Summary
Este método permite el registro de la fuerza de contracciones de contracción y tetánicas y potencial de acción en tres tipos de unidades motoras en el músculo gastrocnemius medial de rata. El aislamiento funcional de una sola unidad de motor es inducido por la estimulación eléctrica del axón.
Abstract
Este trabajo describe el aislamiento funcional de las unidades motoras (MUs), un método electrofisiológico estándar para determinar las características de las unidades motoras en los músculos de las extremidades posteriores (como el gastrocnemius medial, el soleus o el músculo plantaris) en ratas experimentales. Un elemento crucial del método es la aplicación de estímulos eléctricos entregados a un axón motor aislado de la raíz ventral. Los estímulos pueden entregarse a intervalos de inter-pulsos constantes o variables. Este método es adecuado para experimentos en animales en diferentes etapas de madurez (jóvenes, adultos o ancianos). Además, este protocolo se puede utilizar en experimentos que estudian la variabilidad y plasticidad de las unidades motoras evocadas por un amplio espectro de intervenciones. Los resultados de estos experimentos pueden aumentar el conocimiento básico en fisiología muscular y traducirse en aplicaciones prácticas. Este procedimiento se centra en la preparación quirúrgica para el registro y estimulación de MUs, con énfasis en los pasos necesarios para lograr la estabilidad de la preparación y la reproducibilidad de los resultados.
Introduction
Las unidades motoras (MUs) son las unidades funcionales más pequeñas de los músculos esqueléticos. Por lo tanto, la comprensión de su función, plasticidad y propiedades contráctiles, así como los mecanismos de su regulación de la fuerza, es crucial para el progreso en la fisiología muscular. Las propiedades contráctiles básicas de las SU y las proporciones de sus tipos fisiológicos se han documentado para numerosos músculos, predominantemente los músculos de la extremidad posterior en animales experimentales. Sin embargo, tanto la plasticidad de las propiedades MU como los mecanismos de regulación de la fuerza MU todavía no se entienden completamente.
El principio del método descrito es la denervación extensiva de los músculos de la extremidad posterior, excepto la investigada y la laminectomía en las vértebras lumbares con el fin de preparar las raíces ventrales delgadas, cada una de las que contiene un solo axón motor "funcional", estimulada eléctricamente para registrar la fuerza y el potencial de acción del MU. Usando la técnica descrita en este artículo, es posible aislar más de la mitad de las MUs del músculo gastrocnemius medial en un experimento exitoso. La rata medial gastrocnemius se compone de una media de 52 MUs (hembras) o 57 SU (machos) de tres tipos fisiológicos: S (lento), FR (resistente rápido) y FF (fatigable rápido)1,2, y tienen propiedades contráctiles variables3. Para los experimentos que comparan los valores medios de las UNIDADes de manipulación en los grupos de control y experimentales, es necesario el aislamiento y la grabación de 10-30 MUs para cada uno de estos grupos. Críticamente, las UNIDADes de estado individuales pueden ser accesibles para la estimulación durante períodos de tiempo superiores a una hora. Además, dado que esta técnica permite registrar tanto la fuerza MU como los potenciales de acción, este método es adecuado para estudiar los fenómenos asociados con la producción de fuerza, evaluar el efecto de la fatiga y observar la relación entre la fuerza y los potenciales de acción.
Estudios anteriores han confirmado que las propiedades contráctiles MU son plásticas y pueden ser moduladas por numerosas intervenciones. Los experimentos con la técnica descrita aquí se han realizado en la rata medial gastrocnemius4 u otros músculos de la extremidad posterior de la rata5,6 así como en los músculos del gato7,utilizando un método similar de aislamiento MU único. Otra serie de experimentos utilizando trenes de estímulo entregados a intervalos de interbozo variables proporcionaron observaciones sobre los procesos de control motor, y los resultados en general atención a la historia de la estimulación, incluyendo efectos considerables de un cambio en la escala de tiempo de incluso un estímulo, crucial para la producción de fuerza8,9.
Las SU también se pueden estudiar utilizando métodos alternativos. En primer lugar, un método es la estimulación directa de motoneurones. Burke utilizó la estimulación intracelular de motoneurones en el gas gastrocnemius medial y soleus con microelectrodos de vidrio utilizados en paralelo para determinar las propiedades electrofisiológicas de estas neuronas1,10. Se han propuesto otros métodos para estudiar las SU en los músculos humanos, que requieren una intervención considerablemente menor. Para todos estos métodos, los electrodos estimulantes y de grabación se insertan en el músculo o nervio, y la fuerza se registra desde el dedo o desde el pie. El primero de estos métodos se utilizó para estudiar MUs en el primer músculo interosseoso dorsal. Para este músculo, con una fuerza baja, en el electromiograma registrado con el electrodo de aguja insertado en el músculo se identificaron los potenciales de acción de una sola unidad motora activa. Luego se promediaron los fragmentos de una fuerza muscular registrada en paralelo y después de cada potencial de acción (promedio activado por picos). Este método permite la extracción de la fuerza de una unidad motora de la grabación de la fuerza muscular11. Sin embargo, la debilidad metodológica de este procedimiento es que no se promedió una sola fuerza de contracción, sino fragmentos de contracciones tetánicas. Las SU humanas también pueden estudiarse utilizando el segundo método de microestimulación eléctrica intramuscular utilizando un electrodo insertado en el músculo12,que estimula un fragmento de un árbol axonal, lo que conduce a la activación de una sola unidad motora. El tercer método es la microestimulación con un electrodo insertado en el nervio. Cuando el electrodo activa sólo un axón motor en el nervio, sólo una unidad de motor contrae13. Estos últimos métodos tienen algunas limitaciones, incluyendo la estabilidad y la calidad del registro, las restricciones éticas y el acceso al material experimental. Este protocolo ha sido ampliamente utilizado en gatos en los años 70 y 8014.
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Protocol
Todos los procedimientos deben ser aprobados por el comité de ética local y adheridos a las directrices de la Unión Europea sobre el cuidado de los animales, así como a la legislación nacional sobre la protección de los animales.
NOTA: Cada experimentador involucrado en este procedimiento debe ser entrenado en procedimientos quirúrgicos básicos y tiene que obtener una licencia válida para realizar experimentos con animales.
1. Anestesia
- Anestesiar a la rata con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (una dosis inicial de 60 mg-kg-1).
- Después de aproximadamente 5 minutos, compruebe la profundidad de la anestesia pellizcando la oreja de la rata o la extremidad delantera con fórceps romo. Vaya a los siguientes pasos del protocolo solo cuando no se observe ninguna acción reflex.
- Durante la cirugía, revise al animal en busca de acciones reflejos cada 10-15 minutos y complemente la anestesia si el animal responde a un pellizco con movimiento (generalmente, 10 mg-kg-1áh-1 pentobarbital de sodio, IP).
2. Cirugía
- Preparar al animal para el procedimiento quirúrgico afeitando el pelaje sobre la extremidad posterior izquierda desde el talón hasta la cadera (el primer segmento, el aislamiento muscular y nervioso), la extremidad posterior derecha desde el talón hasta la cadera (el segundo segmento, electrodo molido), y la parte posterior de la cola a los segmentos torácicos (el tercer segmento, laminectomía). Antiséptico no es necesario debido a la naturaleza aguda del experimento.
- Colocar la rata sobre su abdomen sobre una almohadilla calefactora (37 oC ± 1 oC.)
- Laminectomy
- Usando tijeras afiladas y contundentes, corta la piel a lo largo de la columna vertebral desde el sacro hasta las vértebras torácicas.
- Separe la piel de los músculos subyacentes.
- Usando tijeras de punta contundentes, corte el músculo longissimus en ambos lados del sacro y los procesos espinosos lumbares.
- Identifique la vértebra S1 como el segmento más bajo. Usando tijeras afiladas y contundentes, corte y retire los procesos espinosos de las vértebras L6 a L2. A continuación, utilizando rongeurs finos, eliminar los procesos transversales L6-L2 y realizar una laminectomía sobre L6 – L2 segmentos (primeros procesos transversales, luego lámina, comenzar con L6 segmento vertebral) para exponer los segmentos lumbares de la médula espinal cubiertos por la dura mater. Tenga cuidado de no cortar el hueso sacro y el proceso espinoso L1, que se utilizará como punto de fijación para la inmovilización animal.
- Usando tijeras afiladas, corta la médula espinal (su fragmento caudal) y las raíces dorsales y ventrales a nivel del segmento de vértebras L2, en el borde superior de la laminectomía. Coloque pequeños trozos de espuma de gel seco para detener el sangrado. A continuación, coloque una lana de algodón fina y empapada en solución salina sobre los segmentos expuestos de la médula espinal.
- Aislamiento del músculo gastrocnemius medial y su nervio
- Usando tijeras afiladas y contundentes, haz un corte longitudinal en el lado posterior de la extremidad posterior izquierda, desde el tendón de Aquiles hasta la cadera.
- Agarre la piel con los fórceps y separe la piel de los músculos subyacentes a ambos lados de la incisión.
- Localice la fosa popliteal en la parte posterior de la articulación de la rodilla, que está cubierta por el músculo femoris del bíceps. Usando tijeras, haz un corte entre la parte anterior y posterior de este músculo.
- Moviéndose hacia arriba, corte las dos cabezas del bíceps femoris hasta la cadera para exponer el nervio ciático.
- Usando fórceps y tijeras contundentes, separe el lateral de la cabeza medial del músculo gastrocnemius y corte la inserción distal (tendón de Aquiles) del músculo gastrocnemius medio. Conservar el fragmento del tendón de Aquiles el mayor tiempo posible para utilizarlo para conectarse al transductor de fuerza.
- Identificar el nervio gastrocnemius medial (MG). Usando los fórceps y las tijeras, corta todos los colaterales restantes del nervio ciático, incluyendo colaterales a los bíceps posteriores y semitendinosus. Deje intactos los vasos sanguíneos de suministro al gastrocnemius medial.
- Enhebrar una ligadura no elástica a través del tendón de Aquiles y hacer tres nudos.
- Coloque un trozo de lana de algodón empapado en solución salina debajo del nervio y el músculo expuestos.
- Usando fórceps serrados, cierre la piel sobre el área operada.
- Usando tijeras afiladas y contundentes, haga una incisión de 2 cm en la piel y el tejido conectivo subyacente a lo largo del lado anterior de la extremidad posterior izquierda para la inmovilización con una abrazadera metálica (3.1.6.).
3. Preparación para la grabación y estimulación
- Columna vertebral y fijación de piernas y disposición muscular
- Con una abrazadera de acero, fije la extremidad posterior izquierda colocando la abrazadera en la tibia.
- Coloque la rata en el marco ajustable a medida (alambre de cobre aislado, 1 mm), tire hacia arriba de los colgajos de la piel alrededor de la laminectomía usando cuatro ligaduras y suturar la piel al marco con el fin de formar una piscina para aceite de parafina (tamaño aproximadamente 50 mm x 50 mm) sobre la médula espinal expuesta.
- Usando un Dumont #55 fórceps, levante el dura mater en la intersección de la médula espinal, córtelo caudalmente hasta el hueso sacro y retraigalo.
- Usando una varilla de vidrio roma, separe las raíces dorsales y ventrales izquierda y derecha a niveles sucesivos, teniendo cuidado de no dañarlas.
- Llene la piscina sobre la médula espinal con aceite de parafina caliente (37 oC), cubriendo las raíces ventrales y dorsales expuestas.
- Coloque la rata sobre la placa de aluminio a medida (longitud 260 mm, anchura 120 mm, altura 80 mm) con una piscina (longitud 135 mm, anchura 100 mm, profundidad 45 mm) para sus extremidades traseras conectadas al sistema de calefacción de bucle cerrado. La placa es un lugar donde el animal será inmovilizado y se realizará el experimento.
- Fije la abrazadera puesta en la extremidad posterior izquierda con la barra de metal para inmovilizar el hindimb.
- Fijar la columna vertebral colocando abrazaderas de acero en el hueso sacro y la vértebra L1 para inmovilizar el cuerpo del animal y eliminar los artefactos en las grabaciones de fuerza relacionadas con los movimientos respiratorios.
- Conecte el músculo gastrocnemius medial izquierdo con la ligadura no elástica al transductor de fuerza (con cumplimiento de 50 m/250 mN, rango de medición 0-1000 mN) a través del tendón de Aquiles.
- Llenar la cámara para las patas traseras con aceite de parafina caliente (37 oC) para cubrir el músculo gastrocnemius medial y mantener la temperatura del aceite a 37 oC ± 1 oC utilizando la sonda de temperatura y el sistema automático.
- Colocación de electrodos para la grabación y estimulación de potenciales de acción
- Inserte un electrodo bipolar de alambre de plata a través de la parte media del músculo gastrocnemius medial, perpendicular a su eje largo. Mantener alrededor de 5 mm de distancia entre los dos electrodos situados a lo largo de un eje largo del músculo. Estos electrodos se utilizarán para registrar potenciales de acción de la unidad de motor (MUAPs). Conecte los electrodos al amplificador de bajo ruido.
- Estirar el músculo operado a una tensión pasiva de 100 mN, controlada por el transductor de fuerza. Para el gastrocnemius medial de rata en este tramo, las UNIDADes de tres tipos desarrollan la fuerza de contracción más alta15.
- Usando tijeras afiladas y contundentes, haga una incisión de 2 cm en la piel de la extremidad posterior derecha e inserte un electrodo de alambre plateado para ser utilizado como electrodo de referencia.
- Coloque y fije una placa metálica aislada hecha a medida (tamaño 30 mm x 13 mm) por encima de las raíces espinales expuestas. Ponga en la placa pares izquierdos de raíces ventrales y dorsales (L4, L5 y L6).
- Añadir solución salina a la piscina formada por la piel alrededor de la laminectomía. El nivel de solución salina debe estar por debajo de la placa aislada.
- Coloque un electrodo estimulante de alambre de plata (dos hilos de plata, 0,5 mm de diámetro, longitud 50 mm) sobre las raíces espinales expuestas, coloque un polo positivo 3 mm por encima de la placa en aceite, mientras que el polo negativo en la solución salina (añadido a la piscina, debajo de la placa) y conéctese al estimulador.
4. Grabaciones de la unidad de motor
- Estimular con pulsos rectangulares eléctricos (0,1 ms de duración, amplitud de hasta 0,5 V), seleccionar las raíces ventrales (L4, L5 y L6); estimulación de la raíz ventral evoca la contracción de los músculos, mientras que no existe tal efecto para las raíces dorsales. Eliminar las raíces dorsales de la placa. Para el gastrocnemius medial, la mayoría de los axones están en la raíz ventral L5.
- Usando un par de fórceps y lupas de Dumont #55, divida las raíces ventrales L5 o L4 en haces muy finos de axones (agarra el extremo cortado de la raíz ventral con ambos fórceps y pela las raíces separadas); colocar uno de estos paquetes en un electrodo de alambre de plata y estimular (0,1 ms pulsos rectangulares de amplitud hasta 0,5 V) para lograr la actividad de un solo MU. Un soporte sólido (barra metálica) es muy útil para manipular bultos finos de axones, que se pueden utilizar como soporte de mano para el uso de fórceps. Tenga en cuenta también que es necesaria una fuente adicional de luz.
- Al aumentar progresivamente la intensidad del estímulo, identifique un solo MU sobre la base del carácter evocado "todo o ninguno" de la contracción y el estímulo potencial de la acción. Pruebe cuidadosamente la actividad evocada en una estimulación alrededor del umbral.
- Cuando más de un MU se contraiga en el músculo estudiado y el aumento del nivel de la fuerza, así como el aumento de la amplitud o la forma cambiante del potencial de acción son visibles, volver al paso 4.2 y dividir el haz de axones de nuevo. Tenga en cuenta que las SU más fuertes en gastrocnemius medial de rata tienen aproximadamente 70 veces mayor fuerza de contracción que las más débiles y cuando MU muy fuerte está temblando el segundo, MU débil puede no ser evidente. Tenga en cuenta también que algunas MUs tienen sus fibras musculares ubicadas fuera del área de grabación del electrodo y no son visibles en el electromiograma; en tal caso, los cambios en la amplitud del estímulo pueden tener efecto en la fuerza, pero no en el potencial de acción.
- Estimular una unidad motora con un protocolo de estimulación necesario para el objetivo del experimento. Para un protocolo básico de estimulación necesario para calcular todas las propiedades de potencial de acción y concóditos de la unidad motora básica, incluya lo siguiente.
- Incluir 5 estímulos a 1 Hz (5 espasmos individuales registrados y promediados; promediar es eliminar el ruido, que es especialmente importante para las TU más débiles).
- Incluir una serie de estímulos a 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100 y 150 Hz frecuencias con una duración de 500 ms (estas grabaciones permiten el cálculo de la relación fuerza-frecuencia, la fuerza tetánica máxima a 150 Hz, así como el hundimiento a 20-40 Hz estimulación).
- Incluir la prueba de fatiga (tetani evocado por trenes de 14 estímulos a una frecuencia de 40 Hz, repetida cada segundo durante 4 minutos).
- Incluya al menos 10 s intervalos de tiempo entre todos los elementos del protocolo anterior.
- Repita el proceso con sucesivas unidades de motor aisladas.
- Terminar el experimento y eutanasiar al animal mediante la administración intraperitoneal de una dosis letal de pentobarbital sódico (180 mg-kg-1).
5. Aparato electrónico
NOTA: El programa informático a medida controla el estimulador, proporcionando la posibilidad de crear patrones variables de estimulación, incluidos los indicados en el paso 4.4. El programa coopera con el convertidor analógico a digital (al menos 10 kHz para las grabaciones MUAP y de fuerza).
- Conecte el amplificador de CA al ordenador mediante el convertidor analógico a digital y en paralelo al osciloscopio.
- Conecte el transductor de fuerza al ordenador mediante el convertidor analógico a digital y en paralelo al osciloscopio. Utilice el transductor de fuerza para controlar la fuerza muscular pasiva durante el experimento. Tenga en cuenta que durante el experimento, la fuerza pasiva puede disminuir; por lo tanto, es necesario aumentar la longitud muscular para mantener la fuerza muscular pasiva constante.
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Representative Results
Los parámetros de las contracciones de la unidad motora y los potenciales de acción se pueden calcular sobre la base de las grabaciones cuando se garantizan condiciones estables de grabaciones. La Figura 1 presenta una grabación representativa de la contracción única de un MU rápido. La traza superior muestra el potencial de acción de la unidad de motor. El retraso entre la entrega del estímulo y el inicio del potencial de acción de la unidad motora se debe al tiempo de conducción de la raíz ventral al músculo. La Figura 2 muestra un registro representativo de la fuerza del tétanos no fusionada de un MU rápido y un tren de potenciales de acción de la unidad de motor.
Figura 1: Una grabación representativa de la contracción única de un MU rápido. Sobre la vía de fuerza, hay potencial de acción de la unidad de motor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Un registro representativo de la fuerza del tétanos no fusionada de un MU rápido (grabación intermedia), un tren de potenciales de acción de la unidad de motor (grabación superior) y una posición de tiempo de un tren de estímulos aplicados (abajo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Si se realiza correctamente por científicos experimentados, el componente quirúrgico del protocolo descrito debe completarse en un plazo aproximado de dos horas. Uno debe tener especial cuidado para mantener condiciones fisiológicas estables del animal durante la cirugía, particularmente la temperatura corporal y la profundidad de la anestesia, que debe ser controlada sistemáticamente mediante la evaluación de los reflejos de pinna y abstinencia. Después de la cirugía, debe ser posible mantener condiciones de grabación estables durante al menos seis horas.
El procedimiento experimental crucial comienza con la división de la raíz ventral en filamentos muy delgados que conducen al aislamiento de un solo axón motor al músculo estudiado. De hecho, los filamentos delgados de las raíces ventrales contienen grupos de axones que invaden diferentes músculos de la extremidad posterior; sin embargo, debido a que todos los músculos excepto el estudiado son denervados, cuando el haz estimulado de axones contiene sólo un axón al gastrocnemius media estudiado es posible evocar la única contracción MU sólo en este músculo estudiado. Después de la identificación exitosa de la actividad evocada como contracción MU única, es posible grabar un conjunto de grabaciones de fuerza (una contracción, el tétanos sin fusionar, la prueba de fatiga) cruciales para una clasificación de MU como uno de los tres tipos fisiológicos. La ventaja de esta técnica es la capacidad de grabar hasta 30 unidades en un experimento; Además, las UNIDADes de manipulación pueden clasificarse inmediatamente como tipos rápidos o lentos sobre la base de la presencia de "sag"1,3. Además, las SU se pueden clasificar como de rápido-fatigable o de resistencia rápida con muy alta precisión basada en un perfil de la fuerza de contracción tetánica sin fusionar que registra16. Este último método se puede utilizar cuando no se puede realizar la prueba de fatiga clásica. También vale la pena señalar que la clasificación MU rápida /lenta también se puede hacer con un índice de 20 Hz17.
El protocolo de estimulación propuesto (paso 4.4) puede adaptarse a las necesidades del estudio. Este conjunto particular de estimulaciones permite registrar la contracción (para calcular los parámetros básicos de contracción, incluyendo la fuerza de contracción, la contracción y el tiempo de relajación), el tétanos máximo (por lo tanto, es posible calcular la relación contracción contra el tétanos), las contracciones tetánicas sin fusionar en un conjunto de frecuencias de estimulación (clasificar un MU tan lento o rápido basándose en la presencia de hundimiento o el índice de 20 Hz, así como para calcular la curva de fuerza-frecuencia) y la prueba de fatiga (necesario para calcular la curva de fatiga). El cálculo del índice de fatiga es un método básico para clasificar las SU como fatigables o resistentes. Este método está abierto a ser modificado para producir varios patrones de estimulación; sin embargo, una posible limitación es el programa informático que genera la distribución del tiempo de los estímulos entregados al axón. Además, se pueden introducir algunas modificaciones adicionales para responder a preguntas específicas de investigación, como varios electrodos estimulantes para activar varias SU en paralelo18,un sensor láser adicional para registrar un mecanomiograma (MMG) desde la superficie muscular19 o un electrodo de grabación en una rama nerviosa hasta el músculo para calcular la velocidad de conducción nerviosa20.
Sin embargo, es importante ser consciente de las limitaciones y desafíos de este procedimiento. En primer lugar, una parte considerable de la configuración experimental es hecha a medida (es decir, abrazaderas para la extremidad y los segmentos de vértebras, una placa para raíces ventrales y electrodos). La configuración experimental incluye una mesa de metal sólido con placa (espesor 30 mm) para todas las barras metálicas de soporte (necesarias para la inmovilización animal y el transductor de fuerza) para permitir condiciones estables para el registro de fuerza isométrica. La aplicación de este método también requiere tanto una amplia formación en cirugía como la preparación de una compleja configuración experimental que incluye un aparato electrónico y un programa informático.
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Disclosures
Los autores no tienen conflicto de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención 2018/31/B/NZ7/01028 del Centro Nacional de Investigación de Polonia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Force transducer | custom-made | ||
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11255-20 | Dumont #55 with extra light and fine shanks |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11150-10 | Extra Fine Greafe Forceps |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11026-15 | Special cupped pattern for superior grip |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11023-10 | Slim 1x2 teeth |
| Forceps | Fine Science Tools | No. 11251-20 | Dumont #5 |
| Hemostats | Fine Science Tools | No. 13003-10 | Hartman |
| Isolation Unit | Grass Instruments | S1U5A | |
| Low Noise Bioamplifer | World Precision Instruments | Order code 74030 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | No. 12503-15 | With tungsten carbide jaws |
| Rongeurs | Fine Science Tools | No. 16021-14 | Friedman-Pearson |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14101-14 | Straight sharp/blunt with large finger loops |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14075-11 | Curved blunt/blunt |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 14084-08 | Extra fine bonn |
| Scissors | Fine Science Tools | No. 15000-00 | Straight, ideal for cutting nerves |
| Stimulator | Grass Instruments | S88 | Dual Output Square Pulse Stimulator |
References
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