Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En halvautomatisk ChIP-Seq-procedur för storskaliga epigenetiska studier

Published: August 13, 2020 doi: 10.3791/61617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Vaccine Discovery, La Jolla Institute for Immunology

ERRATUM NOTICE

Summary

Detta dokument beskriver ett halvautomatiskt, mikroskalat ChIP-Seq-protokoll av DNA-regioner associerade med en specifik histonmodifiering (H3K27ac) med hjälp av en ChIP vätskehanterare plattform, följt av bibliotek förberedelse med tagmentation. Förfarandet omfattar kontrollbedömning för kvalitets- och kvantitetsändamål och kan antas till andra histonändringar eller transkriptionsfaktorer.

Abstract

Kromatin immunoprecipitation följt av sekvensering (ChIP-Seq) är en kraftfull och allmänt använd metod för att profilera kromatin DNA i samband med specifika histon modifieringar, såsom H3K27ac, för att identifiera cis-reglerande DNA-element. Den manuella processen för att slutföra en ChIP-Seq är arbetsintensiv, tekniskt utmanande och kräver ofta stora celltal (>100 000 celler). Metoden som beskrivs här hjälper till att övervinna dessa utmaningar. En komplett halvautomatisk, mikroskalad H3K27ac ChIP-Seq förfarande inklusive cellfixering, kromatin klippning, immunoprecipitation och sekvensering bibliotek förberedelse, för batch av 48 prover för cellnummer indata mindre än 100,000 celler beskrivs i detalj. Den semiautonomiska plattformen minskar den tekniska variabiliteten, förbättrar signal-till-brus-förhållanden och minskar drastiskt arbetet. Systemet kan därmed minska kostnaderna genom att möjliggöra minskade reaktionsvolymer, vilket begränsar antalet dyra reagenser som enzymer, magnetiska pärlor, antikroppar och praktisk tid som krävs. Dessa förbättringar av ChIP-Seq-metoden passar perfekt för storskaliga epigenetiska studier av kliniska prover med begränsat antal celler på ett mycket reproducerbart sätt.

Introduction

Den breda användningen av ChIP-Seq-analyser för att bestämma fragment av DNA i samband med specifika histonmodifieringar beror delvis på dess förmåga att identifiera cis-regulatoriska DNA-element, inklusive aktiva förstärkare, promotorer, ljuddämpare, heterokromatin och andra1,2,3,4. Identifiering av icke-kodande regleringsregioner i hela genomet har visat värdefull insikt för att bättre förstå genreglering vid hälsa och sjukdomar4. Tidigare arbete från labbet har använt ChIP-Seq för att visa att cis-regulatoriska element kan spela viktiga roller i olika celltyper5. Transkriptionsfaktor (TF) ChIP-analyser har använts för att visa sjukdomsassocierad risk enstaka nukleotidpolymorfismer6.

Användningen av ChIP-Seq med kliniska prover från människa är utmanande, främst på grund av begränsningen av cellantalet eller det önskade vävnadsprovet. Som ett resultat har det gjorts en samlad ansträngning på fältet för att förbättra och mikroskala dessa tekniker och som ett resultat har flera analyser dykt upp, såsom CUT&TAG5,7,8,9,10,11,12. Denna analys använder en transponas för att märka och isolera genomiska regioner som är bundna av en specifik antikropp9. Denna teknik har kunnat minska celltalen ner till 1000-talet och i vissa fall till en enda cell, men användningen av denna teknik i translationell forskning och klinisk uppsättning har visat begränsningar på grund av kraven på att använda levande celler för denna metod9,12. Kravet på levande celler gör kliniska prover logistiskt svåra att hantera och kan införa batcheffekter om proverna inte bearbetas samtidigt. Andra har optimerade mikroskalade tekniker för formaldehyd-fasta celler, inklusive utvecklingen av ChIPmentation11, som är anpassad här på ett sätt med hög genomströmning. Användningen av fasta celler gör det möjligt att lagra prover fram till insamling och efterföljande bearbetning av alla prover tillsammans för att minimera batcheffekter.

Här beskrivs en halvautomatisk mikroskalad ChIP-Seq-analys som minskar experimentell praktisk tid för att profilera histonändringar10. Den halvautomatiska metoden möjliggör chIP-seq-analyser med hög genomströmning, vilket gör det möjligt att bearbeta upp till 48 prover fullt ut och vara klara för sekvensering på så lite som 5 dagar, för så få som 10 000 celler per prov med en ChIP vätskehanterare. Hanteraren slutför immunoprecipitationen (IP) och efterföljande tvättar på ett autonomt sätt, vilket bidrar till att minska variationen mellan proverna. Den halvautomatiska metoden sänker både den praktiska tiden med över 15 timmar för 48 prover och den tekniska variationen, vilket gör det möjligt att genomföra storskaliga epigenetiska studier på ett reproducerbart och snabbt sätt för antingen primära eller odlade celler. Protokollet förklarar processen från början till slut för högkvalitativ ChIP-Seq. Om de specifika datorerna inte är tillgängliga kommer protokollet fortfarande att vara en användbar resurs för att konfigurera och fel-skjuta ChIP-Seq-experiment manuellt.

Analysen utfördes med tre olika primära mänskliga immuncelltyper och en odlad cellinje (HUT78 – ATCC: TIB-161). För tydlighetens skull har protokollet delats in i sju sektioner: cellfixering, kromatinspjuvning via ultraljudsbehandling, automatiserad kromatinimmunprecipitation, biblioteksberedning genom DNA-fragmenttagmentering, biblioteksförstärkning, biblioteksrening, följt av DNA-kvantifiering. För buffertrecept se tilläggstabell 1.

Protocol

Den institutionella granskningsnämnden (IRB) vid La Jolla Institute for Allergy and Immunology (LJI; IRB-protokoll nr. SGE-121-0714) godkände studien. Friska frivilliga rekryterades och tillhandahöll leukaferesprover efter skriftligt informerat samtycke.

1. Cellfixering

  1. Få cellfjädringskoncentrationen till 1 till 2 x 106 celler/ml med komplett cellodlingsmedium i ett 15 ml-rör (<10 ml suspension) eller 50 ml-rör (10-30 ml celler). Om <1 x 106 celler, använd 0,5 ml av mediet i ett 1,5 ml-rör.
  2. Virvla försiktigt cellfjädringen, tillsätt 10x cellfixeringsbuffert droppvis (1:10; vol:vol) och rotera med låg hastighet i 10 min vid rumstemperatur (RT).
  3. Stoppa reaktionen genom att försiktigt virvla och tillsätt 2,5 M glycin i förhållandet 1:20 (vol:vol). Vänd rören några gånger och inkubera på is i minst 5 min.
  4. Utför de återstående stegen vid 4 °C eller på is. Snurra rören vid 800 x g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
  5. Resuspend pelleten försiktigt med 5 ml iskall 1x PBS och inkubera i 2 min på is.
  6. Upprepa 1,4 och 1,5 med 1 ml iskall 1x PBS och överför provet till ett förkylt 1,5 ml-rör (märkt för långtidsförvaring). I förekommande fall rekommenderas beredning av alikvoter.
  7. Snurra rören vid 1 200 x g vid 4 °C och ta bort så mycket av supernatanten som möjligt utan att störa cellpelleten. Snap frys pelleten i flytande kväve. Förvara vid -80 °C.
    VARNING: Ta lämpligt skydd vid hantering av flytande kväve.

2. Kromatin klippning

OBS: Detta protokoll är optimerat för kromatinskjuvning av pellets med 0,3 till 3 x 106 celler i 0,65 ml lågbindningsrör.

  1. Ta bort provröret med frysta cellpellets från -80 °C och förvara på torris för att undvika upptining av pelleten innan lysbufferten tillsätts. Det här steget är kritiskt.
  2. Tillsätt 70 μL färsk, RT komplett lysbuffert till pelleten och håll på RT i 1 min.
  3. Återanvänd pelleten i 1 min utan att införandet av några bubblor bildas och inkubera sedan cellfjädringen vid RT i 1 min innan provet sätts på is.
  4. Överför den återsuspenderade pelleten till ett lågt bindningsrör på 0,65 ml och håll på is.
    OBS: För att erhålla reproducerbara ultraljudsbehandling, förvärmd ultraljudsbehandling genom att köra den med endast tomma rör för 3-6 cykler innan du ultraljudsbehandling proverna.
  5. Placera proverna i ljudatorns rörhållare och fyll eventuella luckor med balansrör fyllda med 70 μL vatten. Lämna proverna i vattenbadet i ca 1 min innan ultraljudsbehandlingen påbörjas.
  6. Utför ultraljudsbehandling för x cykler (beroende på celltyp) med 16 s ON / 32 s OFF per cykel.
    OBS: Detta steg kommer att kräva validering experiment för att fastställa det optimala antalet cykler för effektiv ultraljudsbehandling.
  7. Efter var tredje cykler, ta bort proverna från ljudatorn, virvla försiktigt och pulsera rören innan du sätter tillbaka dem i hållaren. Se till att det inte finns några små droppar på utsidan av röret eftersom det kan orsaka bubbelbildning.
  8. Efter att ha slutfört de nödvändiga cyklerna, spinnprover vid >14 000 x g i 15 min vid 4 °C. Överför supernatanten till ett nytt, förkylt, lågbindande lågbindningsrör på 0,65 ml och håll på is.
  9. Decrosslink en bråkdel av de sonicated prover för att kontrollera för ultraljudsbehandling effektivitet.
    1. Överför 1-7 μL av supernatanten (motsvarande ca 250 ng skjuvkromatin) till ett 0,2 mL PCR-rör och gör volymen upp till 10 μL med kortvarig lysbuffert vid RT.
    2. Tillsätt 1 μL RNase A och inkubera i 30 min vid 37 °C vid 800 varv/min och tillsätt sedan 1 μL proteinas K.
    3. Inkubera i 2 timmar vid 55 °C med skakningar vid 1 000 varv/min.
  10. Ta bort 2 μL av det dekorlinkade provet för DNA-kvantifiering med fluorescerande kvantifieringsanalys10 (en spektrofotometer rekommenderas inte eftersom tvål och försämrat protein kan ge partiskhet i resultaten).
  11. Kör det återstående provet på en 1,2% agarosegel i 1 h vid 70 V. Fläck med nukleinsyrafärg (1:20 000) och läs av gelén med en UV-transilluminator.
  12. Förbered kromatinbuljong alikvoter för lagring (späd ut provet till 25 ng/μL i 20 μL med fullständig lysbuffert). Förvara allt skjuvkromatin vid -80 °C.

3. Automatiserad ChIP-Seq för histonmodifiering

OBS: Detta protokoll är utformat för att köras på en ChIP vätskehanterare. Även om systemet kan använda anpassade buffertar, är alla buffertar försedda med ChIP-satsen. ChIP-remsorna med 8 rör som används i detta avsnitt är specifika för ChIP-vätskehanteraren.

  1. Överför 16 prov alikvoter med 500 ng skjuvkromatin i 20 μL från -80 °C och placera dem på is för att långsamt tina kromatinet. När den har tinats upp helt, virvlar du kort och pulserar.
  2. Beredning av kromatin
    1. Pipetter 100 μL tC1-buffert kompletterad med 1x proteashämmare och 20 mM natrium butyrat (komplett tC1-buffert) i två ChIP 8-rörsremsor.
    2. Överför 20 μL av varje kromatinprov till ett lämpligt rör i ChIP 8-rörsremsorna som innehåller 100 μL komplett tC1-buffert. Tvätta kromatinrören genom att tillsätta 80 μL komplett tC1-buffert till kromatinrören och överför sedan tillbaka till lämpligt rör i ChIP 8-rörsremsorna för en slutlig volym på 200 μL.
  3. Beredning av antikroppen
    1. Beräkna antikroppsvolymen så att 0,5 μg antikroppar finns i varje rör.
      Volym av antikropp = ( antal prover x antikropp per reaktion ) / antikroppskoncentration
    2. Tillsätt den beräknade mängden antikropp i 500 μL tBW1-buffert. Snabbt virvel och pulsspinn.
    3. Pipettera 70 μL tBW1 i var och en av de två ChIP 8-rörsremsorna och tillsätt 30 μL av antikroppen + tBW1 till vart och ett av rören. Detta innebär att den totala volymen i vart och ett av rören uppgår till 100 μL.
  4. Förberedelse av den magnetiska pärlan
    1. Virvel proteinet A pärla lösning noggrant. För 0,5 μg antikropp, pipettera 5 μL pärlor i en ny uppsättning ChIP 8-rörsremsor och pulsspinn.
  5. Fyll den sista raden i ChIP vätskehanterare med märkta, tomma ChIP 8-rörsremsor.
  6. Följ ChIP-16-IPure-200D-programspecifikationerna för placering av alla remsor i ChIP vätskehanteraren. Lägg till buffertarna i rätt läge men använd tW4 i stället för tE1-buffert.
    OBS: Organisera dagen så att ChIP vätskehanteraren kommer att utföra ChIP över natten. Programmet kommer att köras i ca 16 h för 16 prover. Detta markerar slutet på dag 1.

4. Transponera integrering av biblioteksadaptrar för biblioteksförberedelser

  1. Förinställ en termomixer till 37 °C och 500 varv/min. Kyl ner en magnet för 0,2 mL rörremsor på is.
  2. För 16 prover bereder du 440 μL taggningsbuffert på is. Pipettera 53 μL till en enda ny 8-rörsremsa och håll på is.
  3. I en ny 0,2 ml 8-rörsremsa, tillsätt 220 μL kall tC1-buffert och håll på is. De 8 bandrören kan hålla denna volym och fortfarande vara täckta.
  4. Ta bort bandröret "IP-prover" från ChIP vätskehanteraren (rad 12) och kapsejsa rören innan pulsspinning. Fånga pärlorna med magneten för 8-rörsremsor i 2 minuter och ta försiktigt bort supernatanten.
  5. Överför 25 μL av tagmenteringsbufferten till pärlorna med en flerkanalig, ta bort från magneten och blanda försiktigt tills pärlorna är homogena (ca 5 gånger upp och ner med pipetten inställd på 20 μL).
  6. Kapa rören och placera i den förvärmda termomixern och inkubera i 3 min. Att öka tiden kommer att minska effektiviteten i biblioteksförberedelserna.
  7. Överför rören till ett kylt metallställ och tillsätt 100 μL kyld tC1-buffert till varje prov. Ställ in en flerkanalig pipett på 80 μL och blanda provet tills pärlorna är homogena, vilket stoppar tagmentationsreaktionen.
  8. Placera tillbaka proverna i ChIP-vätskehanteraren och fortsätt med tvättproceduren Washing_for_IP-reacts_16_Ipure. Se till att tvätten utförs två gånger med tC1-buffert och två gånger med tW4. Elutionen ska slutföras enligt programlayouten, med buffert tE1.
  9. Decrosslinking av DNA
    1. Ta bort ChIP 8-rörsremsorna i den sista raden i ChIP-vätskehanteraren och tillsätt 2 μL RNase A till varje prov.
    2. Kapa rören, pulsspinn, blanda försiktigt pärlorna med en flerkanalspipett tills blandningen är homogen och kapa om rören.
    3. Inkubera proverna i en termomixer i 30 minuter vid 37 °C och 900 varv/min.
    4. Ta bort proverna från termomixern, tillsätt 2 μL Proteinase K. Följ samma procedur som 4.9.2 efter tillsatsen.
    5. Inkubera proverna i en termomixer i 4 timmar vid 55 °C och 1 250 varv/min, följt av 65 °C vid 1 000 varv/min över natten.
      Obs: Detta är slutet av dag 2.

5. Tagmented DNA-fragment rening

  1. Märk sexton 1,5 ml-rör med lämpligt provnummer och tillsätt 400 μL DNA-bindningsbuffert från DNA-rensningssatsen till var och en.
  2. Ta bort 8-rörsremsorna från termomixern och pulsspinn remsorna för att säkerställa att eventuell förångad produkt behålls. Placera remsor på en 8-remsa magnet för att fånga pärlorna.
  3. Överför 100 μL avkopplat DNA till vart och ett av 1,5 ml-rören. Tillsätt 100 μL av DNA-bindningsbufferten till 8-rörsremsorna för att tvätta pärlorna och överför sedan till lämpligt 1,5 ml-rör.
  4. Virvel i ca 10 s och pulsspinn 1,5 ml rör.
  5. Ladda kolonnerna med 600 μL som innehåller DNA-bindningsbufferten och ChIP-provet.
  6. Snurra prover för 20 s vid 10 000 x g och ladda om kolonnen med genomströmningen. Snurra igen med samma förhållanden och kassera genomströmningen.
  7. Tvätta kolonnerna två gånger med 200 μL tvättbuffert (samma centrifugering som föregående steg) och kassera genomströmningen.
  8. Torka kolonnerna genom centrifugering i 2 min vid 12 000 x g.
  9. Överför kolonnen till ett nytt uppsamlingsrör på 1,5 mL och tillsätt 9 μL varm TE-buffert (förvärmd till 55 °C) direkt till kolonnmatrisen. Låt kolonnen inkubera i 1 min före centrifugering i 1 min vid 10 000 x g.
  10. Överför elutens 9 μL till en lämplig ny uppsättning 8-rörsremsor.
  11. Slutför elutionen igen med 8 μL TE Buffer som tidigare. Överför eluten till lämpliga 8-rörsremsor (slutlig volym 17 μL per prov) och förvara på is.

6. Förstärkning och storleksval av de renade proverna

  1. Följande steg använder qPCR för att bestämma antalet cykler som krävs för optimal förstärkning (CtD – Ct-bestämning)
  2. Förbered CtD-blandningen för alla prover genom att multiplicera innehållet i CtD Mix Buffer med antalet prover.
  3. Häll 3,6 μL CtD-blandningen i en qPCR-platta och tillsätt 1,4 μL taggade DNA-prover (~10 % av den totala volymen). Utför följande qPCR: 98 °C i 3 min, 72 °C för 5 min, 98 °C för 30 s, 26 cykler på 98 °C för 10 s, 63 °C för 30 s och 72 °C för 30 s.
  4. Förbered ampmixen för alla prover genom att multiplicera innehållet i AMP Mix Buffer med antalet prover. Dispensera 14 μL taggat DNA i separata brunnar på en PCR-platta och tillsätt sedan 2,5 μL av två sekvenseringsindexprimrar (25 μM) till varje prov (slutlig reaktionsvolym är 50 μL).
  5. Blanda proverna med flerkanalspipetter och utför det förstärkningsprogram som används i CtD med lämpligt antal cykler.
    OBS: Detta är en bra stopppunkt eftersom de förstärkta proverna kan lagras vid -20 °C i några veckor. Reningen kan dock slutföras samma dag. För 48 prover slutfördes stegen 3- 6,5 med två andra separata partier och förstärktes sedan i ett parti enligt beskrivningen nedan.
  6. Utför efterförstärkning, storleksval och kvantifiering av taggat DNA enligt beskrivningen nedan. Detta kan vanligtvis kompletteras med 48 prover (kan slutföras med färre prover efter önskemål).
    1. Tillsätt 90 μL paramagnetiska pärlor (1:1.8-förhållande) i varje brunn, blanda och låt den inkubera vid RT i 2 min.
    2. Fånga pärlorna med en plattmagnet och kassera supernatanten. Tvätta pärlorna 3 gånger med 200 μL färsk 80% etanol utan att störa pärlpelleten.
    3. Ta bort eventuellt överskott av etanol med 20 μL-spetsar efter sluttvätten och låt pärlorna torka i 10 minuter eller tills sprickor uppstår i pärlpelletsen.
    4. Med plattan fortfarande på magneten, tillsätt 40 μL av det förvärmda vattnet till varje brunn. Försegla plattan, virvla noggrant och pulsspinnplattan.
    5. Fånga pärlorna genom att placera plattan tillbaka på magneten och överför 40 μL elute till en ny "prov" Tallrik. Proverna renas nu, och nästa steg berikar fragment från 200-1000 bp.
    6. QC-steg som tillval: Ta bort 4 μL från proverna och överför till en QC-platta. Tillsätt 4 μL vatten tillbaka till proverna. Detta avgör procentandelen stora fragment.
    7. Tillsätt 22 μL paramagnetiska pärlor (1:0,55 förhållande) till proverna, blanda försiktigt och inkubera vid RT i 2 min.
    8. Placera på magneten för att fånga pärlorna i 5 min och överför supernatanterna till kolumnerna 7-12 på "prov" plattan. Ta bort plattan från magneten och tillsätt 30 μL pärlor (slutligt förhållande 1:1.3). Blanda försiktigt och låt den sitta på RT i 2 min.
    9. Fånga pärlorna i 5 minuter och kassera sedan supernatanten.
    10. Tvätta alla pärlor 3 gånger med 200 μL färsk 80 % etanol enligt beskrivningen tidigare (steg 6.6.2 – 6.6.3).
    11. När pelletsen är torra, elute DNA med 8 μL förvärmd TE-buffert till varje brunn, medan den fortfarande är på magneten.
    12. Ta bort plattan från magneten, försegla och virvla noggrant. Låt plattan inkubera i 2 min vid RT, pulsspinn och placera plattan tillbaka på magneten i 2 min. Överför supernatanten till en ny platta (platta 2).
    13. För maximal återhämtning, upprepa elution med en extra 8 μL förvärmd TE-buffert. Placera proverna i lämpliga brunnar så att varje prov har 16 μL slutbibliotek.
      OBS: I slutet av detta steg bör det finnas två plattor (en om ingen QC-platta slutfördes). QC-plattan kommer att ha de förstora utvalda fragmenten och den andra plattan ska ha 48 brunnar i slutbiblioteket (16 μL totalt).

7. Kvantifiera de slutliga biblioteken och QC-proverna med hjälp av en fluorescensanalys

  1. Fullständig DNA-kvantifiering med hjälp av en fluorescenskvantiseringsanalys eller en liknande metod.
  2. Om QC-kvantifieringen slutfördes, bestäm den procentandel av förlusten av prov som var < 1 000 bp. Det bör inte finnas mer än cirka 20% förlust – om det fanns mer kan det vara problem med de tillämpade pärlkvoterna.
  3. Bestäm storleken på fragmenten i varje prov, helst med hjälp av en kapillärelektroforesmaskin. För att beräkna molarkoncentrationen använd följande ekvation: [Bibliotekskoncentration (ng/μL) * 106]/[660 * Medianfragmentstorlek (bp)]).
    BIBLIOTEKEN är redo att slås samman (equimolar-mängder) och sekvenseras enligt nästa generations standardsekvenseringsprocedurer.

Representative Results

Som konceptbevis färdigställdes ChIP-Seq för sex mänskliga donatorer med tre uppsättningar immuncelltyper: naiva CD4 T-celler (CD4), klassiska monocyter (MO) och naturliga mördarceller (NK), berikade av FACS-sortering enligt beskrivningen före13. Det understrukna förfarandet består av nio distinkta förfaranden som anges i figur 1.

Figure 1
Figur 1: Allmänt flödesschema för förfarandet. (A) En tecknad film av det övergripande förfarandet (genererat i BioRender). (B) Flödesschema för alla viktiga steg för protokollet och den uppskattade praktiska och totala tiden som är förknippad med varje dag. Sekvenseringen kan ske i slutet av dag 5 eller senare med flera rundor. Tidslinjen kan också spridas under hela veckan, där sekventiell dag 3-4 kan slutföras flera gånger i veckan för att generera 48 ChIP-prover. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Efter cellisolering efter flödescytometri13centrifugerades sorterade celler och celler fixerades och lagrades enligt beskrivningen ovan. När alla prover hade samlats in belyses och förbereddes proverna för kromatisk klippning i omgångar om 12 enligt beskrivningen ovan. För varje prov slutfördes antalet cykler för att nå optimal ultraljudsbehandling10. Kvantitativ mätning, liksom skjuvda kromatinfragment storleksmätningar visade stor reproducerbarhet av vår metod på de tre uppsättningarna immunceller (figur 2A). De olika mänskliga immuncellerna sonicated i separata partier och gav mycket konsekvent med > 70% av provet mellan 100 - 500 bp för 14 cykler (16 s ON, 32 s OFF per cykel). Vid denna tidpunkt ansågs prover med stora fragment efter ultraljudsbehandling (< 70% av provet mellan 100 -500 bp) vara misslyckade. Dessa prover kunde antingen sonicated för 1-2 ytterligare cykler eller kasserades och ersattes senare med celler från en annan pellet. Vår metod visade ingen av proverna krävs mer ultraljudsbehandling eller eliminerades, vilket tyder på absolut robusthet i förfarandet.

Figure 2
Figur 2: Pre-sekvensering QC exempel. (A) 1,2% agarose geler visar reproducerbarhet av ultraljudsbehandling. Ultraljudsbehandling prover för 6 givare i tre celltyper: naiva CD4 T celler (CD4), Klassiska monocyter (MO) och Naturliga killer celler (NK). Proverna var sonicated för 14 cykler (16 s ON, 32 s OFF per cykel). För varje prov laddades ca 200 ng decrosslinked kromatin på en 1% agarose gel. Proverna ansågs vara bra om mer än 70 % av fragmenten ligger inom 100–500 bp. (B) Top - Analys qPCR förstärkningskurvor för att bestämma det optimala antalet cykler för förstärkning (Ct där det finns 1/2 den maximala intensiteten). De ideala proverna har en Ct på ca 15 och förstärkning kan slutföras upp till 2 cykel mer av den uppmätta Ct. Pilen är ett exempel på ett dåligt exempel där Ct är större än 18. Botten - Ett exempel på en dålig uppsättning prover visas som har en Ct större än 18. Dessa prover visade också lägre fluorescensintensitet. (C) Vänster - Fragmentanalysator elektrofores spår visade fördelningen av slutliga taggade bibliotek efter förstärkning och storleksval. Prover med mer än 85 % av fragmentbiblioteket ligger inom 200–1 000 bp ansågs vara bra prover. Mätning av fluorescensens toppintensitet anses också vara en viktig QC-parameter, även om signalen är låg är det osannolikt att provet kommer att sekvensera väl. Höger - Exempel på positiva exempel i CD4, MO och NK visas. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Efter kvantifiering kördes proverna på en ChIP vätskehanterare med H3K27ac antikroppar, följt av tagmentation med Tn5 transposas enzym. För att fastställa lämpligt antal förstärkningscykler med qPCR användes 10% av de taggade proverna. Vid bestämning av antalet cykler för förstärkning av proverna finner vi den cykel där provets intensitet är hälften av det genomsnittliga maximivärdet för cykelbestämning(figur 2B). Prover med Ct-värden på mer än 18 fungerade inte bra efter sekvensering och deras Ct-värde var därför ett tecken på ett misslyckat ChIP-prov. Dessa prover gav i allmänhet också en lägre mängd DNA efter förstärkning. Prover (100 000 cellers inmatning) med ett Ct-värde som var lika med eller mindre än 15 var idealiska och proverna mellan 15 och 18 var acceptabla men mindre konsekventa efter sekvensering. För prover med mindre än 100 000 indataceller hittades Ct-värdena vanligtvis mellan 15 och 18 men behövde inte mer än 18 cykler för att ge tillräckligt med produkt för sekvensering.

Efter DNA-taggad förstärkning renades bibliotek och storleksvaldes för att få en idealisk storleksfördelning, från 200 till 1 000 bp, för NextGen-sekvenseringen. Storleksfördelningsbedömningen på vart och ett av biblioteken slutfördes eftersom bästa sekvenseringsdata erhölls när mer än 85% av DNA-fragmenten varierade mellan 200 och 1 000 bp (figur 2C). Särskilt som samma mängd DNA (mätt genom fluorescensk kvantifiering) laddades, märktes det att proverna med lägre fluorescensintensitet i allmänhet var dåligt sekvenserade(figur 2C).

Efter sekvensering tillämpades standardkvalitetskontroller baserade på ENCODE ChIP-Seq-riktlinjerna5,14,15.

Figure 3
Figur 3: Reproducerbarheten hos immuncellsproverna. (A) H3K27ac-spår (UCSC Genome Browser, maximal intensitet, utjämningsfunktion på 4, alla med lika skalad Y-axel) för 6 givare (100 000 celler per replikat) i varje celltyp (CD4, MO och NK). Fyra exemplariska lokus visas, två med (IL2RA locus och PTPRC) och två utan berikning för H3K27ac (CCR4 och MS4A1). b)Pearson-korrelationen mellan donatorerna och motsvarande korrelationsdiagram som genereras med hjälp av en förlängning på 300 bp och 500 bp i MEDIPS-paketet för var och en av celltyperna replikerar16. (C) Sammanslagna donatorfiler för varje celltyp som visar H3K27ac-spår (UCSC Genome Browser maximal intensitet, utjämningsfunktion på 4) i celltypspecifika regioner (IL17R för CD4, CCR2 för MO och KLRC1 för NK) och den hushållande genen B2M, som finns i alla celltyper. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

För visuell kvalitetskontroll förbereddes H3K27ac anrikningsspår för visning i UCSC-genombläddraren. För fyra gen lokus visade enskilda spår för varje prov hög kartläggningskvalitet och signal-till-brus-förhållande som återspeglar den höga konsistensen och robustheten hos vår analys (figur 3A). De två lokus till vänster hyser väl uttryckta gener i dessa celltyper, medan generna i de två lokus till höger inte uttrycks och fungerar som bakgrundskontroller13 (figur 3A). Vidare användes MEDIPS-analyspaketet som variabel efter sekvensering för att bedöma korrelationsindexet mellan tekniska replikat(figur 3B)5,16,17, som fastställer graden av korrelation för läsberikningsnivå för 500 bp-lagerplatser16. För majoriteten av de paravisa jämförelserna visade Pearson korrelationsindex mer än 90% korrelation vilket tyder på hög nivå av överensstämmelse mellan de biologiska replikaten (figur 3B). Replikat med godtagbar korrelation slogs samman för att öka signal-till-brus-förhållandet. Medan celltyp-specifika lokus visade hög berikning i lämpliga celler, visade en hushållande gen (B2M) mycket konsekvent histonmodifiering (figur 3C). För analysen kommer sammanslagning av spår från replikat att öka anrikningen, förstärka den specifika signalen, även för viktiga celltypspecifika förstärkare, och minska den inter-individuella variabiliteten som är inneboende i mänskliga prover5.

Även om 100 000 celler användes för denna studie, fanns det hög reproducerbarhet för så få som 10 000 celler i en människokulturerad T-cellslinje (HUT78). Korrelationsanalys mellan ChIP-Seq-datauppsättning som utfördes från prover med mindre än 100 000 celler visade hög reproducerbarhet och korrelation ner till 10 000 celler (figur 4A).

Figure 4
Figur 4: Reproducerbarhet av prover med låg ingång. (A) Exempel på konsistensen hos H3K27ac ChIP-Seq för celler 100 000 ner till 10 000 i HUT-78-celler (en T-cells lymfom cellinje). Spåren (UCSC Genome Browser, maximal intensitet, utjämningsfunktion på 4, alla med lika skalad Y-axel) visar IL4 locus. b)Pearson-korrelationer mellan replikaten med hjälp av en förlängning på 300 bp och 500 bp i MEDIPS-paketet16.  C) Pearson-korrelationer mellan de olika cellnummergrupperna (100 000, 50 000 och 10 000 celler) med samma MEDIPS-parametrar som i (B)16. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Pearson korrelationsanalys visade hög korrelation index (83% till 92%), vilket tyder på upprätthållande av signal i låg cell nummer prover. Det fanns dock en ökad bakgrund när cellnumren minskade samt en minskning av korrelationskoefficienterna (figur 4B). För att upprätthålla låga bakgrundssignaler slogs tekniska dubbletter samman och korrelationen testades mellan grupper (figur 4C).

10X cellfixeringsbuffert
Förening Slutlig koncentration
Formaldehydlösning 11%
NaCl 100 mM
EDTA, pH 8,0 1 mM
EGTA, pH 8,0 0,5 mM
HEPES, pH 7,5 50 mM
Komplett Lysis-buffert
Förening Slutlig koncentration
Tris-HCI, pH 8,0 50 mM
EDTA, pH 8,0 10 mM
SDS 0.25%
Natrium butyrat 20 mM
Proteashämmare Cocktail 1X
Kortvarig lysbuffert
Förening Slutlig koncentration
Tris-HCI, pH 8,0 50 mM
EDTA, pH 8,0 10 mM
SDS 0.25%
Taggning Mix
Förening Slutlig koncentration
Tris-HCI, pH 8,0 10 mM
MgCl2 5 mM
N,N-dimetylformamid 10%
Illumina tagmentation enzym 1:24 vol:vol
CtD-blandning
Förening Per prov (μL)
NextEra Index Primer A (25 μM) 0.275
NextEra Index Primer B (25 μM) 0.275
2X KAPA HiFi HotStart Klar mix 2.75
1:1000 SYBR Grönt färgämne 0.11
ROX passivt färgämne 0.11
Vatten Fyll till 4 μL
AMP Mix
Förening Per prov (μL)
2X KAPA HiFi HotStart Klar mix 27.5
Vatten Fyll till 31 μL

Tilläggstabell 1: Buffertrecept.

Tilläggstabell 2: Spearman- och Pearsonprovkorrelationer för de 6 donatorerna och varje celltyp. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Metoden som beskrivs här expanderar på ChIPmentation procedure11, som implementerar ett förberedelseprotokoll för tagmentationsbibliotek före DNA-rening, genom att automatisera och mikrokalka protokollet. Sedan chip-seq började har de erforderliga cellnumren minskat drastiskt, från cirka 20 miljoner celler för histoner ner till hundratals och till och med encelliga1,7,10,12,18,19,20,21. Dessa nyutvecklade metoder har möjliggjort en djupare förståelse för hur cis-reglerandemekanismer fungerar i celler genom att öka känsligheten och möjliggöra att sällsynta kliniska cellpopulationer testas5,6,12,17. Till exempel ett av de nyare och populärare förfarandet, kallat CUT&TAG, som robust och känslig ChIP-Seq alternativ9. Det ger ett utmärkt signal-till-brus-förhållande eftersom Tn5-enzymet är kovalent bundet till protein A och känner igen Fc-kedjan av ChIP-antikroppen med hög specificitet9. Bakgrundsaktiviteten hos Tn5-enzymet reduceras eftersom enzymet inte fungerar innan det binds till målantikroppen9. Genomförandet av denna metod i ett kliniskt sammanhang är dock begränsat eftersom det kräver icke-fasta, levande celler. Avlägsnandet av DNA-fragment från hypotonkärnan kan också ha negativa effekter på kromatinet eftersom det avlägsnas från under analysen. Det nödvändiga kravet att arbeta med färska och levande celler är en källa till problem för sällsynta kliniska prover och för stora kohorter av prover, eftersom stora kohorter kan ta många år att samlain 5. En annan typ av metod, drop-ChIP, använder elegant en mikrofluidikenhet för att generera droppbaserad taggning innan chip19bearbetas . Den använder dock en högspecialiserad mikrofluidisk enhet och även om det är möjligt att slutföra encellig ChIP-Seq, är den också begränsad till användningen av levande celler7,8,9,18,19. Nyare metoder som förlitar sig på ChIP-Seq, till exempel PLAC-Seq eller HiChIP, försöker förstå 3D-interaktioner (3D) mellan ChIP-Seq-topparna22,23. Dessa 3D-metoder är spännande eftersom de identifierar cis-regulatoriskaeller TF-medierade interaktioner över genomet och bättre förståelsen av regleringen av genuttryck i celltyper av intresse, i friska vävnader och i samband med sjukdom.

Det finns några kritiska steg att tänka på för att protokollet ska bli framgångsrikt, såsom kvaliteten på det sonicated kromatinet och kvaliteten på antikroppen. Skjuvningseffektivitet är avgörande, om kromatin inte soniceras väl, minskar analysens effektivitet drastiskt24. Ultraljudsbehandling är en utmanande aspekt av ChIP-Seq på grund av de cellnummer som krävs. På ljudbehandlingsatorn som används i protokollet minskade effektiviteten drastiskt under 300 000 celler. Detta är en utmanande aspekt i ChIP-Seq när det gäller sonikering under den nivån skulle ofta kräva enzymatisk fragmentering, vilket är mindre opartiskt. Som ett resultat är ultraljudsbehandling en stor begränsad faktor för sant microscaled ChIP-Seq. Andra ultraljudsbehandling plattformar och kommersiellt tillgängliga kit testades för ultraljudsbehandling kromatin, men sonicator används här hade de mest robusta och reproducerbara resultaten. En annan fördel med ultraljudsbehandling är att inte behöva köpa specialiserade rör för att köra ultraljudsbehandling, vilket minskar kostnaderna när man hanterar ett stort antal prover. För optimal ultraljudsbehandling, för det första är det viktigt att förvärma ultraljudsbehandlingen som beskrivs ovan. För det andra, för att lysera pelleten, rekommenderas att pipettens spets vidrör botten av röret medan du lysar för att bryta upp cellerna med mer fysiska begränsningar. För det tredje hindrar varje bubbla bildning före ultraljudsbehandling förmågan hos provet att ultraljudsbehandling jämnt. Om det bildas några bubblor under lysen är det viktigt att ta bort dem med en pipett. Detta kan vara utmanande utan att ta bort mycket prov, men om spetsen trycks lätt mot bubblan kan den långsamt dras upp utan förlust av mycket prov. Slutligen, när du bestämmer antalet cykler, slutför en tidskurs där var tredje cykler, provet avlägsnas, renas och drivs på en agarose gel. Undvik över/under ultraljudsbehandling av prover eftersom detta minskar ChIP-effektiviteten. Om provet är under sonicated kan de stora fragmenten ha en negativ effekt på ChIP-Seq-kvaliteten24. Å andra sidan, om provet är överljudererat, finns det risk för att mål epitopen går vilse i processen.

En annan viktig del av ChIP-Seq är antikroppens kvalitet. Innan någon storskalig studie genomförs är det nödvändigt att optimera den antikropp som kommer att användas. Målet är att uppnå ett signifikant högt signal-brusförhållande mellan kända regioner i genomet och en annan är reproducerbarheten. Om antikroppen drar mycket bakgrundssignal kan det rekommenderas att använda en större ingång eller prova en annan lott/leverantör. Detta kommer att lägga till tid innan du startar ett storskaligt experiment, men det är ett viktigt steg. För att testa signal-till-brus rekommenderas att använda qPCR med regioner som är kända för att vara ett mål för din antikropp och en annan region som är känd för att vara frånvarande. Det har märkts histonändringar är mer robusta och lättare att optimera än TFs.

Protokollet som beskrivs ovan ger en robust metod för histonmodifiering med hög genomströmning ChIP-Seq på ett semiautonomiskt, mikroskalat sätt. Metoden begränsar mängden praktisk tid och ökar reproducerbarheten över manuell ChIP-Seq. Tidigare studier som genomförts i labbet använde manuell ChIP på tekniska replikat och erhöll ett Spearman-korrelationsmedelvärde på 0,505, men med det halvautomatiska systemet, Spearman-korrelationen mellan olika givare med ett NK-cellgenomsnitt på 0,66(tilläggstabell 2). Detta slutfördes också med cirka 40% mindre praktisk tid. Metoden som beskrivs här har optimerats för histonmodifieringar (H3K27ac visas här, men protokollet bör inte behöva någon ändring för andra) och skulle bara kräva mindre ändringar för att genomföras för TF ChIP-Seq. Trots kvaliteten på antikroppen, skulle den viktigaste modifieringen vara för ultraljudsbehandling tid och potentiellt de buffertar som används under IP. Vanligtvis, för TF ChIP-analyser, metoden kan fungera bättre med något längre fragment av kromatin (med ett intervall på cirka 350-800 bp) eftersom TF: DNA-komplex sannolikt är mindre kapabla att upprätthållas genom rigorös ultraljudsbehandling6. Buffertarna kan också behöva ändras till en anpassad blandning eller andra tillgängliga branschsatser, eftersom TFs kan bete sig annorlunda än histonändringar.

Även om den automatiserade ChIP vätskehanteraren testades för så få som 10 000 celler, fanns det en märkbar minskning av reproducerbarheten vid lägre kromatinkoncentrationer. På grund av detta rekommenderades protokollet inte till mindre än 10 000 celler, med 100 000 celler som de optimala förhållandena. Protokollet slutfördes också med hjälp av chip-buffertar från industrin, vilket var en extra kostnad men gav data av högre kvalitet. Protokollet kan ändras med avseende på ultraljudsbehandlingsförhållandena (så länge det skjuvade kromatinet hålls inom samma intervall), buffertar kan anpassas för immunoprecipitation (IP; optimering kan krävas), eller ChIP vätskehanteraren får inte användas. En begränsning av protokollet är användningen av ChIP-vätskehanteraren, vilket kan vara en dyr investering och kan bara köra 16 prover samtidigt. ChIP vätskehanterare är begränsad till småskaliga reaktioner och cellnummer större än en miljon rekommenderas inte. Protokollet kan dock slutföras utan det, genom att slutföra IP och tvätta stegen manuellt. Om IP och tvättar slutfördes för hand kommer tiden att slutföra analysen att öka och reproducerbarheten kan minska, men den här guiden kommer fortfarande att vara användbar när du kör ett högkvalitativt ChIP-Seq-experiment. Observera att andra vätskehanterare kan anpassas för att köra halvautomatiska ChIP-reaktioner.

Sammanfattningsvis är de stora fördelarna med detta system den höga genomströmningskaraktären, eftersom IP- och tvättstegen slutförs autonomt. Som sådan kan sekventiella rundor av ChIP-experiment slutföras, vilket gör att upp till 48 prover kan bearbetas helt och vara klara för sekvensering på 5 dagar, med begränsad praktisk tid jämfört med manuella ChIP-Seq-experiment. En annan fördel är den ökade reproducerbarheten eftersom ChIP-Seq kan vara svårt att få mycket reproducerbara resultat. Andra metoder kräver antingen levande celler, komplexa mikropipettingsystem eller att arbetet slutförs helt för hand. Detta system måste optimeras för låginmatningsprover (< 10 000 celler), vilket i slutändan tillåter encelliga ChIP-reaktioner. Systemet kan också anpassas för de nyare ChIP-metoderna, såsom PLAC-Seq och HiChIP22,23.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Vijayanand-labbmedlemmarna för teknisk hjälp och konstruktiva diskussioner och Dr. Sharron Squazzo och Mr. Geoffrey Berguet från Diagenode för teknisk hjälp med sonicator och ChIP vätskehanterare maskin och protokoll. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II) och S10OD016262 (Illumina HiSeq 2500).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µl tube strips (8 tubes/strip) + cap strips Diagenode C30020002 Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip
AMPure XP for PCR Purification Beckman Coulter A63880 SPRI beads
Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube Corning MCT-060-C 0.65 mL low binding tube
Bioruptor Pico Sonicator Diagenode B01060010 Sonicator used in the lab but others can be used
ChIP DNA Clean & Concentrator (Capped Columns) Zymo Research D5205 DNA clean-up kit
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation ThermoFisher 10001D
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free ThermoFisher AM9260G
EGTA pH 8.0 Millipore Sigma E3889-25G
Eppendorf ThermoMixer C Eppendorf 2231000667
Formaldehyde solution Millipore Sigma 252549-1L
Glycine Millipore Sigma 50046-250G
H3K27ac polyclonal antibody - Premium Diagenode C15410196
HEPES (1 M) pH 7.5 ThermoFisher 15630080
IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes Illumina 20027213
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit Illumina 20034197
IP-Star Compact Automated System Diagenode B03000002 Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Roche KK2601 PCR mix
Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact Diagenode C30020003
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) ThermoFisher R0971
N,N-Dimethylformamide Millipore Sigma D4551-250ML CAUTION - low flash point
NaCl (5 M), RNase-free ThermoFisher AM9760G
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011044
PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps USA Scientific 1402-4700 8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip
Proteinase Inhibitor Cocktail Millipore Sigma P8340
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade ThermoFisher 25530049
PureLink RNase A (20 mg/mL) ThermoFisher 12091021
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent ThermoFisher P7581 Used in the flourescence quantification
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System ThermoFisher 4485699 qPCR
ROX Reference Dye ThermoFisher 12223012
Sodium butyrate Millipore Sigma 303410-100G
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) ThermoFisher S11494 nucleic acid dye
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain - 10,000X concentrate in DMSO ThermoFisher S7563
TE Buffer ThermoFisher 12090015
Tips (bulk) Diagenode C30040020 Tips for the IP Star
True MicroChIP Kit Diagenode C01010130 Contains all the buffers for the IP; ChIP kit
UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0 ThermoFisher 15568025
UltraPure SDS Solution, 10% ThermoFisher 24730020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions. Science. 316, 1497-1502 (2007).
  3. Mikkelsen, T. S., et al. Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature. 448 (7153), 553-560 (2007).
  4. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nature Reviews Genetics. 13 (12), 840-852 (2012).
  5. Seumois, G., et al. Epigenomic analysis of primary human T cells reveals enhancers associated with TH2 memory cell differentiation and asthma susceptibility. Nature Immunology. 15 (8), 777-788 (2014).
  6. Schmiedel, B. J., et al. 17q21 asthma-risk variants switch CTCF binding and regulate IL-2 production by T cells. Nature Communication. 7, 13426 (2016).
  7. Ai, S., et al. Profiling chromatin states using single-cell itChIP-seq. Nature Cell Biology. 21 (9), 1164-1172 (2019).
  8. Brind'Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communication. 6, 6033 (2015).
  9. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communication. 10 (1), 1930 (1930).
  10. Youhanna Jankeel, D., Cayford, J., Schmiedel, B. J., Vijayanand, P., Seumois, G. An Integrated and Semiautomated Microscaled Approach to Profile Cis-Regulatory Elements by Histone Modification ChIP-Seq for Large-Scale Epigenetic Studies. Methods Molecular Biology. 1799, 303-326 (2018).
  11. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  12. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. Elife. 6, 21856 (2017).
  13. Schmiedel, B. J., et al. Impact of Genetic Polymorphisms on Human Immune Cell Gene Expression. Cell. 175 (6), 1701-1715 (2018).
  14. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  15. Chen, L., et al. Genetic Drivers of Epigenetic and Transcriptional Variation in Human Immune Cells. Cell. 167 (5), 1398-1414 (2016).
  16. Lienhard, M., Grimm, C., Morkel, M., Herwig, R., Chavez, L. MEDIPS: genome-wide differential coverage analysis of sequencing data derived from DNA enrichment experiments. Bioinformatics. 30 (2), 284-286 (2014).
  17. Engel, I., et al. Innate-like functions of natural killer T cell subsets result from highly divergent gene programs. Nature Immunology. 17 (6), 728-739 (2016).
  18. Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
  19. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  20. Wang, Q., et al. CoBATCH for High-Throughput Single-Cell Epigenomic Profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
  21. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  23. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  24. Diagenode. The Ultimate Guide for Chromatin Shearing Optimization with Bioruptor Standard and Plus. Diagenode. , (2012).

Tags

Biologi nummer 162 ChIP-Seq ChIP vätskehanterare tagmentation H3K27ac låg ingång spånbildning automatiserad

Erratum

Formal Correction: Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies
Posted by JoVE Editors on 09/14/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies. An author's name was updated.

The name was corrected from:

Pandurangan Vijayanad

to:

Pandurangan Vijayanand

Formal Correction: Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies
Posted by JoVE Editors on 05/19/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies. An author's name was updated.

The name was corrected from:

Sara Herrera-da la Mata

to:

Sara Herrera-de la Mata

En halvautomatisk ChIP-Seq-procedur för storskaliga epigenetiska studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cayford, J., Herrera-de la Mata, S., … More

Cayford, J., Herrera-de la Mata, S., Schmiedel, B. J., Chandra, V., Vijayanad, P., Seumois, G. A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies. J. Vis. Exp. (162), e61617, doi:10.3791/61617 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter