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Biology

बड़े पैमाने पर एपिजेनेटिक अध्ययन के लिए एक अर्ध-सौतक ChIP-Seq प्रक्रिया

Published: August 13, 2020 doi: 10.3791/61617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Vaccine Discovery, La Jolla Institute for Immunology

ERRATUM NOTICE

Summary

यह पेपर एक विशिष्ट हिस्टोन संशोधन (एच 3के27ac) से जुड़े डीएनए क्षेत्रों के एक अर्ध-तकनीकीकृत, माइक्रोस्केलेड सीआईपी-सेक्यू प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जिसके बाद टैगमेंटेशन का उपयोग करके पुस्तकालय तैयारी की जाती है। प्रक्रिया में गुणवत्ता और मात्रा उद्देश्यों के लिए नियंत्रण मूल्यांकन शामिल है और अन्य हिस्टोन संशोधनों या प्रतिलेखन कारकों को अपनाया जा सकता है।

Abstract

क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन के बाद अनुक्रमण (ChIP-Seq) सीआईएस-नियामक डीएनए तत्वों की पहचान करने में मदद करने के लिए, एच 3K27ac जैसे विशिष्ट हिस्टोन संशोधनों से जुड़े प्रोफ़ाइल क्रोमेटिन डीएनए के लिए एक शक्तिशाली और व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण है। एक ChIP-Seq को पूरा करने के लिए मैनुअल प्रक्रिया श्रम गहन, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, और अक्सर बड़े सेल संख्या (>१००,००० कोशिकाओं) की आवश्यकता होती है । यहां वर्णित विधि उन चुनौतियों से उबरने में मदद करती है। 100,000 कोशिकाओं से कम सेल संख्या इनपुट के लिए 48 नमूनों के बैच के लिए सेल निर्धारण, क्रोमेटिन कतरनी, इम्यूनोप्रिपिपिटेशन और अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी सहित एक पूर्ण अर्धउत्थाबद्ध, माइक्रोस्केलेटेड एच 3K27ac सीआईपी-एसईक्यू प्रक्रिया का विस्तार से वर्णन किया गया है। अर्धस्वायत्त मंच तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करता है, सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करता है, और श्रम को काफी कम कर देता है। प्रणाली इस तरह कम प्रतिक्रिया की मात्रा के लिए अनुमति देकर लागत को कम कर सकते हैं, एंजाइमों, चुंबकीय मोती, एंटीबॉडी, और हाथ पर आवश्यक समय के रूप में महंगी अभिकर्दकों की संख्या सीमित । चिप-सेक्यू विधि में ये सुधार अत्यधिक प्रजनन तरीके से सीमित सेल संख्याओं के साथ नैदानिक नमूनों के बड़े पैमाने पर एपिजेनेटिक अध्ययनों के लिए पूरी तरह से सूट करते हैं।

Introduction

विशिष्ट हिस्टोन संशोधनों से जुड़े डीएनए के टुकड़ों का निर्धारण करने के लिए ChIP-Seq का व्यापक उपयोग सीआईएस-नियामक डीएनए तत्वों की पहचान करने की क्षमता के कारण है, जिसमें सक्रिय बढ़ाने वाले, प्रमोटर, साइलेंसर, हेट्रोक्रोमेटिन और अन्य1,2,3,4शामिल हैं। जीनोम में गैर-कोडिंग नियामक क्षेत्रों की पहचान ने स्वास्थ्य और रोगों में जीन नियमन को बेहतर ढंग से समझने के लिए मूल्यवान अंतर्दृष्टि दिखाई है4। प्रयोगशाला से पिछले काम ChIP-Seq का इस्तेमाल किया है दिखाने के लिए कि सीआईएसनियामकतत्वों के विभिन्न प्रकार5में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं । ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (टीएफ) सीआईपी का उपयोग रोग से जुड़े जोखिम एकल-न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता6को दिखाने के लिए किया गया है।

मानव नैदानिक नमूनों के साथ ChIP-Seq का उपयोग चुनौतीपूर्ण है, मुख्य रूप से सेल संख्या या वांछित ऊतक नमूने की सीमा के कारण। नतीजतन, इन तकनीकों को बेहतर बनाने और माइक्रोस्केल करने के लिए इस क्षेत्र में ठोस प्रयास किए गए हैं औरपरिणामस्वरूप, कटएंड टैग5, 7, 8,9,10, 11, 12जैसे कई परखें उभरी हैं। यह परख एक विशिष्ट एंटीबॉडी9से बंधे जीनोमिक क्षेत्रों को टैगमेंट और अलग करने के लिए एक ट्रांसपोसेस का उपयोग करती है । यह तकनीक कोशिका संख्या को 1,000 तक कम करने में सक्षम रही है और कुछ मामलों में एकल-कोशिका तक, हालांकि, ट्रांसलेशनल रिसर्च और नैदानिक सेट-अप में इस तकनीक के उपयोग ने इस विधि9,12के लिए जीवित कोशिकाओं का उपयोग करने की आवश्यकताओं के कारण सीमाएं दिखाई हैं। लाइव सेल की आवश्यकता नैदानिक नमूनों को संभालना मुश्किल बना देती है और यदि नमूनों को एक ही समय में संसाधित नहीं किया जाता है तो बैच प्रभाव शुरू कर सकते हैं। अन्य लोगों ने फॉर्मेल्डिहाइड-फिक्स्ड कोशिकाओं के लिए माइक्रोस्केलेड तकनीकों को अनुकूलित किया है, जिसमें ChIPmentation11का विकास शामिल है, जिसे यहां उच्च-थ्रूपुट तरीके से अनुकूलित किया गया है। फिक्स्ड कोशिकाओं का उपयोग नमूनों को बैच प्रभावों को कम करने के लिए सभी नमूनों के संग्रह और बाद में प्रसंस्करण तक संग्रहीत करने की अनुमति देता है।

यहां, एक अर्ध-ऑटोमेटेड माइक्रोस्केलेड सीआईपी-सेक परख का वर्णन किया गया है जो10प्रोफाइल हिस्टोन संशोधनों के लिए प्रयोगात्मक हाथों को समय पर कम कर देता है। अर्ध-आधुनिक विधि उच्च-थ्रूपुट सीआईपी-सेक्यू का उपयोग करने की अनुमति देती है, जिससे 48 नमूनों को पूरी तरह से संसाधित किया जा सकता है और 5 दिनों में अनुक्रमण के लिए तैयार किया जा सकता है, ताकि सीआईपी तरल-हैंडलर का उपयोग करके प्रति नमूना 10,000 कोशिकाएं हों। हैंडलर इम्यूनोप्रिपिपिटेशन (आईपी) को पूरा करता है और बाद में स्वायत्त तरीके से धोता है, जो नमूनों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद करता है। अर्ध-अनुमानित विधि 48 नमूनों और तकनीकी परिवर्तनशीलता के लिए 15 घंटे से अधिक समय तक दोनों हाथों को कम करती है, जिससे प्राथमिक या सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए प्रजनन योग्य और तेजी से तरीके से बड़े पैमाने पर एपिजेनेटिक अध्ययन किए जा सकते हैं। प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले ChIP-Seq के लिए शुरू से खत्म करने के लिए प्रक्रिया बताते हैं । यदि विशिष्ट मशीनें उपलब्ध नहीं हैं, तो प्रोटोकॉल अभी भी मैन्युअल रूप से स्थापित करने और परेशानी-शूट ChIP-Seq प्रयोगों के लिए एक उपयोगी संसाधन होगा।

परख तीन अलग-अलग प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार और एक सुसंस्कृत सेल लाइन (HUT78 - ATCC: TIB-161) के साथ किया गया था। स्पष्टता के लिए, प्रोटोकॉल को सात वर्गों में विभाजित किया गया है: कोशिका निर्धारण, सोनीशन के माध्यम से क्रोमेटिन कतरनी, स्वचालित क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन, डीएनए टुकड़ा टैगमेंटेशन द्वारा पुस्तकालय की तैयारी, पुस्तकालय प्रवर्धन, पुस्तकालय शुद्धिकरण, डीएनए क्वांटिफिकेशन के बाद। बफर व्यंजनों के लिए कृपया अनुपूरक तालिका 1 का उल्लेख करें।

Protocol

ला जोला इंस्टीट्यूट फॉर एलर्जी एंड इम्यूनोलॉजी (एलजीआई) का इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (आईआरबी); आईआरबी प्रोटोकॉल नं. एसजीई-121-0714) ने अध्ययन को मंजूरी दी । स्वस्थ स्वयंसेवकों की भर्ती की गई और लिखित सूचित सहमति के बाद ल्यूकेफेरेसिस नमूने प्रदान किए गए ।

1. सेल निर्धारण

  1. सेल सस्पेंशन कंसंट्रेशन को 1 से 2 x 106 सेल/एमएल में कंप्लीट सेल कल्चर मीडियम के साथ 15 एमएल ट्यूब (<10 एमएल सस्पेंशन) या 50 एमएल ट्यूब (सेल्स का 10-30 एमएल) में लाएं। यदि <1 x 106 कोशिकाएं हैं, तो 1.5 एमएल ट्यूब में माध्यम के 0.5 एमएल का उपयोग करें।
  2. धीरे से सेल निलंबन भंवर, 10x सेल निर्धारण बफर dropwise (1:10; vol:vol) जोड़ें और कमरे के तापमान (आर टी) पर 10 मिनट के लिए एक कम गति से घुमाने ।
  3. धीरे-धीरे भंवर से प्रतिक्रिया बंद करो और 1:20 (vol:vol) के अनुपात में 2.5 एम ग्लाइसिन जोड़ें। ट्यूबों को कई बार उलटें और कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  4. शेष चरणों को 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर करें। ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 x ग्राम पर स्पिन करें और सुपरनैंट को त्यागें।
  5. बर्फ के 5 मिलील के साथ धीरे से गोली को फिर से खर्च करें 1x PBS और बर्फ पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  6. बर्फ-ठंड 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ 1.4 और 1.5 दोहराएं और नमूने को प्रीकूल्ड 1.5 एमएल ट्यूब (दीर्घकालिक भंडारण के लिए लेबल) में स्थानांतरित करें। यदि लागू हो, तो अलीकोट तैयार करने की सिफारिश की जाती है।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,200 x ग्राम पर ट्यूबों को स्पिन करें और सेल पेलेट को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना सुपरनैंट निकालें। स्नैप तरल नाइट्रोजन में गोली फ्रीज। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन को संभालते समय उचित सुरक्षा लें।

2. क्रोमेटिन कतरनी

नोट: यह प्रोटोकॉल 0.65 एमएल कम बाध्यकारी ट्यूबों में 0.3 से 3 x 106 कोशिकाओं के साथ छर्रों के क्रोमेटिन कतरनी के लिए अनुकूलित किया गया है।

  1. -80 डिग्री सेल्सियस से जमे हुए सेल छर्रों के साथ नमूनों ट्यूब को हटा दें और लाइसिस बफर जोड़ने से पहले गोली के किसी भी विगलन से बचने के लिए सूखी बर्फ पर स्टोर करें। यह कदम महत्वपूर्ण है ।
  2. गोली के लिए ताजा, आरटी पूर्ण लाइसिस बफर के 70 μL जोड़ें और 1 मिनट के लिए आरटी पर रखें।
  3. किसी भी बुलबुले की शुरूआत के बिना 1 मिनट के लिए गोली को फिर से खर्च करें और फिर बर्फ पर नमूना डालने से पहले 1 मिनट के लिए आरटी पर सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें।
  4. पुनर्संरित गोली को 0.65 एमएल कम बाध्यकारी ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें।
    नोट: प्रजनन योग्य सोनीफिकेशन प्राप्त करने के लिए, नमूनों को सोनिकेट करने से पहले 3-6 चक्रों के लिए केवल खाली ट्यूबों के साथ इसे चलाकर सोनिकेटर को पूर्व-गर्म करें।
  5. नमूनों को सोनिकेटर के ट्यूब धारक में रखें और 70 माइक्रोन पानी से भरे बैलेंस ट्यूब के साथ किसी भी अंतराल को भरें। सोनिकेशन शुरू करने से पहले नमूनों को पानी के स्नान में लगभग 1 मिनट के लिए छोड़ दें।
  6. एक्स चक्र के लिए सोनीशन (सेल प्रकार के आधार पर) 16 एस ऑन/32 एस प्रति चक्र के साथ प्रदर्शन करें।
    नोट: इस चरण के लिए कुशल सोनीफिकेशन के लिए चक्रों की इष्टतम संख्या निर्धारित करने के लिए सत्यापन प्रयोगों की आवश्यकता होगी।
  7. हर 3 चक्रों के बाद, सोनिकेटर से नमूनों को हटा दें, धीरे-धीरे भंवर और पल्स उन्हें धारक में वापस डालने से पहले ट्यूबों को स्पिन करें। सुनिश्चित करें कि ट्यूब के बाहर कोई छोटी बूंदें नहीं हैं क्योंकि इससे बुलबुला गठन हो सकता है।
  8. आवश्यक चक्रों को पूरा करने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए >14,000 x ग्राम पर स्पिन नमूने। सुपरनेट को एक नए, प्री-कूल्ड, लो-बाइंडिंग 0.65 एमएल कम बाइंडिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें।
  9. सोनीशन दक्षता की जांच करने के लिए सोनिकेटेड नमूनों का एक अंश डेक्रॉसलिंक।
    1. सुपरनैंट के 1-7 माइक्रोन (लगभग 250 एनजी कतरनी क्रोमेटिन के बराबर) को 0.2 मिलीएल पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें और आरटी में शॉर्ट-टर्म लाइसिस बफर के साथ 10 माइक्रोन तक वॉल्यूम बनाएं।
    2. 800 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1 माइक्रोन आरएनएसे ए और इनक्यूबेट जोड़ें, फिर 1 माइक्रोन प्रोटीन्स के जोड़ें।
    3. 1,000 आरपीएम पर मिलाते हुए 55 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  10. फ्लोरोसेंट क्वांटिफिकेशन परख 10 का उपयोग करके डीएनए क्वांटिफिकेशन के लिए डीक्रॉसलिंक्ड नमूने के2 माइक्रोन निकालें (साबुन के रूप में एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की सिफारिश नहीं की जाती है और अपमानित प्रोटीन परिणामों में पूर्वाग्रह पैदा कर सकता है)।
  11. न्यूक्लिक एसिड डाई (1:20,000) के साथ 70 वी दाग पर 1 घंटे के लिए 1.2% एगर उठे जेल पर शेष नमूना चलाएं और यूवी ट्रांसिल्यूमिनेटर का उपयोग करके जेल पढ़ें।
  12. भंडारण के लिए क्रोमेटिन स्टॉक एलिकोट तैयार करें (नमूने को पूरी तरह से लाइसिस बफर के साथ 20 माइक्रोन में 25 एनजी/माइक्रोन में पतला करें)। सभी कतरनी क्रोमेटिन को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. हिस्टोन संशोधन के लिए स्वचालित ChIP-Seq

नोट: यह प्रोटोकॉल एक ChIP तरल हैंडलर पर चलाने के लिए डिज़ाइन किया गया है । हालांकि सिस्टम अनुकूलित बफ़र्स का उपयोग कर सकता है, सभी बफ़र्स को चिप किट प्रदान की जाती है। इस खंड में उपयोग की जाने वाली 8 ट्यूबों वाली सीआईपी स्ट्रिप्स सीआईपी लिक्विड हैंडलर के लिए विशिष्ट हैं।

  1. -80 डिग्री सेल्सियस से 20 माइक्रोन में 500 एनजी कतरनी क्रोमेटिन के साथ 16 नमूना एलिकोट्स स्थानांतरित करें और क्रोमेटिन को धीरे-धीरे पिघलाने के लिए उन्हें बर्फ पर रखें। एक बार पूरी तरह से गल, भंवर संक्षेप में और पल्स स्पिन ।
  2. क्रोमेटिन की तैयारी
    1. पिपेट 100 माइक्रोन टीसी 1 बफर को दो चैप 8-ट्यूब स्ट्रिप्स में 1x प्रोटीज अवरोधक और 20 एमएम सोडियम ब्यूटायर (पूर्ण tC1 बफर) के साथ पूरक किया गया।
    2. प्रत्येक क्रोमेटिन नमूने के 20 माइक्रोन को छग 8-ट्यूब स्ट्रिप्स की एक उपयुक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें पूर्ण tC1 बफर के 100 माइक्रोन होते हैं। क्रोमेटिन ट्यूबों को क्रोमेटिन ट्यूबों में 80 माइक्रोन पूरा टीसी1 बफर जोड़कर धोएं और फिर 200 माइक्रोन की अंतिम मात्रा के लिए चैप 8-ट्यूब स्ट्रिप्स की उपयुक्त ट्यूब में वापस स्थानांतरित करें।
  3. एंटीबॉडी की तैयारी
    1. एंटीबॉडी की मात्रा की गणना करें जैसे कि एंटीबॉडी का 0.5 माइक्रोग्राम प्रत्येक ट्यूब में है।
      एंटीबॉडी की मात्रा = (प्रति प्रतिक्रिया एक्स एंटीबॉडी नमूनों की संख्या) /
    2. एचबीडब्ल्यू1 बफर के 500 माइक्रोन में एंटीबॉडी की गणना की गई मात्रा जोड़ें। जल्दी भंवर और नाड़ी-स्पिन।
    3. दो ChIP 8-ट्यूब स्ट्रिप्स में से प्रत्येक में tBW1 के पिपेट 70 माइक्रोन और प्रत्येक ट्यूब में एंटीबॉडी + tBW1 के 30 माइक्रोन जोड़ें। इससे प्रत्येक ट्यूब में कुल मात्रा 100 माइक्रोन हो जाएगी।
  4. चुंबकीय मनका की तैयारी
    1. भंवर प्रोटीन एक मनका समाधान अच्छी तरह से। एंटीबॉडी के 0.5 माइक्रोग्राम के लिए, पाइपेट 5 माइक्रोन मोतियों के मोतियों को चिप 8-ट्यूब स्ट्रिप्स और पल्स स्पिन के एक नए सेट में।
  5. लेबल, खाली ChIP 8-ट्यूब स्ट्रिप्स के साथ ChIP तरल हैंडलर की अंतिम पंक्ति भरें ।
  6. ChIP तरल हैंडलर मशीन में सभी स्ट्रिप्स के प्लेसमेंट के लिए ChIP-16-IPure-200D कार्यक्रम विनिर्देशों का पालन करें । सही स्थिति में बफ़र्स जोड़ें, लेकिन tE1 बफर के बजाय tW4 का उपयोग करें।
    नोट: इस तरह के दिन का आयोजन करें कि ChIP तरल हैंडलर रात भर ChIP प्रदर्शन करेंगे । कार्यक्रम 16 नमूनों के लिए लगभग 16 घंटे तक चलेगा। यह 1 दिन के अंत के निशान ।

4. पुस्तकालय की तैयारी के लिए पुस्तकालय एडाप्टर के स्थानांतरण एकीकरण

  1. एक थर्मोमिक्सर को 37 डिग्री सेल्सियस और 500 आरपीएम को प्री-सेट करें। बर्फ पर 0.2 एमएल ट्यूब स्ट्रिप्स के लिए एक चुंबक को ठंडा करें।
  2. 16 नमूनों के लिए, बर्फ पर टैगमेंटेशन बफर के 440 माइक्रोन तैयार करें। एक नए 8 ट्यूब पट्टी में पिपेट 53 माइक्रोन करें और बर्फ पर रखें।
  3. एक नई 0.2 मिलील 8-ट्यूब स्ट्रिप में, कोल्ड टीसी1 बफर के 220 माइक्रोन जोड़ें और बर्फ पर रखें। 8 स्ट्रिप ट्यूब इस मात्रा को पकड़ सकते हैं और अभी भी छाया हुआ है।
  4. ChIP तरल हैंडलर मशीन (पंक्ति 12) से "आईपी नमूने" पट्टी ट्यूब निकालें और पल्स कताई से पहले ट्यूबों टोपी । 2 मिनट के लिए 8-ट्यूब स्ट्रिप्स के लिए चुंबक का उपयोग करके मोतियों को कैप्चर करें और ध्यान से सुपरनैंट को हटा दें।
  5. एक बहु-चैनल के साथ मोतियों के लिए टैगमेंटेशन बफर के 25 माइक्रोन को स्थानांतरित करें, चुंबक से हटा दें, और धीरे-धीरे मिलाएं जब तक कि मोती समरूप न हो जाएं (पिपेट सेट के साथ लगभग 5 गुना ऊपर और नीचे 20 माइक्रोन) ।
  6. ट्यूबों को कैप करें और 3 मिनट के लिए प्री-गर्म थर्मोमिक्सर में रखें और इनक्यूबेट करें। समय बढ़ने से लाइब्रेरी तैयार करने की क्षमता में कमी आएगी।
  7. ट्यूबों को एक ठंडा धातु रैक में स्थानांतरित करें और प्रत्येक नमूने में 100 माइक्रोन ठंडा tC1 बफर जोड़ें। 80 माइक्रोन के लिए एक बहु-चैनल पिपेट सेट करें और नमूना मिलाएं जब तक कि मोती समरूप न हो जाएं, टैगमेंटेशन प्रतिक्रिया को रोकें।
  8. नमूनों को वापस चिप लिक्विड-हैंडलर में रखें और वॉश प्रक्रिया Washing_for_IP-reacts_16_Ipure केसाथ आगे बढ़ें । सुनिश्चित करें कि धुलाई दो बार tC1 बफर के साथ और दो बार tW4 के साथ किया जाता है। स्फूर्ति को बफर टीई 1 के साथ कार्यक्रम लेआउट द्वारा चिह्नित किया जाना चाहिए।
  9. डीएनए की डीक्रॉसलिंकिंग
    1. ChIP तरल हैंडलर की अंतिम पंक्ति में Chip 8-ट्यूब स्ट्रिप्स निकालें और प्रत्येक नमूने में 2 μL RNase A जोड़ें ।
    2. ट्यूबों को कैप करें, पल्स-स्पिन, धीरे-धीरे मोतियों को मल्टीचैनल पिपेट के साथ मिलाएं जब तक मिश्रण समरूप न हो जाए, और ट्यूबों को फिर से कैप करें।
    3. एक थर्मोमिक्सर में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 900 आरपीएम पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    4. थर्मोमिक्सर से नमूनों को हटा दें, प्रोटीनेज के 2 माइक्रोन जोड़ें। इसके अलावा के बाद 4.9.2 के रूप में एक ही प्रक्रिया का पालन करें।
    5. 55 डिग्री सेल्सियस और 1,250 आरपीएम पर 4 घंटे के लिए थर्मोमिक्सर में नमूनों को इनक्यूबेट करें, इसके बाद रात भर 1,000 आरपीएम पर 65 डिग्री सेल्सियस का समय दिया गया।
      नोट: यह 2 दिन का अंत है ।

5. टैगमेंट डीएनए टुकड़े शुद्धि

  1. उचित नमूना संख्या के साथ सोलह 1.5 एमएल ट्यूब लेबल और प्रत्येक के लिए डीएनए क्लीन-अप किट से डीएनए बाध्यकारी बफर के 400 μL जोड़ें।
  2. थर्मोमिक्सर से 8-ट्यूब स्ट्रिप्स निकालें और पल्स-स्पिन स्ट्रिप्स को सुनिश्चित करने के लिए किसी भी सुखाया उत्पाद बनाए रखा है । मोतियों को पकड़ने के लिए 8-स्ट्रिप चुंबक पर स्ट्रिप्स रखें।
  3. 1.5 एमएल ट्यूबों में से प्रत्येक में 100 माइक्रोन डीक्रॉसलिंक्ड डीएनए को स्थानांतरित करें। मोतियों को धोने के लिए 8-ट्यूब स्ट्रिप्स में डीएनए बाइंडिंग बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें और फिर उचित 1.5 एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
  4. लगभग 10 एस के लिए भंवर और नाड़ी-1.5 एमएल ट्यूब स्पिन।
  5. डीएनए बाध्यकारी बफर और ChIP नमूना युक्त 600 μL के साथ कॉलम लोड करें।
  6. 10,000 x ग्राम पर 20 एस के लिए नमूने स्पिन करें और प्रवाह के माध्यम से कॉलम को फिर से लोड करें। एक ही शर्तों के साथ फिर से स्पिन और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  7. कॉलम को 200 माइक्रोन वॉश बफर (पिछले चरण के समान अपकेंद्रित्र) के साथ दो बार धोएं और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  8. 12,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा कॉलम सूखी।
  9. कॉलम को एक नए 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें और कॉलम मैट्रिक्स में सीधे 9 माइक्रोन गर्म ते बफर (55 डिग्री सेल्सियस से पूर्व-गर्म) जोड़ें। कॉलम को 10,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्रन से पहले 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने कीअनुमति दें।
  10. एल्यूट के 9 माइक्रोन को 8-ट्यूब स्ट्रिप्स के एक उपयुक्त नए सेट में स्थानांतरित करें।
  11. पहले की तरह 8 माइक्रोन ते बफर के साथ फिर से एल्शन को पूरा करें। एल्यूट को उपयुक्त 8-ट्यूब स्ट्रिप्स (प्रति नमूना अंतिम मात्रा 17 माइक्रोन) में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें।

6. शुद्ध नमूनों का प्रवर्धन और आकार-चयन

  1. इष्टतम प्रवर्धन (सीटीडी - सीटी निर्धारण) के लिए आवश्यक चक्रों की संख्या निर्धारित करने के लिए निम्नलिखित चरण क्यूपीसीआर का उपयोग करते हैं
  2. नमूनों की संख्या से सीटीडी मिक्स बफर की सामग्री को गुणा करके सभी नमूनों के लिए सीटीडी मिक्स तैयार करें।
  3. सीटीडी मिश्रण के 3.6 माइक्रोन को क्यूपीसीआर प्लेट में वितरित करें और टैगमेंट डीएनए नमूनों के 1.4 माइक्रोन जोड़ें (कुल मात्रा का ~ 10%)। निम्नलिखित क्यूपीसीआर: 3 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 10 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 26 चक्र, 30 एस के लिए 63 डिग्री सेल्सियस और 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस प्रदर्शन करें।
  4. नमूनों की संख्या से एएमपी मिक्स बफर की सामग्री को गुणा करके सभी नमूनों के लिए एएमपी मिक्स तैयार करें। एक पीसीआर प्लेट के अलग कुओं में टैगमेंट डीएनए के 14 माइक्रोन बांटना, तो प्रत्येक नमूने के लिए दो अनुक्रमण सूचकांक प्राइमर (25 μM) के २.५ माइक्रोन जोड़ें (अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा ५० μL है) ।
  5. मल्टीचैनल पिपेट द्वारा नमूनों को मिलाएं और उचित संख्या में चक्रों के साथ सीटीडी में उपयोग किए जाने वाले प्रवर्धन कार्यक्रम को करें।
    नोट: यह एक अच्छा रोक बिंदु है क्योंकि प्रवर्धित नमूनों को कुछ हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि शुद्धि उसी दिन पूरी हो सकती है। ४८ नमूनों के लिए, चरण 3-६.५ दो अन्य अलग बैचों के साथ पूरा किया गया और फिर नीचे वर्णित एक बैच में परिलक्षित ।
  6. नीचे वर्णित के रूप में प्रवर्धन के बाद, आकार चयन, और टैगमेंट डीएनए की मात्राकरण प्रदर्शन करते हैं । यह आमतौर पर 48 नमूनों के साथ पूरा किया जा सकता है (वांछित के रूप में कम नमूनों के साथ पूरा किया जा सकता है)।
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से पैरामैग्नेटिक मोतियों (1:1.8 अनुपात) के 90 μL जोड़ें, मिश्रण करें, और इसे 2 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    2. एक प्लेट चुंबक का उपयोग कर मोतियों को कैप्चर करें और सुपरनेट को त्यागें। मनका गोली को बाधित किए बिना ताजा 80% इथेनॉल के 200 माइक्रोन के साथ 3 बार मोतियों को धोएं।
    3. अंतिम धोने के बाद 20 माइक्रोन युक्तियों के साथ किसी भी अतिरिक्त इथेनॉल को हटा दें और मोतियों को 10 मिनट के लिए सूखने के लिए छोड़ दें या जब तक कि मनका छर्रों में दरारें दिखाई न दें।
    4. चुंबक पर अभी भी प्लेट के साथ, प्रत्येक कुएं में पूर्व-गर्म पानी का 40 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को सील करें, भंवर अच्छी तरह से, और संक्षेप में पल्स-प्लेट स्पिन करें।
    5. प्लेट को चुंबक पर वापस रखकर मोतियों को कैप्चर करें और 40 माइक्रोन एल्यूट को एक नए "नमूना" प्लेट में स्थानांतरित करें। नमूने अब शुद्ध कर रहे हैं, और अगले कदम 200-1000 बीपी से लेकर टुकड़े समृद्ध ।
    6. वैकल्पिक क्यूसी चरण: नमूनों से 4 माइक्रोन निकालें और क्यूसी प्लेट में स्थानांतरित करें। नमूनों में 4 माइक्रोन पानी वापस जोड़ें। यह बड़े टुकड़ों का प्रतिशत निर्धारित करता है।
    7. नमूनों में पैरामैग्नेटिक मोतियों (1:0.55 अनुपात) के 22 माइक्रोन जोड़ें, ध्यान से मिलाएं, और 2 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    8. 5 मिनट के लिए मोतियों पर कब्जा करने के लिए चुंबक पर रखें और सुपरनेटैंट्स को "नमूना" प्लेट के 7-12 कॉलम में स्थानांतरित करें। चुंबक से प्लेट निकालें और मोतियों के 30 माइक्रोन जोड़ें (1:1.3 का अंतिम अनुपात)। ध्यान से मिलाएं और इसे 2 मिनट के लिए आरटी पर बैठने दें।
    9. मोतियों को 5 मिनट तक कैप्चर करें और फिर सुपरनेट को छोड़ दें।
    10. पहले वर्णित 200 माइक्रोल ताजा 80% इथेनॉल के साथ 3 बार सभी मोतियों को धोएं (चरण 6.6.2 - 6.6.3)।
    11. एक बार छर्रों सूखी हैं, 8 μL पूर्व गर्म ते बफर के साथ डीएनए elute प्रत्येक अच्छी तरह से, जबकि अभी भी चुंबक पर ।
    12. चुंबक, सील और भंवर से प्लेट को अच्छी तरह से हटा दें। प्लेट को आरटी, पल्स-स्पिन में 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें, और प्लेट को 2 मिनट के लिए चुंबक पर वापस रखें। सुपरनेट को एक नई प्लेट (प्लेट 2) में स्थानांतरित करें।
    13. अधिकतम वसूली के लिए, पूर्व-गर्म ते बफर के अतिरिक्त 8 माइक्रोन के साथ दोहराएं। नमूनों को उपयुक्त कुओं में रखें ताकि प्रत्येक नमूने में अंतिम पुस्तकालय के 16 माइक्रोन हों।
      नोट: इस चरण के अंत में दो प्लेटें होनी चाहिए (एक यदि कोई क्यूसी प्लेट पूरी नहीं हुई थी)। क्यूसी प्लेट में पूर्व आकार के चयनित टुकड़े होंगे और दूसरी प्लेट में अंतिम पुस्तकालय के ४८ कुएं (16 माइक्रोन कुल) होने चाहिए ।

7. एक फ्लोरेसेंस परख का उपयोग कर अंतिम पुस्तकालयों और QC नमूनों की मात्रा

  1. परख या इसी तरह की विधि की मात्रा का उपयोग करके डीएनए मात्रा को पूरा करें।
  2. यदि क्यूसी मात्रा पूरी हो गई थी, तो 1,000 बीपी < वाले नमूने के नुकसान का प्रतिशत निर्धारित करें। लगभग 20% से अधिक नुकसान नहीं होना चाहिए - यदि अधिक था, तो लागू मनका अनुपात के साथ एक मुद्दा हो सकता है।
  3. प्रत्येक नमूने के टुकड़ों के आकार का निर्धारण करें, अधिमानतः एक केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस मशीन का उपयोग कर। मोलर एकाग्रता की गणना करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें: [पुस्तकालय एकाग्रता (एनजी/μL) * 106]/[660 * औसत टुकड़ा आकार (bp)]) ।
    नोट: पुस्तकालयों को पूल (सममोलर मात्रा) के लिए तैयार है और मानक अगली पीढ़ी अनुक्रम प्रक्रियाओं के बाद अनुक्रमित ।

Representative Results

अवधारणा के सबूत के रूप में, ChIP-Seq प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार के तीन सेट के साथ छह मानव दाताओं के लिए पूरा किया गया था: भोली सीडी 4 टी कोशिकाओं (सीडी 4), शास्त्रीय मोनोसाइट्स (एमओ) और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एनके), FACS छंटाई द्वारा समृद्ध के रूप में13से पहले वर्णित है । रेखांकित प्रक्रिया में नौ अलग - अलग प्रक्रियाएं होती हैं , जो चित्र 1में दर्शाई गई हैं .

Figure 1
चित्रा 1: प्रक्रिया के लिए सामान्य फ्लोचार्ट. (ए)समग्र प्रक्रिया का एक कार्टून (बायोरेंडर में उत्पन्न)। (ख)प्रोटोकॉल के लिए सभी प्रमुख चरणों के लिए प्रवाह चार्ट और अनुमानित हाथों पर और प्रत्येक दिन से जुड़े कुल समय । अनुक्रमण 5 दिन के अंत में या बाद में कई दौर के साथ हो सकता है । समय रेखा भी सप्ताह भर में कंपित किया जा सकता है, जहां अनुक्रमिक दिवस 3-4 एक सप्ताह में कई बार पूरा किया जा सकता है ४८ ChIP नमूने उत्पन्न करने के लिए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रवाह साइटोमेट्री13द्वारा कोशिका अलगाव के बाद, क्रमबद्ध कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र किया गया था और कोशिकाओं को ऊपर वर्णित और संग्रहीत किया गया था। एक बार सभी नमूने एकत्र किए जाने के बाद नमूनों को ऊपर वर्णित 12 के बैचों में रंगीन कतरन के लिए तैयार किया गया था । प्रत्येक नमूने के लिए, इष्टतम सोनीशन तक पहुंचने के लिए चक्रों की संख्या10पूरी हो गई थी। मात्रात्मक माप, साथ ही कतरनी क्रोमेटिन टुकड़ा आकार माप प्रतिरक्षा कोशिकाओं के तीन सेट(चित्रा 2A)पर हमारी विधि की महान प्रजनन क्षमता दिखाया । विभिन्न मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग-अलग बैचों में सोनिक किया गया था और 14 चक्रों (16 एस ऑन, प्रति चक्र 32 एस) के लिए 100 - 500 बीपी के बीच > 70% नमूने के साथ बहुत लगातार मिले थे। इस बिंदु पर, सोनीशन के बाद बड़े टुकड़ों वाले नमूनों (100 - 500 बीपी के बीच नमूने का 70% <) को विफल माना गया था। इन नमूनों को या तो 1-2 अतिरिक्त चक्रों के लिए ध्वनियुक्त किया जा सकता है या छोड़ दिया गया था और बाद में एक और गोली से कोशिकाओं के साथ बदल दिया । हमारी विधि ने किसी भी नमूने को अधिक सोनीसेकरण की आवश्यकता नहीं दिखाई या प्रक्रिया की पूर्ण मजबूती का सुझाव देते हुए समाप्त कर दिया गया।

Figure 2
चित्रा 2: प्री-सीक्वेंसिंग क्यूसी उदाहरण. (ए)1.2% एगरेग्याड जैल सोनीसेशन की प्रजनन क्षमता दिखाते हैं। तीन सेल प्रकारों में 6 दाताओं के लिए सोनीशन नमूने: भोले सीडी 4 टी कोशिकाओं (सीडी 4), शास्त्रीय मोनोसाइट्स (एमओ), और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एनके) । नमूनों को 14 चक्रों (16 एस ऑन, 32 एस प्रति चक्र) के लिए ध्वनिकृत किया गया था। प्रत्येक नमूने के लिए लगभग 200 एनजी डीक्रॉसलिंक्ड क्रोमेटिन को 1% एगर उठे हुए जेल पर लोड किया गया था। नमूनों को अच्छा माना जाता था यदि 70% से अधिक टुकड़े 100-500 बीपी के भीतर होते हैं।(बी)शीर्ष विश्लेषण क्यूपीसीआर प्रवर्धन घटता प्रवर्धन के लिए चक्र की इष्टतम संख्या निर्धारित करने के लिए (सीटी जहां 1/2 अधिकतम तीव्रता है) । आदर्श नमूनों में लगभग 15 की सीटी होती है और प्रवर्धन मापा गया सीटी के 2 चक्र तक पूरा किया जा सकता है। तीर एक बुरा उदाहरण का एक उदाहरण है जहां सीटी 18 से अधिक है। नीचे - नमूनों के एक गरीब सेट का एक उदाहरण दिखाया गया है जिसमें 18 से अधिक सीटी है। इन नमूनों में फ्लोरेसेंस की तीव्रता भी कम दिखाई दी । (ग)लेफ्ट - डिसकेशन एनालाइजर इलेक्ट्रोफोरेसिस निशान ने प्रवर्धन और आकार-चयन के बाद अंतिम टैगमेंट किए गए पुस्तकालयों का वितरण दिखाया। टुकड़ा पुस्तकालय के ८५% से अधिक के साथ नमूने 200-1000 बीपी के भीतर निहित अच्छा नमूने के रूप में माना जाता था । फ्लोरेसेंस की पीक तीव्रता का मापन भी एक महत्वपूर्ण क्यूसी पैरामीटर के रूप में माना जाता है, वास्तव में यदि सिग्नल कम है, तो नमूना अच्छी तरह से अनुक्रम की संभावना नहीं है। सही - सीडी 4, एमओ और एनके में सकारात्मक नमूनों के लिए उदाहरण दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

क्वांटिफिकेशन के बाद, नमूनों को H3K27ac एंटीबॉडी के साथ एक ChIP लिक्विड-हैंडलर पर चलाया गया, जिसके बाद Tn5 ट्रांसपोसेस एंजाइम के साथ टैगमेंटेशन किया गया । क्यूपीसीआर द्वारा प्रवर्धन चक्रों की उचित संख्या निर्धारित करने के लिए, 10% टैगमेंट नमूनों का उपयोग किया गया था। नमूनों के प्रवर्धन के लिए चक्रों की संख्या के निर्धारण के लिए, हम चक्र पाते हैं जिस पर नमूने की तीव्रता चक्र निर्धारण(चित्रा 2B)के लिए औसत अधिकतम आधा है। 18 से अधिक के सीटी मूल्यों के साथ नमूने अनुक्रमण के बाद अच्छा प्रदर्शन नहीं किया और उनके सीटी मूल्य इस प्रकार एक असफल ChIP नमूने का संकेत था । इन नमूनों में आम तौर पर प्रवर्धन के बाद डीएनए की मात्रा कम भी हुई । नमूने (100,000 कोशिकाओं इनपुट) एक सीटी मूल्य बराबर या 15 से कम के साथ आदर्श थे और 15 और 18 के बीच नमूने स्वीकार्य लेकिन कम सुसंगत पोस्ट अनुक्रमण थे। १००,००० से कम इनपुट कोशिकाओं वाले नमूनों के लिए, सीटी मान आमतौर पर 15 और 18 के बीच पाए जाते थे, लेकिन अनुक्रमण के लिए पर्याप्त उत्पाद उपज के लिए 18 से अधिक चक्रों की आवश्यकता नहीं थी ।

डीएनए-टैगमेंट प्रवर्धन के बाद, पुस्तकालयों को शुद्ध और आकार-एक आदर्श आकार वितरण प्राप्त करने के लिए चुना गया था, जो नेक्स्टजेन अनुक्रमण के लिए २०० से १,० बीपी तक था । प्रत्येक पुस्तकालयों पर आकार वितरण मूल्यांकन पूरा हो गया था क्योंकि सबसे अच्छा अनुक्रमण डेटा प्राप्त किया गया था जब डीएनए टुकड़े के ८५% से अधिक २०० से १,००० बीपी(चित्रा 2C)के बीच लेकर । विशेष रूप से, डीएनए की एक ही मात्रा के रूप में (फ्लोरेसेंस क्वांटिफिकेशन द्वारा मापा गया) लोड किया गया था, यह कम फ्लोरेसेंस तीव्रता के साथ नमूनों को देखा गया था आम तौर पर खराब अनुक्रम(चित्रा 2C)।

अनुक्रमण के बाद, एनकोड चिप-एसईक्यू दिशानिर्देशों के आधार पर मानक गुणवत्ता नियंत्रण5,14,15लागू किए गए थे।

Figure 3
चित्र 3: प्रतिरक्षा-कोशिका नमूनों की प्रजनन क्षमता। (A)एच3के27ैक ट्रैक्स (यूसीएससी जीनोम ब्राउजर, अधिकतम तीव्रता, 4 का चौरसाई समारोह, सभी समान रूप से स्केल्ड वाई-एक्सिस के साथ) प्रत्येक सेल प्रकार (सीडी 4, एमओ और एनके) में 6 दानदाताओं (प्रति दोहराने 100,000 कोशिकाओं) के लिए। चार अनुकरणीय लोकी दिखाए गए हैं, दो के साथ (IL2RA लोकस और पीटीपीआरसी) और दो H3K27ac (CCR4 और MS4A1) के लिए संवर्धन के बिना । (ख) प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए मेडिप्स पैकेज के भीतर 300 बीपी एक्सटेंशन और 500 बीपी विंडो का उपयोग करके उत्पन्न दानदाताओं और इसी सहसंबंध भूखंडों के बीच पियर्सन सहसंबंध16की प्रतिकृति है । (ग)प्रत्येक सेल प्रकार के लिए विलय दाता फ़ाइलें जो एच 3के27ैक ट्रैक (यूसीएससी जीनोम ब्राउज़र अधिकतम तीव्रता, 4 की चौरसाई फ़ंक्शन) सेल टाइप-विशिष्ट क्षेत्रों (सीडी 4 के लिए आईएल17आर, एमओ के लिए सीसीआर 2, और एनके के लिए केएलआरसी 1) और सभी सेल प्रकारों में मौजूद घर कीपिंग जीन बी2एम को दिखाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

विजुअल क्वालिटी कंट्रोल के लिए यूसीएससी जीनोम ब्राउजर में डिस्प्ले के लिए H3K27ac एनरिचमेंट ट्रैक तैयार किए गए थे । चार जीन loci के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए व्यक्तिगत पटरियों उच्च मानचित्रण गुणवत्ता और संकेत से शोर अनुपात उच्च स्थिरता और हमारे परख की मजबूती को दर्शाती है(चित्रा 3A) दिखाया। इन कोशिका प्रकारों में बाएं बंदरगाह के लिए दो loci अच्छी तरह से व्यक्त जीन, जबकि सही करने के लिए दो loci में जीन व्यक्त नहीं कर रहे है और पृष्ठभूमि नियंत्रण13 (चित्रा 3A)के रूप में सेवा की । इसके अलावा , मेडिप्स विश्लेषण पैकेज का उपयोग तकनीकीप्रतिकृति(चित्रा 3 बी) 5, 16,17के बीच सहसंबंध सूचकांक का आकलन करने के लिए अनुक्रमण के बाद चर के रूप में किया गया था, जो 500 बीपी डिब्बे16के लिए समृद्धता स्तर को पढ़ता है के लिए सहसंबंध की डिग्रीस्थापितकरता है। अधिकांश पेयरवाइज तुलनाओं के लिए, पियर्सन सहसंबंध अनुक्रमित ने जैविक प्रतिकृति(चित्रा 3B)के बीच उच्च स्तर का सुझाव देते हुए 90% से अधिक सहसंबंध दिखाया। सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए स्वीकार्य सहसंबंध के साथ प्रतिकृति को मर्ज किया गया था। जबकि सेल प्रकार विशिष्ट loci उपयुक्त कोशिकाओं में उच्च संवर्धन दिखाया, एक घर रखने जीन (B2M) बहुत सुसंगत हिस्टोन संशोधन(चित्रा 3C) दिखाया। विश्लेषण के लिए, प्रतिकृति से पटरियों के विलय से संवर्धन में वृद्धि होगी, विशिष्ट संकेत को मजबूत करेगा, जिसमें महत्वपूर्ण सेल प्रकार-विशिष्ट एन बढ़ाने वाले शामिल हैं, और मानव नमूनों के लिए निहित अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता को कम करता है5।

यद्यपि इस अध्ययन के लिए 100,000 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था, लेकिन मानव सुसंस्कृत टी-सेल लाइन (HUT78) में 10,000 कोशिकाओं के रूप में उच्च प्रजनन क्षमता थी। 100,000 से कम कोशिकाओं वाले नमूनों से किए गए सीआईपी-सेक्यू डेटासेट के बीच सहसंबंध विश्लेषण ने 10,000 कोशिकाओं(चित्रा 4 ए)तक उच्च प्रजनन क्षमता और सहसंबंध दिखाया।

Figure 4
चित्रा 4: कम इनपुट नमूनों की प्रजनन क्षमता. (ए)कोशिकाओं के लिए H3K27ac ChIP-Seq की निरंतरता के उदाहरण १००,००० नीचे १०,००० HUT-७८ कोशिकाओं में (एक टी सेल लिंफोमा सेल लाइन) । पटरियों (UCSC जीनोम ब्राउज़र, अधिकतम तीव्रता, 4 के चौरसाई समारोह, सभी समान रूप से पहुंचा वाई-अक्ष के साथ) IL4 लोकस दिखाते हैं । (ख) मेडिप्स पैकेज16के भीतर 300 बीपी एक्सटेंशन और 500 बीपी विंडो का उपयोग करके प्रतिकृति के पियर्सन सहसंबंध ।  (ग)पियर्सन विभिन्न सेल संख्या समूहों (100,000, 50,000, और 10,000 कोशिकाओं) के बीच सहसंबंध (बी)16में के रूप में एक ही मेडिप्स मापदंडों का उपयोग कर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पियर्सन सहसंबंध विश्लेषण उच्च सहसंबंध सूचकांक (83% से 92%), कम सेल संख्या नमूनों में संकेत के रखरखाव का सुझाव दिखाया। हालांकि, वहां पृष्ठभूमि में वृद्धि के रूप में सेल संख्या कम कर रहे थे और साथ ही सहसंबंध गुणांक(चित्रा 4B)के एक छोड़ने । कम पृष्ठभूमि संकेतों को बनाए रखने के लिए, तकनीकी डुप्लिकेट को मर्ज किया गया था, और सहसंबंध समूहों(चित्रा 4C) केबीच परीक्षण किया गया था।

10X सेल फिक्सेशन बफर
यौगिक अंतिम एकाग्रता
फॉर्मलडिहाइड समाधान 11%
नैक 100 एमएमएम
EDTA, पीएच 8.0 1 mm
ईजीटीए, पीएच 8.0 0.5 mM
हेपेस, पीएच 7.5 50 एमएमएम
पूर्ण लाइसिस बफर
यौगिक अंतिम एकाग्रता
ट्रिस-एचसीआई, पीएच 8.0 50 एमएमएम
EDTA, पीएच 8.0 10 mm
एसडीएस 0.25%
सोडियम ब्यूटारेट 20 एमएमएम
प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल 1X
अल्पकालिक लाइसिस बफर
यौगिक अंतिम एकाग्रता
ट्रिस-एचसीआई, पीएच 8.0 50 एमएमएम
EDTA, पीएच 8.0 10 mm
एसडीएस 0.25%
टैगमेंटेशन मिक्स
यौगिक अंतिम एकाग्रता
ट्रिस-एचसीआई, पीएच 8.0 10 mm
एमजीसीएल2 5 एमएमएम
एन, एन-डाइमेथाइलफार्मेमाइड 10%
इलुमिना टैगमेंटेशन एंजाइम 1:24 vol:vol
सीटीडी मिक्स
यौगिक प्रति नमूना (μL)
नेक्स्टेरा इंडेक्स प्राइमर ए (25 माइक्रोन) 0.275
नेक्स्टेरा इंडेक्स प्राइमर बी (25 माइक्रोन) 0.275
2X KAPA HiFi HotStart तैयार मिश्रण 2.75
1:1000 SYBR ग्रीन डाई 0.11
रॉक्स निष्क्रिय डाई 0.11
पानी 4 माइक्रोल तक भरें
एएमपी मिक्स
यौगिक प्रति नमूना (μL)
2X KAPA HiFi HotStart तैयार मिश्रण 27.5
पानी 31 माइक्रोल भरें

अनुपूरक तालिका 1: बफर व्यंजनों।

अनुपूरक तालिका 2: स्पीयरमैन और पियर्सन 6 दाताओं और प्रत्येक सेल प्रकार के लिए नमूना सहसंबंध। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां वर्णित विधि ChIPmentation प्रक्रिया11पर फैलती है, जो प्रोटोकॉल को स्वचालित और माइक्रोस्केलिंग करके डीएनए शुद्धिकरण से पहले एक टैगमेंटेशन लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल को लागू करती है। ChIP-Seq की शुरुआत के बाद से, आवश्यक सेल संख्या में भारी कमी आई है, हिस्टन के लिए लगभग 20 मिलियन कोशिकाओं से सैकड़ों और यहां तक कि एकल कोशिकाओं1,7,10, 12,18,19,20,21तक। इन नए विकसित तरीकों ने इस बात की गहरी समझ के लिए अनुमति दी है कि सीआईएस-नियामकतंत्र कोशिकाओं में संवेदनशीलता बढ़ाकर और दुर्लभ नैदानिक कोशिकाआबादी कापरीक्षण करने की अनुमति देकर कोशिकाओं में कैसे काम कर रहे हैं5 ,6,12,17। उदाहरण के लिए, अधिक हालिया और लोकप्रिय प्रक्रियाओं में से एक, जिसे कट एंड टैग कहा जाता है, मजबूत और संवेदनशील सीआईपी-सेक्यू वैकल्पिक9के रूप में। यह एक उत्कृष्ट सिग्नल-टू-शोर अनुपात पैदा करता है क्योंकि टीएन5 एंजाइम प्रोटीन ए से सहसंबद्ध है और उच्च विशिष्टता9के साथ चिप एंटीबॉडी की एफसी श्रृंखला को पहचानता है। Tn5-एंजाइम की पृष्ठभूमि गतिविधि कम हो जाती है क्योंकि एंजाइम लक्ष्य एंटीबॉडी 9 के लिए बाध्यकारी होने से पहले कार्यात्मक नहींहोताहै। हालांकि, नैदानिक संदर्भ में इस विधि का कार्यान्वयन सीमित है क्योंकि इसके लिए गैर-निश्चित, जीवित कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, हाइपोटोनिक नाभिक से डीएनए के टुकड़ों को हटाने से क्रोमेटिन पर नकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है क्योंकि इसे परख के दौरान से हटा दिया जाता है। ताजा और जीवित कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए आवश्यक आवश्यकता दुर्लभ नैदानिक नमूनों के लिए और नमूनों के बड़े साथियों के लिए मुद्दों का एक स्रोत है, क्योंकि बड़े साथियों को5इकट्ठा करने में कई साल लग सकते हैं। एक अन्य प्रकार की विधि, ड्रॉप-चैप, चिप19को संसाधित करने से पहले बूंद आधारित टैगमेंटेशन उत्पन्न करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स डिवाइस का सुंदर उपयोग करती है। हालांकि, यह एक अत्यधिक विशिष्ट माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करता है और, जबकि एकल-सेल ChIP-Seq को पूरा करना संभव है, यह जीवित कोशिकाओं7, 8,9,18,19केउपयोग तक भी सीमित है। आईसीपी-सेक़ जैसे पीएलएसी-सेक़ या HiChIP पर निर्भर करने वाले नए तरीके, चिप-सेक्यू चोटियों22, 23के बीच 3-आयाम (3 डी) बातचीत को समझने का प्रयास करतेहैं। ये 3 डी विधियां रोमांचक हैं क्योंकि वे जीनोम में सीआईएस-नियामकया टीएफ मध्यस्थता बातचीत की पहचान कर रहे हैं और स्वस्थ ऊतकों में और रोग के संदर्भ में सेल प्रकार के हित में जीन अभिव्यक्ति के नियमन की समझ को बेहतर मानते हैं।

प्रोटोकॉल के सफल होने के लिए विचार करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जैसे कि सोनिकेटेड क्रोमेटिन की गुणवत्ता और एंटीबॉडी की गुणवत्ता। कतरनी दक्षता महत्वपूर्ण है, यदि क्रोमेटिन को अच्छी तरह से सोनिकेट नहीं किया जाता है, तो परख की दक्षता काफी कम हो जाती है24। सोनीशन आवश्यक सेल नंबरों के कारण चिप-एसईक्यू का एक चुनौतीपूर्ण पहलू है। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सोनिकेटर पर, 300,000 कोशिकाओं के तहत दक्षता को काफी कम कर दिया गया था। यह ChIP-Seq में एक चुनौतीपूर्ण पहलू है कि उस स्तर के तहत सोनीकेट करने के लिए अक्सर एंजाइमेटिक विखंडन की आवश्यकता होगी, जो कम निष्पक्ष है । नतीजतन, सोनीशन सच्चे माइक्रोस्केलेड चिप-सेक्यू के लिए एक प्रमुख सीमित कारक है। अन्य सोनीशन प्लेटफार्मों और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किटों का परीक्षण सोनिकेट क्रोमेटिन के लिए किया गया था, लेकिन यहां उपयोग किए जाने वाले सोनिकेटर के सबसे मजबूत और प्रजनन योग्य परिणाम थे। सोनिकेटर का एक और लाभ सोनीशन को चलाने के लिए विशेष ट्यूब खरीदने के लिए नहीं है, जो बड़ी संख्या में नमूनों से निपटने के दौरान लागत को कम करता है। इष्टतम सोनीशन के लिए, सबसे पहले, ऊपर वर्णित सोनिकेटर को प्री-वार्म करना महत्वपूर्ण है। दूसरा, गोली को lyse करने के लिए, अधिक शारीरिक विवश कोशिकाओं को तोड़ने के लिए lysing करते हुए ट्यूब के नीचे को छूने वाली पिपेट टिप की सिफारिश की जाती है। तीसरा, सोनीफिकेशन से पहले कोई भी बुलबुला गठन नमूने की क्षमता को समान रूप से सोनिकेट करने में बाधा डालता है। यदि लाइसिस के दौरान कोई बुलबुले बनते हैं, तो उन्हें पिपेट के साथ हटाना महत्वपूर्ण है। यह बहुत सारे नमूने को हटाए बिना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, लेकिन यदि टिप को बुलबुले के खिलाफ हल्के से दबाया जाता है तो इसे धीरे-धीरे बहुत नमूना के नुकसान के बिना तैयार किया जा सकता है। अंत में, चक्रों की संख्या निर्धारित करते समय, एक समय-पाठ्यक्रम पूरा करें जहां हर तीन चक्र, नमूना हटा दिया जाता है, शुद्ध किया जाता है, और एक एगर उठे जेल पर भाग जाता है। नमूनों के अधिक/कम होने से बचें क्योंकि इससे चैप दक्षता कम हो जाती है। यदि नमूना सोनिकेटेड है, तो बड़े टुकड़ों का चैप-सेक्यू गुणवत्ता24पर नकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है। दूसरी ओर, यदि नमूना अधिक हो जाता है, तो इस प्रक्रिया में लक्ष्य एपिटोप खो जाने का खतरा होता है।

ChIP-Seq का एक और अनिवार्य हिस्सा एंटीबॉडी की गुणवत्ता है। किसी भी बड़े पैमाने पर अध्ययन चलाने से पहले, एंटीबॉडी को अनुकूलित करना आवश्यक है जिसका उपयोग किया जाएगा। लक्ष्य जीनोम के ज्ञात क्षेत्रों के शोर अनुपात के लिए एक काफी उच्च संकेत प्राप्त करने के लिए है और एक और प्रजनन क्षमता है । यदि एंटीबॉडी पृष्ठभूमि संकेत का एक बहुत खींच रहा है, यह एक बड़ा इनपुट का उपयोग करें या एक अलग बहुत कोशिश की सिफारिश की जा सकती है/ यह बड़े पैमाने पर प्रयोग शुरू करने से पहले समय जोड़ देगा, लेकिन यह एक आवश्यक कदम है। सिग्नल-टू-शोर के लिए परीक्षण करने के लिए क्यूपीसीआर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जिसमें आपके एंटीबॉडी का लक्ष्य और अनुपस्थित होने के लिए जाने जाने वाले अन्य क्षेत्र के क्षेत्रों के साथ जाना जाता है। यह देखा गया है हिस्टोन संशोधनों को अधिक मजबूत और TFs की तुलना में अनुकूलन करने के लिए आसान कर रहे हैं ।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल अर्धस्वायत्त, माइक्रोस्केलेड तरीके से उच्च-थ्रूपुट हाइस्टोन-संशोधन ChIP-Seq के लिए एक मजबूत विधि प्रदान करता है। विधि हाथों की मात्रा को समय पर सीमित करता है और मैनुअल ChIP-Seq पर प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है। प्रयोगशाला में किए गए पिछले अध्ययनों ने तकनीकी प्रतिकृति पर मैनुअल सीआईपी का उपयोग किया और 0.505का स्पीयरमैन सहसंबंध औसत प्राप्त किया, हालांकि, अर्ध-तकनीक प्रणाली के साथ, 0.66(अनुपूरक तालिका 2)के एनके कोशिकाओं के औसत के साथ विभिन्न दानदाताओं के बीच स्पीयरमैन सहसंबंध। यह भी लगभग 40% कम हाथों के साथ समय पर पूरा किया गया था। यहां वर्णित विधि को हिस्टोन-संशोधनों (यहां दिखाए गए H3K27ac) के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन प्रोटोकॉल को दूसरों के लिए किसी भी संशोधन की आवश्यकता नहीं होनी चाहिए) और केवल टीएफ ChIP-Seq के लिए लागू करने के लिए मामूली संशोधनों की आवश्यकता होगी। एंटीबॉडी की गुणवत्ता के बावजूद, मुख्य संशोधन सोनीशन समय और संभावित रूप से आईपी के दौरान उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स के लिए होगा। आमतौर पर, टीएफ ChIP परख के लिए, विधि क्रोमेटिन के थोड़े लंबे टुकड़ों के साथ बेहतर काम कर सकती है (लगभग 350-800 बीपी की सीमा के साथ) टीएफ के रूप में: डीएनए परिसरों को कठोर सोनीशन6के माध्यम से बनाए रखने में कम सक्षम होने की संभावना है। बफ़र्स को कस्टम मिश्रण या अन्य उद्योग उपलब्ध किट में बदलने की भी आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि टीएफ हिस्टोन संशोधनों की तुलना में अलग व्यवहार कर सकता है।

हालांकि स्वचालित Chip तरल हैंडलर के रूप में कुछ के रूप में १०,००० कोशिकाओं के लिए परीक्षण किया गया था, वहां कम क्रोमेटिन सांद्रता पर प्रजनन क्षमता में एक नजर कमी थी । इसके कारण, प्रोटोकॉल को 10,000 से कम कोशिकाओं के लिए अनुशंसित नहीं किया गया था, जिसमें 100,000 कोशिकाएं इष्टतम स्थितियां थीं। प्रोटोकॉल भी उद्योग ChIP बफ़र्स, जो एक अतिरिक्त खर्च किया गया था, लेकिन उच्च गुणवत्ता डेटा प्रदान का उपयोग कर पूरा किया गया था । प्रोटोकॉल को सोनीशन शर्तों के संबंध में संशोधित किया जा सकता है (जब तक कतरनी क्रोमेटिन को एक ही सीमा के भीतर रखा जाता है), बफ़र्स को इम्यूनोप्रिपिफिकेशन (आईपी; अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, या चिप तरल-हैंडलर का उपयोग नहीं किया जा सकता है। प्रोटोकॉल की एक सीमा ChIP तरल हैंडलर का उपयोग है, जो एक महंगा निवेश हो सकता है और केवल एक बार में 16 नमूने चला सकते हैं । ChIP तरल हैंडलर छोटे पैमाने पर प्रतिक्रियाओं तक ही सीमित है और सेल संख्या १,०,० से अधिक की सिफारिश नहीं कर रहे हैं । हालांकि, प्रोटोकॉल इसके बिना पूरा किया जा सकता है, आईपी को पूरा करने और मैन्युअल रूप से कदम धोने के द्वारा। यदि आईपी और वॉश हाथ से पूरा हो गए थे, तो परख को पूरा करने का समय बढ़ जाएगा और प्रजनन क्षमता कम हो सकती है, लेकिन यह गाइड अभी भी उच्च गुणवत्ता वाले चपी-एसईक्यू प्रयोग को चलाने के लिए उपयोगी होगा। ध्यान दें, अन्य तरल हैंडलर्स को अर्ध-ऑटोमेटेड सीआईपी प्रतिक्रियाओं को चलाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

संक्षेप में, इस प्रणाली के प्रमुख लाभ उच्च थ्रूपुट प्रकृति है, क्योंकि आईपी और वाशिंग चरण स्वायत्त रूप से पूरे किए जाते हैं। इस प्रकार, सीआईपी प्रयोगों के अनुक्रमिक दौर पूरे किए जा सकते हैं, जिससे 48 नमूनों को पूरी तरह से संसाधित किया जा सकता है और 5 दिनों में अनुक्रमण के लिए तैयार किया जा सकता है, मैनुअल सीआईपी-एसईक्यू प्रयोगों की तुलना में सीमित हाथों-पर-समय के साथ। एक और लाभ बढ़ी हुई प्रजनन क्षमता है क्योंकि ChIP-Seq अत्यधिक प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है। अन्य तरीकों से या तो जीवित कोशिकाओं, जटिल माइक्रो-पाइपिंग सिस्टम, या काम को हाथ से पूरा करने की आवश्यकता होती है। इस प्रणाली को कम इनपुट नमूनों (<१०,० कोशिकाओं) के लिए अनुकूलित करना होगा, अंततः एकल सेल ChIP प्रतिक्रियाओं की अनुमति । यह प्रणाली पीएलएसी-सेक्यू और हिचिप22, 23जैसे नए सीआईपी विधियों के लिए अनुकूलित होने में भी सक्षम है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम तकनीकी मदद और रचनात्मक चर्चाओं के लिए विजयानंद लैब के सदस्यों और डॉ शेरॉन स्क्विज़ो और श्री जेफ्री बर्गुएट को सोनिकेटर और चिप लिक्विड हैंडलर मशीन और प्रोटोकॉल के साथ तकनीकी सहायता के लिए डायगेनोड से धन्यवाद देते हैं । इस काम को एनआईएच ग्रांट एआई108564, आर01एच114093, S10RR027366 (बीडी फेस एरिया द्वितीय), और S10OD016262 (इलुमिना हिसेक्यू 2500) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µl tube strips (8 tubes/strip) + cap strips Diagenode C30020002 Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip
AMPure XP for PCR Purification Beckman Coulter A63880 SPRI beads
Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube Corning MCT-060-C 0.65 mL low binding tube
Bioruptor Pico Sonicator Diagenode B01060010 Sonicator used in the lab but others can be used
ChIP DNA Clean & Concentrator (Capped Columns) Zymo Research D5205 DNA clean-up kit
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation ThermoFisher 10001D
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free ThermoFisher AM9260G
EGTA pH 8.0 Millipore Sigma E3889-25G
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf 2231000667
Formaldehyde solution Millipore Sigma 252549-1L
Glycine Millipore Sigma 50046-250G
H3K27ac polyclonal antibody - Premium Diagenode C15410196
HEPES (1 M) pH 7.5 ThermoFisher 15630080
IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes Illumina 20027213
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit Illumina 20034197
IP-Star Compact Automated System Diagenode B03000002 Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Roche KK2601 PCR mix
Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact Diagenode C30020003
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) ThermoFisher R0971
N,N-Dimethylformamide Millipore Sigma D4551-250ML CAUTION - low flash point
NaCl (5 M), RNase-free ThermoFisher AM9760G
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011044
PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps USA Scientific 1402-4700 8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip
Proteinase Inhibitor Cocktail Millipore Sigma P8340
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade ThermoFisher 25530049
PureLink RNase A (20 mg/mL) ThermoFisher 12091021
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent ThermoFisher P7581 Used in the flourescence quantification
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher 4485699 qPCR
ROX Reference Dye ThermoFisher 12223012
Sodium butyrate Millipore Sigma 303410-100G
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) ThermoFisher S11494 nucleic acid dye
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain - 10,000X concentrate in DMSO ThermoFisher S7563
TE Buffer ThermoFisher 12090015
Tips (bulk) Diagenode C30040020 Tips for the IP Star
True MicroChIP Kit Diagenode C01010130 Contains all the buffers for the IP; ChIP kit
UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0 ThermoFisher 15568025
UltraPure SDS Solution, 10% ThermoFisher 24730020

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References

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जीव विज्ञान अंक 162 ChIP-Seq ChIP तरल हैंडलर टैगमेंटेशन H3K27ac कम इनपुट चिपमेंटेशन स्वचालित

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies
Posted by JoVE Editors on 09/14/2020. Citeable Link.

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Pandurangan Vijayanad

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Pandurangan Vijayanand

Formal Correction: Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies
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An erratum was issued for: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies. An author's name was updated.

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Sara Herrera-da la Mata

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Sara Herrera-de la Mata

बड़े पैमाने पर एपिजेनेटिक अध्ययन के लिए एक अर्ध-सौतक ChIP-Seq प्रक्रिया
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Cayford, J., Herrera-de la Mata, S., … More

Cayford, J., Herrera-de la Mata, S., Schmiedel, B. J., Chandra, V., Vijayanad, P., Seumois, G. A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies. J. Vis. Exp. (162), e61617, doi:10.3791/61617 (2020).

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