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Neuroscience

चूहा मध्य मीडिया गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी की एकल मोटर इकाइयों का कार्यात्मक अलगाव

Published: December 26, 2020 doi: 10.3791/61614
Automatic Translation
*1,2, *1
1Department of Neurobiology, Poznań University of Physical Education, 2Department of Biochemistry, Poznań University of Physical Education
* These authors contributed equally

Summary

यह विधि चूहे के मध्याह्न की मांसपेशियों में तीन प्रकार की मोटर इकाइयों में चिकोटी और टेटनिक संकुचन और कार्रवाई क्षमता के बल की रिकॉर्डिंग की अनुमति देती है। एक मोटर इकाई के कार्यात्मक अलगाव अक्षतंतरा की विद्युत उत्तेजना से प्रेरित है।

Abstract

यह काम प्रायोगिक चूहों में हिंडलिब मांसपेशियों (जैसे मध्य गैस्ट्रोकनेमियस, सोलियस, या प्लांटारिस मांसपेशी) में मोटर इकाइयों की विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए एक मानक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधि मोटर इकाइयों (एमएल) के कार्यात्मक अलगाव को रेखांकित करता है। विधि का एक महत्वपूर्ण तत्व वेंट्रल रूट से अलग एक मोटर एक्सॉन को दिया विद्युत उत्तेजनाओं का अनुप्रयोग है। उत्तेजनाओं को निरंतर या परिवर्तनीय अंतर-नाड़ी अंतराल पर वितरित किया जा सकता है। यह विधि परिपक्वता (युवा, वयस्क या बूढ़े) के विभिन्न चरणों में जानवरों पर प्रयोगों के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग हस्तक्षेपों के एक बड़े स्पेक्ट्रम द्वारा पैदा की गई मोटर इकाइयों की परिवर्तनशीलता और प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने वाले प्रयोगों में किया जा सकता है। इन प्रयोगों के परिणाम दोनों मांसपेशियों के शरीर विज्ञान में बुनियादी ज्ञान को बढ़ा सकते हैं और व्यावहारिक अनुप्रयोगों में अनुवाद किया जा सकता है। यह प्रक्रिया मस की रिकॉर्डिंग और उत्तेजना के लिए शल्य चिकित्सा तैयारी पर केंद्रित है, जिसमें तैयारी स्थिरता और परिणामों की प्रजनन क्षमता प्राप्त करने के लिए आवश्यक कदमों पर जोर दिया गया है।

Introduction

मोटर इकाइयां (एमएल) कंकाल की मांसपेशियों की सबसे छोटी कार्यात्मक इकाइयां हैं। इसलिए, उनके कार्य, प्लास्टिसिटी और संकुचन गुणों को समझना, साथ ही उनके बल विनियमन के तंत्र, मांसपेशियों के शरीर विज्ञान में प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है। मस के बुनियादी संकुचन गुणों और उनके शारीरिक प्रकारों के अनुपात को कई मांसपेशियों के लिए प्रलेखित किया गया है, मुख्य रूप से प्रायोगिक जानवरों में हिंडलिब मांसपेशियों। हालांकि, एमयू संपत्तियों की प्लास्टिसिटी और एमयू फोर्स रेगुलेशन के तंत्र दोनों अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं ।

वर्णित विधि का सिद्धांत काठ कशेरुका में जांच किए गए एक और लेमिनेक्टोमी को छोड़कर हिंडलिब मांसपेशियों का व्यापक विनाश है ताकि पतली वेंट्रल रूटलेट तैयार किया जा सके, प्रत्येक एक "कार्यात्मक" मोटर एक्सॉन को तैयार करने के लिए, एमयू के बल और कार्रवाई क्षमता को रिकॉर्ड करने के लिए विद्युत रूप से उत्तेजित किया। इस पेपर में वर्णित तकनीक का उपयोग करके, एक सफल प्रयोग में मध्याह्न गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी के आधे से अधिक एमएल को अलग करना संभव है। चूहा मध्यीय गैस्ट्रोकनेमियस औसतन 52 एमएल (महिलाएं) या तीन शारीरिक प्रकारों के 57 एमएल (पुरुष) से बना है: एस (स्लो), एफआर (फास्ट रेसिस्टेंट) और एफएफ (फास्ट फैटिगेबल)1,2,और वेरिएबल कॉन्ट्रैक्टी गुण3। नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों में एमएच के लिए औसत मूल्यों की तुलना करने वाले प्रयोगों के लिए, इन समूहों में से प्रत्येक के लिए 10-30 मस की अलगाव और रिकॉर्डिंग आवश्यक है। गंभीर रूप से, व्यक्तिगत एमएच एक घंटे से अधिक समय अवधि के लिए उत्तेजना के लिए सुलभ हो सकता है। इसके अलावा, चूंकि यह तकनीक एमयू बल और कार्रवाई क्षमता दोनों को रिकॉर्ड करने की अनुमति देती है, इसलिए यह विधि बल उत्पादन से जुड़ी घटनाओं का अध्ययन करने, थकान के प्रभाव का आकलन करने और बल और कार्रवाई क्षमता के बीच संबंधों को देखने के लिए उपयुक्त है।

पिछले अध्ययनों से पुष्टि की है कि एमयू संकुचन गुण प्लास्टिक हैं और कई हस्तक्षेपों द्वारा संग्राहक किया जा सकता है। यहां वर्णित तकनीक का उपयोग करके प्रयोग चूहे के मध्यीय गैस्ट्रोकनेमियस4 या चूहे की अन्य हिंडलम्ब मांसपेशियों पर किए गए हैं5,6 और साथ ही बिल्ली की मांसपेशियों पर7,एकल एमयू अलगाव की एक समान विधि का उपयोग करके। परिवर्तनीय अंतर-नाड़ी अंतराल पर वितरित उत्तेजनाओं की ट्रेनों का उपयोग करके प्रयोगों की एक और श्रृंखला ने मोटर नियंत्रण प्रक्रियाओं से संबंधित टिप्पणियों को प्रदान किया, और परिणाम सामान्य रूप से उत्तेजना के इतिहास पर ध्यान देते हैं, जिसमें एक उत्तेजना के समय पैमाने में बदलाव के काफी प्रभाव शामिल हैं, जो बल उत्पादन8,9के लिए महत्वपूर्ण हैं।

वैकल्पिक तरीकों का उपयोग करके एमएचयू का भी अध्ययन किया जा सकता है। सबसे पहले, एक विधि मोटोन्यूरॉन्स की सीधी उत्तेजना है। बर्क ने इन न्यूरॉन्स 1,10के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों को निर्धारित करने के लिए समानांतर रूप से उपयोगकिए जाने वाले ग्लास माइक्रोइलेक्ट्रोड्स के साथ बिल्ली के मध्य गैस्ट्रोकेमियस में मोटोन्यूरॉन्स की इंट्रासेलुलर उत्तेजना का उपयोग किया । मानव मांसपेशियों में एमएच का अध्ययन करने के लिए अन्य तरीकों का प्रस्ताव किया गया है, जिसके लिए काफी कम हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है। इन सभी तरीकों के लिए, उत्तेजक और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड मांसपेशियों या तंत्रिका में डाला जाता है, और बल उंगली से या पैर से दर्ज किया जाता है। इन तरीकों में से पहले पृष्ठीय इंटरोसियस मांसपेशियों में मस का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता था। इस मांसपेशी के लिए, एक कम बल के साथ करार, सुई इलेक्ट्रोड के साथ दर्ज इलेक्ट्रोमायोग्राम में मांसपेशियों में डाला केवल एक सक्रिय मोटर इकाई की कार्रवाई क्षमता की पहचान की गई । फिर समानांतर में दर्ज की गई एक मांसपेशी बल के टुकड़े और प्रत्येक कार्रवाई क्षमता के बाद औसत (स्पाइक-ट्रिगर औसत) थे। यह विधि बाहुबल की रिकार्डिंग11से एक मोटर यूनिट के बल को निकालने में सक्षम बनाती है . हालांकि, इस प्रक्रिया की पद्धतिगत कमजोरी यह है कि कोई एक चिकोटी बल नहीं बल्कि टेटनिक संकुचन के टुकड़े औसत थे। मानवमूस का मांसपेशियों में डाले गए इलेक्ट्रोड का उपयोग करके इंट्रामस्कुलर इलेक्ट्रिकल माइक्रोस्टिमुलेशन की दूसरी विधि का भी अध्ययन किया जा सकता है, जो एक अक्षीय पेड़ के टुकड़े को उत्तेजित करता है, जिससे एक मोटर इकाई की सक्रियता होती है। तीसरी विधि तंत्रिका में डाले गए इलेक्ट्रोड के साथ माइक्रोस्टिमुलेशन है। जब इलेक्ट्रोड तंत्रिका में केवल एक मोटर अक्षतंश सक्रिय करता है, तो केवल एक मोटर इकाई13अनुबंध करती है। इन अंतिम तरीकों में कुछ सीमाएं हैं, जिनमें रिकॉर्डिंग की स्थिरता और गुणवत्ता, नैतिक प्रतिबंध और प्रायोगिक सामग्री तक पहुंच शामिल है। इस प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर 70 और 80 के14में बिल्लियों में इस्तेमाल किया गया है ।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किए जाने की आवश्यकता है और पशु देखभाल पर यूरोपीय संघ के दिशा-निर्देशों के साथ-साथ पशुओं के संरक्षण पर राष्ट्रीय कानून का पालन किया जाना चाहिए ।

नोट: इस प्रक्रिया में शामिल प्रत्येक प्रयोगकर्ता को बुनियादी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में प्रशिक्षित किया जाना चाहिए और पशु प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए एक वैध लाइसेंस प्राप्त करना होगा।

1. एनेस्थीसिया

  1. सोडियम पेंटोबार्बिटल (60 एमजीकिलोग्राम -1की प्रारंभिक खुराक) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चूहे को एनेस्थेटाइज करें।
  2. लगभग 5 मिनट के बाद, चूहे के कान या कुंद संदंश के साथ अग्रभाग को चुटकी देकर संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें। प्रोटोकॉल के अगले चरणों में तभी जाएं जब कोई पलटा कार्रवाई न हो।
  3. सर्जरी के दौरान, हर 10-15 मिनट में पलटा क्रियाओं के लिए जानवर की जांच करें और संज्ञाहरण के पूरक हैं यदि जानवर आंदोलन के साथ एक चुटकी का जवाब देता है (आमतौर पर, 10 मिलीग्राम-1· एच-1 सोडियम पेंटोबार्बिटल, आईपी)।

2. सर्जरी

  1. एड़ी से कूल्हे (पहला खंड, मांसपेशी और तंत्रिका अलगाव), एड़ी से कूल्हे (दूसरा खंड, ग्राउंड इलेक्ट्रोड) तक, और पूंछ से छाती खंडों (तीसरा खंड, लैमिनेक्टोमी) तक दाएं हिंडलिम्ब पर फर को शेविंग करके सर्जिकल प्रक्रिया के लिए जानवर तैयार करें। प्रयोग की तीव्र प्रकृति के कारण एंटीसेप्टिक आवश्यक नहीं है।
    1. चूहे को उसके पेट पर हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस ± 1 डिग्री सेल्सियस) पर रखें।
  2. लेमिनेक्टॉमी
    1. तेज कुंद कैंची का उपयोग करना, छाती के कॉलम के साथ त्वचा को काटकर छाती कशेरुका तक।
    2. त्वचा को अंतर्निहित मांसपेशियों से अलग करें।
    3. कुंद टिप कैंची का उपयोग करना, सैक्रम और काठ की स्पिरस प्रक्रियाओं के दोनों किनारों पर लोंगसिमस मांसपेशी को काट दें।
    4. सबसे कम सेगमेंट के रूप में S1 कशेरुका की पहचान करें। तेज कुंद कैंची का उपयोग करना, L6 से L2 कशेरुकी के लिए स्पिनस प्रक्रियाओं को काटें और हटा दें। इसके बाद, ठीक रोंगेश का उपयोग करके, ट्रांसवर्स प्रक्रियाओं एल 6-एल 2 को हटा दें और एल 6 - एल 2 सेगमेंट (पहले ट्रांसवर्स प्रक्रियाओं, फिर लैमिना, एल6 कशेरुकी खंडों के साथ शुरू करें) ड्यूरा मेटर द्वारा कवर की गई रीढ़ की हड्डी के काठ के खंडों को बेनकाब करने के लिए। पवित्र हड्डी और L1 स्पिनस प्रक्रिया को काटने के लिए सावधान रहें, जिसका उपयोग पशु स्थिरीकरण के लिए एक निर्धारण बिंदु के रूप में किया जाएगा।
    5. तेज कैंची का उपयोग करके, लेमिनेक्टोमी की ऊपरी सीमा पर एल2 कशेरुकी खंड स्तर पर रीढ़ की हड्डी (इसके कौडल टुकड़ा) और पृष्ठीय और वेंट्रल जड़ों को काटें। रक्तस्राव को रोकने के लिए सूखे जेल फोम के छोटे टुकड़े रखें। इसके बाद, उजागर रीढ़ की हड्डी के खंडों पर एक पतली, खारा लथपथ कपास ऊन रखें।
  3. मध्य ासी गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी और उसकी तंत्रिका का अलगाव
    1. तेज कुंद कैंची का उपयोग करना, बाएं हिंद अंग के पीछे की ओर एक देशांतर कट बनाने के लिए, दुखती कण्डरा से कूल्हे के लिए ।
    2. संदंश के साथ त्वचा को पकड़ें और चीरा के दोनों किनारों पर अंतर्निहित मांसपेशियों से त्वचा को अलग करें।
    3. घुटने के जोड़ के पीछे पॉपलाइटल फोसा का पता लगाएं, जो बाइसेप्स फेमोरिस मांसपेशी द्वारा कवर किया जाता है। कैंची का उपयोग करना, इस मांसपेशी के पूर्वकाल और पीछे के हिस्से के बीच एक कट बनाओ।
    4. ऊपर की ओर बढ़ते हुए, सियाटिक तंत्रिका को बेनकाब करने के लिए बाइसेप्स फेमोरिस के दो सिर कूल्हे के लिए सभी तरह से काटें।
    5. कुंद संदंश और कैंची का उपयोग करना, गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी के मध्यीय सिर से पार्श्व को अलग करें और मध्य गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी के डिस्टल प्रविष्टि (दुखती कण्डरा) को काट दें। जब तक संभव हो दुखती कण्डरा के टुकड़े को संरक्षित करने के लिए इसका इस्तेमाल करने के लिए बल ट्रांसड्यूसर से कनेक्ट करने के लिए ।
    6. मध्याह्न (एमजी) तंत्रिका की पहचान करें। संदंश और कैंची का उपयोग करके, सियाटिक तंत्रिका के सभी शेष जमानतों को काट लें, जिसमें पीछे के बाइसेप्स और अर्धनिडिनोस को जमानत शामिल है। आपूर्ति रक्त वाहिकाओं को मध्याह्न गैस्ट्रोकनेमियस को बरकरार छोड़ दें।
    7. दुखती कण्डरा के माध्यम से एक गैर-लोचदार लिगामेंट को थ्रेड करें और तीन समुद्री मील बनाएं।
    8. उजागर तंत्रिका और मांसपेशियों के नीचे कपास ऊन का एक खारा लथपथ टुकड़ा रखें।
    9. दांतेदार संदंश का उपयोग करना, संचालित क्षेत्र पर त्वचा को बंद करें।
    10. तेज कुंद कैंची का उपयोग करना, त्वचा में एक 2 सेमी चीरा और एक धातु क्लैंप (3.1.6.) के साथ स्थिरीकरण के लिए बाएं हिंद अंग के पूर्वकाल पक्ष के साथ संयोजी संयोजीय ऊतक अंतर्निहित बनाते हैं।

3. रिकॉर्डिंग और उत्तेजना के लिए तैयारी

  1. कशेरुकी कॉलम और पैर निर्धारण और मांसपेशियों की व्यवस्था
    1. स्टील क्लैंप का इस्तेमाल करते हुए टिबिया पर क्लैंप लगाकर लेफ्ट लाज अंग को ठीक करें।
    2. चूहे को कस्टम-निर्मित समायोज्य फ्रेम (अलग तांबे के तार, 1 मिमी) में रखें, चार लिगेचर का उपयोग करके लेमिनेक्टॉमी के चारों ओर त्वचा के फ्लैप खींचें और त्वचा को फ्रेम में सीवन करें ताकि उजागर रीढ़ की हड्डी पर पैराफिन तेल (आकार लगभग 50 मिमी x 50 मिमी) के लिए एक पूल बनाया जा सके।
    3. एक ड्यूमोंट #55 संदंश का उपयोग करके, रीढ़ की हड्डी के चौराहे पर ड्यूरा मेटर उठाएं, इसे पवित्र हड्डी तक काटें और इसे वापस लें।
    4. एक कुंद कांच की छड़ का उपयोग करना, लगातार स्तर पर अलग बाएं और दाएं पृष्ठीय और वेंट्रल जड़ों का उपयोग करना, उन्हें नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखना।
    5. रीढ़ की हड्डी पर पूल को गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पैराफिन तेल के साथ भरें, जो उजागर वेंट्रल और पृष्ठीय जड़ों को कवर करता है।
    6. बंद लूप हीटिंग सिस्टम से जुड़े अपने हिंडलिंब्स के लिए एक पूल (लंबाई 135 मिमी, चौड़ाई 100 मिमी, गहराई 45 मिमी) के साथ कस्टम-निर्मित एल्यूमीनियम प्लेट (लंबाई 260 मिमी, चौड़ाई 120 मिमी, ऊंचाई 80 मिमी) पर चूहे को रखें। प्लेट एक ऐसी जगह है जहां जानवर को स्थिर किया जाएगा और प्रयोग किया जाएगा।
    7. हिंदीम्ब को स्थिर करने के लिए धातु के बार के साथ बाईं हिंडलिम्ब पर लगाए गए क्लैंप को ठीक करें।
    8. पशु शरीर को स्थिर करने और श्वसन आंदोलनों से संबंधित बल रिकॉर्डिंग में कलाकृतियों को खत्म करने के लिए पवित्र हड्डी और एल1 कशेरुका पर स्टील क्लैंप डालकर कशेरुकी कॉलम को ठीक करें।
    9. दुखती कण्डरा के माध्यम से बाएं मध्यीय गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी को गैर-लोचदार लिगेचर के साथ फोर्स ट्रांसड्यूसर (50 माइक्रोन/250 एमएन, माप सीमा 0-1000 टन के अनुपालन के साथ) से कनेक्ट करें।
    10. मध्यीय गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशियों को कवर करने के लिए गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पैराफिन तेल के साथ हिंडलिम्ब्स के लिए कक्ष भरें और तापमान जांच और स्वचालित प्रणाली का उपयोग करके 1 डिग्री सेल्सियस ± 37 डिग्री सेल्सियस पर तेल का तापमान बनाए रखें।
  2. कार्रवाई क्षमता रिकॉर्डिंग और उत्तेजना के लिए इलेक्ट्रोड की नियुक्ति
    1. मध्यीय गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी के मध्य भाग के माध्यम से एक द्विध्रुवी चांदी के तार इलेक्ट्रोड डालें, अपनी लंबी धुरी के लंबवत। मांसपेशियों की एक लंबी धुरी के साथ स्थित दो इलेक्ट्रोड के बीच लगभग 5 मिमी दूरी बनाए रखें। इन इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल मोटर यूनिट एक्शन क्षमता (MUAPs) रिकॉर्ड करने के लिए किया जाएगा। इलेक्ट्रोड को कम शोर वाले एम्पलीफायर से कनेक्ट करें।
    2. संचालित मांसपेशियों को 100 टन के निष्क्रिय तनाव में फैलाएं, जो बल ट्रांसड्यूसर द्वारा नियंत्रित होता है। इस खंड में चूहे के मध्यीय गैस्ट्रोकनेमियस के लिए तीन प्रकार के मस सबसे अधिक चिकोटी बल15विकसित करते हैं ।
    3. तेज कुंद कैंची का उपयोग करना, सही हिंद अंग की त्वचा में एक 2 सेमी चीरा बनाने के लिए और एक संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक चांदी के तार इलेक्ट्रोड डालें ।
    4. उजागर रीढ़ की हड्डी की जड़ों के ऊपर एक कस्टम-निर्मित अछूता धातु प्लेट (आकार 30 मिमी x 13 मिमी) रखें और ठीक करें। प्लेट पर वेंट्रल और पृष्ठीय जड़ों (L4, L5 और L6) के बाएं जोड़े रखो।
    5. लेमिनेक्टॉमी के आसपास त्वचा द्वारा गठित पूल में खारा जोड़ें। लवकुश का स्तर रिलेटेड प्लेट से नीचे होना चाहिए।
    6. उजागर रीढ़ की जड़ों पर एक चांदी के तार उत्तेजक इलेक्ट्रोड (दो चांदी के तार, 0.5 मिमी व्यास, लंबाई 50 मिमी) रखें, तेल में प्लेट के ऊपर एक सकारात्मक ध्रुव 3 मिमी रखें, जबकि नमकीन में नकारात्मक ध्रुव (प्लेट के नीचे पूल में जोड़ा गया) और उत्तेजक से कनेक्ट करें।

4. मोटर यूनिट रिकॉर्डिंग

  1. विद्युत आयताकार दालों (0.1 एमएस अवधि, 0.5 वी तक आयाम) के साथ उत्तेजक, वेंट्रल जड़ों (एल 4, एल 5 और एल 6) का चयन करें; वेंट्रल रूट उत्तेजना मांसपेशियों के संकुचन का उदाहरण देती है जबकि पृष्ठीय जड़ों के लिए ऐसा कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। थाली से पृष्ठीय जड़ों को खत्म करें। मध्याह्न के लिए, अधिकांश एक्सॉन L5 वेंट्रल रूट में होते हैं।
  2. ड्यूमोंट #55 की एक जोड़ी का उपयोग करके, संदंश और आवर्धक चश्मे, एक्सॉन के बहुत ठीक बंडलों में L5 या L4 वेंट्रल जड़ों को विभाजित करें (दोनों संदंश के साथ वेंट्रल रूटलेट के कट एंड को समझें और रूटलेट को अलग करें); इन बंडलों में से एक को चांदी के तार इलेक्ट्रोड पर रखें और एक एमयू की गतिविधि को प्राप्त करने के लिए आयाम की 0.1 मिलियन आयताकार दालों को उत्तेजित करें (0.1 मिलियन आयताकार दालें) । एक ठोस समर्थन (धातु पट्टी) अक्षों के पतले बंडलों में हेरफेर करने के लिए बहुत उपयोगी है, जिसका उपयोग संदंश का उपयोग करने के लिए हाथ समर्थन के रूप में किया जा सकता है। यह भी ध्यान दें कि प्रकाश का एक अतिरिक्त स्रोत आवश्यक है।
  3. उत्तेजना की तीव्रता को उत्तरोत्तर बढ़ाकर, चिकोटी संकुचन और कार्रवाई संभावित उत्तेजना के "सभी या कोई नहीं" चरित्र के आधार पर एक एमयू की पहचान करें। सीमा के चारों ओर उत्तेजना पर पैदा की गई गतिविधि का सावधानीपूर्वक परीक्षण करें।
    1. जब एक से अधिक एमयू का अध्ययन की गई मांसपेशियों में करार हो रहा है और बल के बढ़ते स्तर के साथ-साथ बढ़ते आयाम या कार्रवाई क्षमता के बदलते आकार दिखाई देते हैं, तो 4.2 कदम पर वापस जाएं और एक्सॉन के बंडल को फिर से विभाजित करें। ध्यान दें कि चूहा मध्याह्न में सबसे मजबूत एमयू में सबसे कमजोर लोगों की तुलना में लगभग 70 गुना बड़ा चिकोटी बल होता है और जब बहुत मजबूत एमयू दूसरे को झटक रहा होता है, तो कमजोर एमयू स्पष्ट नहीं हो सकता है। यह भी ध्यान दें कि कुछ मस के पास इलेक्ट्रोड के रिकॉर्डिंग क्षेत्र से बाहर स्थित उनकी मांसपेशी फाइबर होते हैं और इलेक्ट्रोमायोग्राम में दिखाई नहीं देते हैं; ऐसे मामले में उत्तेजना आयाम में परिवर्तन बल में प्रभाव हो सकता है लेकिन कार्रवाई की क्षमता में नहीं।
  4. प्रयोग के उद्देश्य के लिए आवश्यक उत्तेजना प्रोटोकॉल के साथ एक मोटर इकाई को उत्तेजित करें। सभी बुनियादी मोटर इकाई संकुचन और कार्रवाई क्षमता गुणों की गणना करने के लिए आवश्यक एक बुनियादी उत्तेजना प्रोटोकॉल के लिए, निम्नलिखित शामिल हैं।
    1. 1 हर्ट्ज पर 5 उत्तेजनाओं को शामिल करें (5 एकल चिकोटी दर्ज और औसत; औसत शोर को नष्ट कर रहा है, जो सबसे कमजोर मस के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है)।
    2. 500 एमएस की अवधि के साथ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100 और 150 हर्ट्ज आवृत्तियों पर उत्तेजनाओं की एक श्रृंखला शामिल करें (ये रिकॉर्डिंग बल-आवृत्ति संबंधों की गणना को सक्षम करती हैं, 150 हर्ट्ज पर अधिकतम टेटेनिक बल के साथ-साथ 20-40 हर्ट्ज उत्तेजना पर शिथिलता)।
    3. थकान परीक्षण (40 हर्ट्ज आवृत्ति पर 14 उत्तेजनाओं की ट्रेनों द्वारा पैदा की गई टेटनी, 4 मिनट के लिए हर सेकंड दोहराया) शामिल करें।
    4. ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल के सभी तत्वों के बीच कम से कम 10 एस समय अंतराल शामिल करें।
    5. इस प्रक्रिया को लगातार अलग-थलग मोटर इकाइयों के साथ दोहराएं।
  5. प्रयोग को समाप्त करें और पेंटोबार्बिटल सोडियम (180 मिलीग्राम किलो -1)की घातक खुराक के इंट्रापेरिटोनियल प्रशासन का उपयोग करके जानवर को इच्छामृत्यु दें।

5. इलेक्ट्रॉनिक उपकरण

नोट: कस्टम-निर्मित कंप्यूटर प्रोग्राम उत्तेजक को नियंत्रित करता है, जिससे उत्तेजना के चर पैटर्न बनाने की संभावना प्रदान होती है, जिसमें चरण 4.4 में इंगित किए गए लोग शामिल हैं। कार्यक्रम एनालॉग-टू-डिजिटल कनवर्टर (MUAP और बल रिकॉर्डिंग के लिए कम से कम 10 किलोहर्ट्ज) के साथ सहयोग करता है।

  1. एनालॉग-टू-डिजिटल कनवर्टर द्वारा और ऑसिलोस्कोप के समानांतर एसी एम्पलीफायर को कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
  2. एनालॉग-टू-डिजिटल कनवर्टर द्वारा और ऑसिलोस्कोप के समानांतर कंप्यूटर से फोर्स ट्रांसड्यूसर कनेक्ट करें। प्रयोग के दौरान निष्क्रिय मांसपेशी बल को नियंत्रित करने के लिए बल ट्रांसड्यूसर का उपयोग करें। ध्यान दें कि प्रयोग के दौरान, निष्क्रिय बल कम हो सकता है; इसलिए, निष्क्रिय मांसपेशियों को स्थिर रखने के लिए मांसपेशियों की लंबाई बढ़ाना आवश्यक है।

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Representative Results

रिकॉर्डिंग की स्थिर स्थितियों को सुनिश्चित किए जाने पर रिकॉर्डिंग के आधार पर मोटर यूनिट संकुचन और कार्रवाई क्षमता के मापदंडों की गणना की जा सकती है। चित्रा 1 एक तेजी से एमयू के एकल चिकोटी की एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग प्रस्तुत करता है। ऊपरी ट्रेस मोटर यूनिट एक्शन क्षमता को दर्शाता है। प्रोत्साहन वितरण और मोटर इकाई कार्रवाई क्षमता की शुरुआत के बीच देरी वेंट्रल रूट से मांसपेशियों के लिए चालन समय के कारण है। चित्रा 2 एक तेजी से एमयू के उधमित टेटनस बल और मोटर यूनिट एक्शन क्षमता की एक ट्रेन की एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग से पता चलता है ।

Figure 1
चित्रा 1: एक तेजी से एमयू के एकल चिकोटी की एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग। फोर्स ट्रैक के ऊपर मोटर यूनिट एक्शन की संभावना है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक फास्ट एमयू (मध्य रिकॉर्डिंग), मोटर यूनिट एक्शन क्षमता (ऊपरी रिकॉर्डिंग) की एक ट्रेन और एप्लाइड उत्तेजनाओं (नीचे) की ट्रेन की एक समय की स्थिति के unfused टेटनस बल की एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यदि अनुभवी वैज्ञानिकों द्वारा सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है, तो वर्णित प्रोटोकॉल के शल्य घटक को लगभग दो घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए। सर्जरी के दौरान जानवर की स्थिर शारीरिक स्थितियों को बनाए रखने के लिए विशेष रूप से ध्यान रखना चाहिए, विशेष रूप से शरीर के तापमान और संज्ञाहरण की गहराई, जिसे पिन्ना और वापसी सजगता का आकलन करके व्यवस्थित रूप से नियंत्रित किया जाना चाहिए। सर्जरी के बाद, कम से कम छह घंटे के लिए स्थिर रिकॉर्डिंग की स्थिति बनाए रखना संभव होना चाहिए।

महत्वपूर्ण प्रायोगिक प्रक्रिया वेंट्रल रूट के विभाजन के साथ बहुत पतली फिलामेंट्स में शुरू होती है जिससे अध्ययन की गई मांसपेशियों में एक मोटर एक्सॉन का अलगाव होता है। वास्तव में, वेंट्रल जड़ों के पतले तंतु में हिंडलिब की विभिन्न मांसपेशियों को इनरवेट करने वाले एक्सॉन के समूह होते हैं; हालांकि, क्योंकि अध्ययन किए गए सभी मांसपेशियों को छोड़कर सभी मांसपेशियों को विकृत कर दिया जाता है, जब एक्सॉन के उत्तेजित बंडल में अध्ययन किए गए मध्याह्न गैस्ट्रोकनेमियस के लिए केवल एक एक्सॉन होता है, केवल इस अध्ययन की गई मांसपेशियों में एकल एमयू संकुचन पैदा करना संभव है। एकल एमयू संकुचन के रूप में पैदा की गतिविधि की सफल पहचान के बाद, तीन शारीरिक प्रकारों में से एक के रूप में एमयू के वर्गीकरण के लिए महत्वपूर्ण बल रिकॉर्डिंग (एकल चिकोटी, अनफ्यूज्ड टिटनेस, थकान परीक्षण) का एक सेट रिकॉर्ड करना संभव है। इस तकनीक का लाभ एक प्रयोग में 30 इकाइयों तक रिकॉर्ड करने की क्षमता है; इसके अतिरिक्त, एमएचएस को तुरंत "शिथिलता" उपस्थिति1, 3के आधार पर तेज या धीमी गति से प्रकार के रूप में वर्गीकृत किया जासकताहै। इसके अलावा, एमएचयू को16रिकॉर्डिंग के एक प्रोफ़ाइल के आधार पर बहुत अधिक सटीकता के साथ तेजी से वसा योग्य या तेजी से प्रतिरोधी के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। इस अंतिम विधि का उपयोग तब किया जा सकता है जब शास्त्रीय थकान परीक्षण नहीं किया जा सकता है। यह भी उल्लेखनीय है कि फास्ट/स्लो एमयू वर्गीकरण 20 हर्ट्ज इंडेक्स17के साथ भी किया जा सकता है ।

प्रस्तावित उत्तेजना प्रोटोकॉल (चरण 4.4) को अध्ययन की जरूरतों के अनुकूल बनाया जा सकता है। उत्तेजना का यह विशेष सेट चिकोटी रिकॉर्ड करने में सक्षम (चिकोटी बल सहित बुनियादी चिकोटी मापदंडों की गणना करने के लिए, संकुचन के साथ-साथ विश्राम का समय), अधिकतम टेटनस (इसलिए चिकोटी-से-टेटनस अनुपात की गणना करना संभव है), उत्तेजना आवृत्तियों के एक सेट पर अनफ्यूज्ड टेटनिक संकुचन (एसएजी उपस्थिति या 20 हर्ट्ज इंडेक्स पर धीमी या तेज आधार के रूप में एक एमयू को वर्गीकृत करने के साथ-साथ बल-आवृत्ति वक्र की गणना करने के लिए) और थकान परीक्षण (थकान सूचकांक की गणना करने के लिए आवश्यक)। थकान सूचकांक गणना एक बुनियादी विधि के लिए वसा योग्य या प्रतिरोधी के रूप में MUs वर्गीकृत है । यह विधि विभिन्न उत्तेजना पैटर्न का उत्पादन करने के लिए संशोधित किया जा रहा करने के लिए खुला है; हालांकि, एक संभावित सीमा कंप्यूटर प्रोग्राम है जो अक्षति को वितरित उत्तेजनाओं के समय वितरण को उत्पन्न करता है। इसके अलावा, विशिष्ट शोध प्रश्नों का उत्तर देने के लिए कुछ अतिरिक्त संशोधन शुरू किए जा सकते हैं, जैसे कि समानांतर18में कई एमयू को सक्रिय करने के लिए कई उत्तेजक इलेक्ट्रोड, मांसपेशियों की सतह19 से एक मशीनोमोयोग्राम (एमएमजी) रिकॉर्ड करने के लिए एक अतिरिक्त लेजर सेंसर या तंत्रिका चालन वेग20की गणना करने के लिए मांसपेशियों में एक तंत्रिका शाखा पर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड।

हालांकि, इस प्रक्रिया की सीमाओं और चुनौतियों से अवगत होना जरूरी है । सबसे पहले, प्रायोगिक सेटअप का एक काफी हिस्सा कस्टम-मेड (यानी, अंग और कशेरुकी खंडों के लिए क्लैंप, वेंट्रल जड़ों और इलेक्ट्रोड के लिए एक प्लेट) है। प्रयोगात्मक सेटअप में आइसोमेट्रिक बल रिकॉर्डिंग के लिए स्थिर स्थितियों को सक्षम करने के लिए सभी सहायक धातु सलाखों (पशु स्थिरीकरण और बल ट्रांसड्यूसर के लिए आवश्यक) के लिए प्लेट (मोटाई 30 मिमी) के साथ एक ठोस धातु तालिका शामिल है। इस विधि के आवेदन के लिए सर्जरी में व्यापक प्रशिक्षण के साथ-साथ एक इलेक्ट्रॉनिक उपकरण और कंप्यूटर प्रोग्राम सहित एक जटिल प्रयोगात्मक सेटअप तैयार करने की भी आवश्यकता होती है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को पोलिश नेशनल रिसर्च सेंटर ग्रांट 2018/31/B/NZ7/01028 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Force transducer custom-made
Forceps Fine Science Tools No. 11255-20 Dumont #55 with extra light and fine shanks
Forceps Fine Science Tools No. 11150-10 Extra Fine Greafe Forceps
Forceps Fine Science Tools No. 11026-15 Special cupped pattern for superior grip
Forceps Fine Science Tools No. 11023-10 Slim 1x2 teeth
Forceps Fine Science Tools No. 11251-20 Dumont #5
Hemostats Fine Science Tools No. 13003-10 Hartman
Isolation Unit Grass Instruments S1U5A
Low Noise Bioamplifer World Precision Instruments Order code 74030
Needle holders Fine Science Tools No. 12503-15 With tungsten carbide jaws
Rongeurs Fine Science Tools No. 16021-14 Friedman-Pearson
Scissors Fine Science Tools No. 14101-14 Straight sharp/blunt with large finger loops
Scissors Fine Science Tools No. 14075-11 Curved blunt/blunt
Scissors Fine Science Tools No. 14084-08 Extra fine bonn
Scissors Fine Science Tools No. 15000-00 Straight, ideal for cutting nerves
Stimulator Grass Instruments S88 Dual Output Square Pulse Stimulator

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 166 मोटर यूनिट कंकाल मांसपेशी गैस्ट्रोकनेमियस वेंट्रल जड़ें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी चूहा
चूहा मध्य मीडिया गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी की एकल मोटर इकाइयों का कार्यात्मक अलगाव
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Drzymała-Celichowska, H., Celichowski, J. Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle. J. Vis. Exp. (166), e61614, doi:10.3791/61614 (2020).

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