搐参数，包括抽搐力， 收缩以及松弛时间），最大破伤风（因此可以计算抽搐到破伤风的比例），在一组刺激频率下未融合的三丁收缩（根据下垂存在或 20 Hz 指数将 MU 分类为缓慢或快速，以及计算力-频率曲线）和疲劳测试（计算疲劳指数所必需的）。疲劳指数计算是将MUs分类为可肥胖或抗性的基本方法。这种方法是开放的修改，以产生各种刺激模式;然而，一个可能的限制是计算机程序，产生时间分布的刺激传递到轴。此外，可以引入一些额外的修改来回答特定的研究问题，如几个刺激电极激活几个M在并行18，一个额外的激光传感器记录机械图（MMG）从肌肉表面19或记录电极的神经分支到肌肉计算神经传导速度20。
但是，重要的是要了解这一程序的局限性和挑战。首先，相当一部分实验装置是定制的（即肢体和椎骨部分的夹子，心根和电极的板）。实验装置包括一个带板（厚度为 30 mm）的实心金属表，用于所有支撑金属棒（动物固定和力传感器所必需的），以实现等轴测力记录的稳定条件。这种方法的应用还需要广泛的外科培训，以及准备一个复杂的实验装置，包括电子设备和计算机程序。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了波兰国家研究中心赠款2018/31/B/NZ7/01028的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Force transducer | custom-made | ||
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11255-20 | Dumont #55 with extra light and fine shanks |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11150-10 | Extra Fine Greafe Forceps |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11026-15 | Special cupped pattern for superior grip |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11023-10 | Slim 1x2 teeth |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11251-20 | Dumont #5 |
| Hemostats | Fine Science Tools | No. 13003-10 | Hartman |
| Isolation Unit | Grass Instruments | S1U5A | |
| Low Noise Bioamplifer | World Precision Instruments | Order code 74030 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | No. 12503-15 | With tungsten carbide jaws |
| Rongeurs | Fine Science Tools | No. 16021-14 | Friedman-Pearson |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14101-14 | Straight sharp/blunt with large finger loops |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14075-11 | Curved blunt/blunt |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14084-08 | Extra fine bonn |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 15000-00 | Straight, ideal for cutting nerves |
| Stimulator | Grass Instruments | S88 | Dual Output Square Pulse Stimulator |
References
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