Summary
Este método permite o registro da força de contrações de contração e tetanic e potenciais de ação em três tipos de unidades motoras no músculo gastrocnemius medial de rato. O isolamento funcional de uma única unidade motora é induzido por estimulação elétrica do axônio.
Abstract
Este trabalho descreve o isolamento funcional das unidades motoras (UMs), um método eletrofisiológico padrão para determinar características das unidades motoras em músculos de escalada posterior (como o gastrocnemius medial, soleus ou músculo plantaris) em ratos experimentais. Um elemento crucial do método é a aplicação de estímulos elétricos entregues a um axônio motor isolado da raiz ventral. Os estímulos podem ser entregues em intervalos inter pulse constantes ou variáveis. Este método é adequado para experimentos em animais em diferentes estágios de maturidade (jovens, adultos ou idosos). Além disso, este protocolo pode ser utilizado em experimentos que estudam a variabilidade e plasticidade das unidades motoras evocadas por um grande espectro de intervenções. Os resultados desses experimentos podem aumentar o conhecimento básico em fisiologia muscular e ser traduzidos em aplicações práticas. Este procedimento enfoca a preparação cirúrgica para o registro e estimulação das UI, com ênfase nas etapas necessárias para alcançar a estabilidade da preparação e a reprodutibilidade dos resultados.
Introduction
As unidades motoras (MUs) são as menores unidades funcionais dos músculos esqueléticos. Portanto, compreender sua função, plasticidade e propriedades contíteis, bem como os mecanismos de sua regulação de força, é crucial para o progresso na fisiologia muscular. As propriedades contratuais básicas das UI e as proporções de seus tipos fisiológicos foram documentadas para numerosos músculos, predominantemente os músculos hindlimb em animais experimentais. No entanto, tanto a plasticidade das propriedades mu quanto os mecanismos de regulação da força mu ainda não são totalmente compreendidos.
O princípio do método descrito é a denervação extensiva dos músculos hindlimb, exceto o investigado e a laminectomia nas vértebras lombares, a fim de preparar raízes ventrais finas, cada uma contendo um único axônio motor "funcional", estimulado eletricamente para registrar a força e o potencial de ação da MU. Usando a técnica descrita neste artigo, é possível isolar mais da metade dos MUs do músculo gastrocnemius medial em um experimento bem sucedido. O gastrocnemius medial de ratos é composto em média 52 MUs (fêmeas) ou 57 UI (machos) de três tipos fisiológicos: S (lento), FR (resistente rápido) e FF (fatigable rápido)1,2, e possuem propriedades contratuaisvariáveis 3. Para experimentos comparando valores médios para MUs nos grupos de controle e experimentais, é necessário isolamento e registro de 10-30 MUs para cada um desses grupos. Criticamente, os MUs individuais podem ser acessíveis para estimulação por períodos de tempo superiores a uma hora. Além disso, uma vez que essa técnica permite o registro tanto da força de MU quanto dos potenciais de ação, este método é adequado para estudar fenômenos associados à produção de força, avaliar o efeito da fadiga e observar a relação entre os potenciais de força e ação.
Estudos anteriores confirmaram que as propriedades contraídas pela MU são plásticas e podem ser moduladas por inúmeras intervenções. Experimentos utilizando a técnica aqui descrita foram realizados em gastrocnemius medial de rato4 ou outros músculos hindlimb do rato5,6 bem como em músculos de gato7, usando um método semelhante de isolamento único de MU. Outra série de experimentos utilizando trens de estímulos entregues em intervalos inter pulse variáveis forneceu observações sobre processos de controle motor, e os resultados em geral voltam a atenção para a história da estimulação, incluindo efeitos consideráveis de uma mudança na escala de tempo de até mesmo um estímulo, crucial para a produção de força8,9.
Os MUs também podem ser estudados usando métodos alternativos. Primeiro, um método é a estimulação direta de motoneurons. Burke usou estimulação intracelular de motoneurons em gastrocnemius medial de gato e soleus com microeletrodos de vidro usados paralelamente para determinar as propriedades eletrofisiológicas desses neurônios1,10. Outros métodos foram propostos para estudar UMs em músculos humanos, que requerem uma intervenção consideravelmente menor. Para todos esses métodos, os eletrodos estimulantes e de gravação são inseridos no músculo ou nervo, e a força é registrada a partir do dedo ou do pé. O primeiro desses métodos foi utilizado para estudar UMs no primeiro músculo interosseo dorsal. Para este músculo, contraindo com baixa força, no eletromyograma registrado com o eletrodo da agulha inserido no músculo foram identificados os potenciais de ação de apenas uma unidade motora ativa. Em seguida, os fragmentos de uma força muscular registrada em paralelo e seguindo cada potencial de ação foram mediados (média desencadeada por picos). Este método permite a extração da força de uma unidade motora a partir do registro da força muscular11. No entanto, a fraqueza metodológica deste procedimento é que nenhuma força de contração única, mas sim fragmentos de contrações tetanicas foram mediados. As UBS humanas também podem ser estudadas utilizando o segundo método de microestimulação elétrica intramuscular usando um eletrodo inserido no músculo12,o que estimula um fragmento de uma árvore axonal, levando à ativação de uma única unidade motora. O terceiro método é a microestimulação com um eletrodo inserido no nervo. Quando o eletrodo ativa apenas um axônio motor no nervo, apenas uma unidade motora contrai13. Esses últimos métodos possuem algumas limitações, incluindo estabilidade e qualidade do registro, restrições éticas e acesso ao material experimental. Este protocolo tem sido amplamente utilizado em gatos nos anos 70 e80 14.
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Protocol
Todos os procedimentos precisam ser aprovados pelo comitê de ética local e cumpridos às diretrizes da União Europeia sobre cuidados com animais, bem como à lei nacional de proteção dos animais.
NOTA: Cada experimentador envolvido neste procedimento deve ser treinado em procedimentos cirúrgicos básicos e deve obter uma licença válida para a realização de experimentos em animais.
1. Anestesia
- Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (uma dose inicial de 60 mg·kg-1).
- Após aproximadamente 5 minutos, verifique a profundidade da anestesia beliscando a orelha do rato ou o membro dianteiro com fórceps contundentes. Vá para os próximos passos do protocolo somente quando nenhuma ação reflexa for observada.
- Durante a cirurgia, verifique se o animal procura ações reflexas a cada 10-15 minutos e suplementa anestesia se o animal responder a uma pitada com movimento (geralmente, 10 mg·kg-1·h-1 pentobarbital de sódio, IP).
2. Cirurgia
- Prepare o animal para o procedimento cirúrgico raspando a pele sobre o retroescavo esquerdo do calcanhar para o quadril (o primeiro segmento, isolamento muscular e nervoso), o retroescavo direito do calcanhar para o quadril (o segundo segmento, eletrodo moído) e o traseiro da cauda para os segmentos torácicos (o terceiro segmento, laminectomia). Antisséptico não é necessário devido à natureza aguda do experimento.
- Coloque o rato em seu abdômen em uma almofada de aquecimento (37 °C ± 1 °C.)
- Laminectomia
- Usando uma tesoura afiada e contundente, corte a pele ao longo da coluna vertebral do sacro até as vértebras torácicas.
- Separe a pele dos músculos subjacentes.
- Usando uma tesoura de ponta sem corte, corte o músculo longissimus em ambos os lados do sacro e processos espinhosos lombares.
- Identifique a vértebra S1 como o segmento mais baixo. Usando uma tesoura afiada e contundente, corte e remova os processos espinhosos das vértebras L6 a L2. Em seguida, utilizando rongeurs finos, remova os processos transversais L6-L2 e realize uma laminectomia sobre os segmentos L6 – L2 (primeiro processos transversais, depois lamina, comece com segmento vertebral L6) para expor os segmentos lombares da medula espinhal cobertos pela dura mater. Tenha cuidado para não cortar o osso sacral e o processo spinous L1, que será usado como ponto de fixação para a imobilização animal.
- Usando tesoura afiada, corte a medula espinhal (seu fragmento caudal) e as raízes dorsais e ventral no nível do segmento de vértebras L2, na borda superior da laminectomia. Coloque pequenos pedaços de espuma de gel seco para parar de sangrar. Em seguida, coloque uma lã de algodão fina e salina sobre os segmentos da medula espinhal exposta.
- Isolamento do músculo gastrocnemius medial e seu nervo
- Usando uma tesoura afiada e contundente, faça um corte longitudinal no lado posterior do membro traseiro esquerdo, do tendão de Aquiles até o quadril.
- Segure a pele com os fórceps e separe a pele dos músculos subjacentes em ambos os lados da incisão.
- Localize a fossa popliteal na parte de trás da articulação do joelho, que é coberta pelo músculo fêmigo do bíceps. Usando uma tesoura, faça um corte entre a parte anterior e posterior deste músculo.
- Movendo-se para cima, corte as duas cabeças do bíceps femoral todo o caminho até o quadril para expor o nervo ciático.
- Usando fórceps e tesouras contundentes, separe o lateral da cabeça medial do músculo gastrocnemius e corte a inserção distal (tendão de Aquiles) do músculo gastrocnemius medial. Preservar o fragmento do tendão de Aquiles o máximo possível, a fim de usá-lo para conectar-se ao transdutor de força.
- Identifique o nervo gastrocnemius medial (MG). Usando os fórceps e a tesoura, corte todas as garantias restantes do nervo ciático, incluindo garantias ao bíceps posterior e semitendinoso. Deixe os vasos sanguíneos para o gastrocnemius medial intacto.
- Enfie uma ligadura não elástica através do tendão de Aquiles e faça três nós.
- Coloque um pedaço de algodão encharcado de soro sob o nervo e músculo expostos.
- Usando fórceps serrilhados, feche a pele sobre a área operada.
- Utilizando uma tesoura afiada e contundente, faça uma incisão de 2 cm na pele e tecido conjuntivo subjacente ao longo do lado anterior do membro traseiro esquerdo para imobilização com um grampo metálico (3.1.6.).
3. Preparação para a gravação e estimulação
- Fixação da coluna vertebral e da perna e arranjo muscular
- Usando um grampo de aço, fixar o membro traseiro esquerdo colocando o grampo na tíbia.
- Coloque o rato na estrutura ajustável personalizada (fio de cobre isolado, 1 mm), puxe os retalhos da pele ao redor da laminectomia usando quatro ligaduras e suturar a pele até a moldura, a fim de formar uma piscina para óleo de parafina (tamanho aproximadamente 50 mm x 50 mm) sobre a medula espinhal exposta.
- Usando um #55 punísps Dumont, levante a dura-seca na intersecção da medula espinhal, corte-a caudally até o osso sacral e retraia-o.
- Utilizando uma haste de vidro contundente, separada raízes dorsais e ventrais esquerda e direita em níveis sucessivos, tomando cuidado para não danificá-las.
- Encha a piscina sobre a medula espinhal com óleo de parafina quente (37 °C), cobrindo as raízes ventral e dorsal expostas.
- Coloque o rato na placa de alumínio feita sob medida (comprimento de 260 mm, largura 120 mm, altura 80 mm) com uma piscina (comprimento de 135 mm, largura 100 mm, profundidade 45 mm) para suas barras traseiras conectadas ao sistema de aquecimento de laço fechado. A placa é um lugar onde o animal será imobilizado e o experimento será realizado.
- Fixar o grampo colocado na barra traseira esquerda com a barra de metal para imobilizar o hindimb.
- Fixar a coluna vertebral colocando grampos de aço no osso sacral e na vértebra L1 para imobilizar o corpo animal e eliminar os artefatos em gravações de força relacionadas aos movimentos respiratórios.
- Conecte o músculo gastrocnemius medial esquerdo com a ligadura não elástica ao transdutor de força (com conformidade de 50 μm/250 mN, faixa de medição de 0-1000 mN) através do tendão de Aquiles.
- Encha a câmara para barras traseiras com óleo de parafina quente (37 °C) para cobrir o músculo gastrocnemius medial e mantenha a temperatura do óleo a 37 °C ± 1 °C usando a sonda de temperatura e o sistema automático.
- Colocação de eletrodos para gravação e estimulação de potenciais de ação
- Insira um eletrodo bipolar de fio de prata através da parte média do músculo gastrocnemius medial, perpendicular ao seu eixo longo. Mantenha cerca de 5 mm de distância entre os dois eletrodos localizados ao longo de um longo eixo do músculo. Esses eletrodos serão usados para registrar potenciais de ação de unidades motoras (MUAPs). Conecte os eletrodos ao amplificador de baixo ruído.
- Estique o músculo operado até uma tensão passiva de 100 mN, controlada pelo transdutor de força. Para gastrocnemius medial de rato neste trecho, os MUs de três tipos desenvolvem a maior força de contração15.
- Usando uma tesoura afiada e contundente, faça uma incisão de 2 cm na pele do membro traseiro direito e insira um eletrodo de fio de prata para ser usado como eletrodo de referência.
- Coloque e conserte uma placa de metal isolada personalizada (tamanho 30 mm x 13 mm) acima das raízes espinhais expostas. Coloque pares esquerdos de raízes ventrais e dorsais (L4, L5 e L6) na placa.
- Adicione soro fisiológico à piscina formada pela pele ao redor da laminectomia. O nível salino deve estar abaixo da placa isolada.
- Coloque um eletrodo estimulante de fio prateado (dois fios de prata, 0,5 mm de diâmetro, comprimento de 50 mm) sobre as raízes espinhais expostas, coloque um polo positivo 3 mm acima da placa em óleo, enquanto o polo negativo no soro fisiológico (adicionado à piscina, abaixo da placa) e conecte-se ao estimulador.
4. Gravações de unidades motoras
- Estimulando com pulsos retangulares elétricos (0,1 ms de duração, amplitude de até 0,5 V), selecione as raízes ventral (L4, L5 e L6); a estimulação da raiz ventral evoca contração dos músculos, enquanto que não existe tal efeito para as raízes dorsais. Elimine as raízes dorsais da placa. Para o gastrocnemius medial, a maioria dos axônios estão na raiz ventral L5.
- Usando um par de pórceps e lupas Dumont #55, divida as raízes ventral L5 ou L4 em feixes muito finos de axônios (segure a extremidade cortada da raiz ventral com ambos os fórceps e descasque a raiz separada); coloque um desses feixes em um eletrodo de fio prateado e estimule (pulsos retangulares de 0,1 ms de amplitude até 0,5 V) para alcançar a atividade de um único MU. Um suporte sólido (barra metálica) é muito útil para manipular feixes finos de axônios, que podem ser usados como suporte manual para o uso de fórceps. Observe também que uma fonte adicional de luz é necessária.
- Ao aumentar progressivamente a intensidade do estímulo, identifique uma única MU com base no caráter "tudo ou nenhum" evocado da contração do contração e do estímulo potencial de ação. Teste cuidadosamente a atividade evocada em uma estimulação ao redor do limiar.
- Quando mais de um MU está se contraindo no músculo estudado e aumentando o nível da força, bem como aumentando a amplitude ou mudando a forma do potencial de ação são visíveis, volte ao passo 4.2 e divida o feixe de axônios novamente. Note que os MUs mais fortes em gastrocnemius medial de ratos têm cerca de 70 vezes maior força de contração do que os mais fracos e quando mu muito forte está contraindo o segundo, MU fraco pode não ser evidente. Note também que alguns MUs têm suas fibras musculares localizadas fora da área de gravação do eletrodo e não são visíveis em eletromyograma; nesse caso, mudanças na amplitude do estímulo podem ter efeito na força, mas não no potencial de ação.
- Estimule uma unidade motora com um protocolo de estimulação necessário para o objetivo do experimento. Para um protocolo básico de estimulação necessário para calcular todas as propriedades de potenciais de unidade motora básica e potencial de ação, inclua o seguinte.
- Inclua 5 estímulos a 1 Hz (5 simples contrações registradas e médias; a média é eliminar o ruído, o que é especialmente importante para os MUs mais fracos).
- Inclua uma série de estímulos em frequências de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100 e 150 Hz com duração de 500 ms (essas gravações permitem o cálculo da relação força-freqüência, a força tetanica máxima a 150 Hz, bem como a sag em 20-40 Hz de estimulação).
- Inclua o teste de fadiga (tetani evocado por trens de 14 estímulos na frequência de 40 Hz, repetido a cada segundo por 4 minutos).
- Inclua pelo menos intervalos de tempo de 10 s entre todos os elementos do protocolo acima.
- Repita o processo com sucessivas unidades motoras isoladas.
- Termine o experimento e eutanize o animal usando administração intraperitoneal de uma dose letal de sódio pentobarbital (180 mg·kg-1).
5. Aparelho eletrônico
NOTA: O programa de computador personalizado controla o estimulador, proporcionando a possibilidade de criar padrões variáveis de estimulação, incluindo os indicados na etapa 4.4. O programa coopera com o conversor analógico-digital (pelo menos 10 kHz para o MUAP e gravações de força).
- Conecte o amplificador CA ao computador pelo conversor analógico-digital e em paralelo ao osciloscópio.
- Conecte o transdutor de força ao computador pelo conversor analógico-digital e em paralelo ao osciloscópio. Use o transdutor de força para controlar a força muscular passiva durante o experimento. Note que durante o experimento, a força passiva pode diminuir; portanto, é necessário aumentar o comprimento muscular para manter a força muscular passiva constante.
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Representative Results
Os parâmetros de contrações da unidade motora e potenciais de ação podem ser calculados com base em gravações quando as condições estáveis das gravações são garantidas. A Figura 1 apresenta uma gravação representativa do único contração de um MU rápido. O traço superior mostra o potencial de ação da unidade motora. O atraso entre a entrega de estímulos e o início do potencial de ação da unidade motora deve-se ao tempo de condução da raiz ventral para o músculo. A Figura 2 mostra uma gravação representativa da força tétano sem axido de uma MU rápida e um trem de potenciais de ação de unidades motoras.
Figura 1: Uma gravação representativa do único contração de um MU rápido. Sobre a pista de força, há potencial de ação da unidade motora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Uma gravação representativa da força tétano não afusada de um MU rápido (gravação média), um trem de potenciais de ação de unidades motoras (gravação superior) e uma posição de tempo de um trem de estímulos aplicados (abaixo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Se realizado corretamente por cientistas experientes, o componente cirúrgico do protocolo descrito deve ser concluído dentro de aproximadamente duas horas. Deve-se tomar cuidado especial para manter condições fisiológicas estáveis do animal durante a cirurgia, particularmente temperatura corporal e profundidade da anestesia, que deve ser sistematicamente controlada através da avaliação de reflexos de pinna e abstinência. Após a cirurgia, deve ser possível manter condições estáveis de registro por pelo menos seis horas.
O procedimento experimental crucial começa com a divisão da raiz ventral em filamentos muito finos levando ao isolamento de um único axônio motor ao músculo estudado. Na verdade, os filamentos finos das raízes ventrais contêm grupos de axônios inervando diferentes músculos da linha hind; no entanto, como todos os músculos, exceto o estudado, são denervados, quando o feixe estimulado de axônios contém apenas um axônio ao gastrocnemius medial estudado é possível evocar a única contração de MU apenas neste músculo estudado. Após a identificação bem-sucedida da atividade evocada como contração de MU única, é possível registrar um conjunto de gravações de força (contração única, o tétano não afusado, o teste de fadiga) crucial para uma classificação de MU como um dos três tipos fisiológicos. A vantagem dessa técnica é a capacidade de registrar até 30 unidades em um experimento; além disso, os MUs podem ser imediatamente classificados como tipos rápidos ou lentos com base na presença "sag"1,3. Além disso, os MUs podem ser classificados como rápidos ou resistentes a jejum com precisão muito alta com base em um perfil da força de contração tetanic não afusada registrando16. Este último método pode ser usado quando o teste de fadiga clássica não pode ser realizado. Também vale a pena notar que a classificação MU rápida/lenta também pode ser feita com um índice de 20 Hz17.
O protocolo de estimulação proposto (etapa 4.4) pode ser adaptado às necessidades do estudo. Este conjunto particular de estímulos permitem gravar o contração (para calcular parâmetros básicos de contração, incluindo a força de contração, contração, bem como tempo de relaxamento), o tétano máximo (portanto, é possível calcular a relação twitch-tétano), contrações tetanicas não amenadas em um conjunto de frequências de estimulação (classificar um MU como lento ou rápido baseando-se na presença de sag ou índice de 20 Hz, bem como para calcular a curva de frequência de força) e o teste de fadiga (necessário para calcular o índice de fadiga). O cálculo do índice de fadiga é um método básico para classificar as MUs como fatigáveis ou resistentes. Este método está aberto a ser modificado para produzir vários padrões de estimulação; no entanto, uma possível limitação é o programa de computador que gera a distribuição de tempo de estímulos entregues ao axônio. Além disso, algumas modificações adicionais podem ser introduzidas para responder a questões específicas de pesquisa, como vários eletrodos estimulantes para ativar vários MUs em paralelo18, um sensor laser adicional para registrar um mecanomyograma (MMG) da superfície muscular19 ou um eletrodo de gravação em um ramo nervoso para o músculo para calcular a velocidade de condução nervosa20.
No entanto, é importante estar atento às limitações e desafios desse procedimento. Em primeiro lugar, uma parte considerável da configuração experimental é feita sob medida (ou seja, grampos para os segmentos do membro e das vértebras, uma placa para raízes ventrais e eletrodos). A configuração experimental inclui uma mesa metálica sólida com placa (espessura de 30 mm) para todas as barras metálicas de suporte (necessárias para a imobilização animal e o transdutor de força) para permitir condições estáveis para o registro de força isométrica. A aplicação deste método também requer tanto treinamento extensivo em cirurgia como preparação de uma configuração experimental complexa, incluindo um aparelho eletrônico e um programa de computador.
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Disclosures
Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Pesquisa polonês 2018/31/B/NZ7/01028.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Force transducer | custom-made | ||
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11255-20 | Dumont #55 with extra light and fine shanks |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11150-10 | Extra Fine Greafe Forceps |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11026-15 | Special cupped pattern for superior grip |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11023-10 | Slim 1x2 teeth |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11251-20 | Dumont #5 |
| Hemostats | Fine Science Tools | No. 13003-10 | Hartman |
| Isolation Unit | Grass Instruments | S1U5A | |
| Low Noise Bioamplifer | World Precision Instruments | Order code 74030 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | No. 12503-15 | With tungsten carbide jaws |
| Rongeurs | Fine Science Tools | No. 16021-14 | Friedman-Pearson |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14101-14 | Straight sharp/blunt with large finger loops |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14075-11 | Curved blunt/blunt |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14084-08 | Extra fine bonn |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 15000-00 | Straight, ideal for cutting nerves |
| Stimulator | Grass Instruments | S88 | Dual Output Square Pulse Stimulator |
References
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