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Biochemistry

माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली गतिशीलता के पुनर्गठन के लिए एक मॉडल झिल्ली मंच

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/61620
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Chemistry, University of Akron, 3Department of Genetics, Harvard Medical School

Summary

माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन एक महत्वपूर्ण होमोस्टेटिक प्रतिक्रिया है जो माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता में अंतर्निहित है। यहां वर्णित माइटोकॉन्ड्रियल इन-झिल्ली संलयन का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो पुनर्गठन प्रणाली है जो झिल्ली टेदरिंग, डॉकिंग, हेमिफ्यूजन और पोर खोलने को हल कर सकती है। कोशिका झिल्ली प्रणालियों की खोज में इस दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा पर चर्चा की है।

Abstract

ऑर्गेनेल के विविध कार्यों और सेलुलर प्रतिक्रियाओं के लिए माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता आवश्यक है। भीड़, स्थानिक रूप से जटिल, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली नियामक कारकों को अलग करने के लिए एक चुनौतीपूर्ण वातावरण है। प्रोटीन और लिपिड घटकों का प्रायोगिक नियंत्रण विनियमन के विशिष्ट प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकता है। फिर भी, इन कारकों में मात्रात्मक हेरफेर सेलुलर परख में चुनौतीपूर्ण है। माइटोकॉन्ड्रिया इनर-झिल्ली संलयन के आणविक तंत्र की जांच करने के लिए, हमने एक इन विट्रो पुनर्गठन मंच पेश किया जो माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली के लिपिड वातावरण की नकल करता है। यहां हम लिपिड बाइलेयर्स तैयार करने और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के लिए विस्तृत चरणों का वर्णन करते हैं। मंच ने माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक-झिल्ली संलयन में मध्यवर्ती के विश्लेषण और मात्रात्मक तरीके से व्यक्तिगत संक्रमण के लिए काइनेटिक्स की अनुमति दी। यह प्रोटोकॉल असममित लिपिड संरचना के साथ बाइलेयर्स के निर्माण का वर्णन करता है और एक तकिया बाइलेयर में ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन के पुनर्गठन के लिए सामान्य विचारों का वर्णन करता है। विधि अन्य झिल्ली प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

झिल्ली विभाजन यूकेरियोटिक कोशिकाओं की एक बानगी है1 (चित्रा 1A)। जैविक झिल्ली को दो आयामी सॉल्वेंट से अधिक के रूप में पहचाना जाता है, और प्रोटीन फ़ंक्शन और मैक्रोमॉलिकुलर कॉम्प्लेक्स असेंबली2, 3,को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने वाले वातावरण के रूप में मानाजाताहै। देशी लिपिड लिगांड होते हैं जो झिल्ली प्रोटीन गतिविधि को विनियमित करते हैं3,4 झिल्ली स्थानिक संगठन और झिल्ली की विविध आकृतियों में मूर्तिकला की क्षमता नए कार्यों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण भौतिक गुण हैं3, 5,5.

मॉडल झिल्ली प्लेटफॉर्म बायोमिमेटिक सिस्टम हैं जो हमें सेलुलर झिल्ली संरचना, गतिशीलता और फ़ंक्शन6,,7,8को समझने में मदद करसकतेहैं। मॉडल झिल्ली में आम तौर पर परिभाषित जैव भौतिक गुणों (कठोरता, मोटाई और लोच) के साथ अच्छी तरह से परिभाषित संरचना का एक लिपिड मिश्रण शामिल होता है। फ्लोरेसेंस इमेजिंग के साथ मिलकर, मॉडल झिल्ली प्लेटफॉर्म झिल्ली संरचना,और कार्य9,10, 11के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमतिदेतेहैं।, लिपिड बाइलेयर पुनर्गठन रणनीतियों का उपयोग जाल-मध्यस्थता झिल्ली संलयन9,10,डीएनए-मध्यस्थता झिल्ली संलयन 12, और वायरल फ्यूजन,11,,13का अध्ययन करने के लिए किया गया है।11 इस तरह के तरीकों का लाभ एक नमूदार प्रतिक्रिया घटना14से पहले मध्यवर्ती चरणों के लिए गतिज जानकारी प्राप्त करने की क्षमता है ।

प्लाज्मा झिल्ली बड़े पैमाने पर मॉडल झिल्ली का उपयोग कर अध्ययन किया गया है। लिपिड चरण पृथक्करण वाले बाइलेयर्स को सेलुलर सिग्नलिंग11 , 15,,16में महत्वपूर्ण लिपिडबेड़ासंरचनाओं का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । सेल रिसेप्टर्स के संगठन की जांच के लिए माइक्रोपैटर्न्ड लिपिड प्लानर बाइलेयर्स17,,18 का उपयोग किया गया है। झिल्ली-साइटोस्केलेटन संगठन, सेल सिग्नलिंग के दौरान झिल्ली प्रोटीन विभाजन, और सेल-सेलसंपर्कों 19पर माइग्रेशन का अध्ययन करने के लिए पॉलीमिमेटिक सिस्टम के रूप में बहुलक या जेल समर्थित झिल्ली का उपयोग किया गया है।

उपकोशिकीय ऑर्गेनेल्स20का अध्ययन करने के लिए कृत्रिम झिल्ली प्रणालियां भी लागू की जा रही हैं । ऑर्गेनेल्स में विशिष्ट मॉर्फोलोजी होते हैं जो अलग-अलग उप-वातावरण बनाते हैं। एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) नेटवर्क एक उदाहरण है। लिपोसोम्स में रेटिकुलन के पुनर्गठन पर, सेलुलर ईआर के समान गुणों के साथ ट्यूबलर झिल्ली संरचनाएं21बनती हैं। एटास्टिन के अलावा, एक ईआर फ्यूजन प्रोटीन, लिपिसोम्स से लिपिड ट्यूबल को एक नेटवर्क20बनाने के लिए प्रेरित कर सकता है। यह एक उदाहरण है कि प्रोटियोलोपसोम ऑर्गेनेल आकृति विज्ञान और गतिशीलता में कार्यात्मक अंतर्दृष्टि कैसे प्रदान कर सकते हैं।

माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संलयन और विखंडन22 , 23, 24 ,,,25केस्वास्थ्यकेलिए आवश्यक हैं ।24 डायनामिन परिवार का एक सेट जीटीपैस माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली संलयन को उत्प्रेरित करता है। एमएफएन 1/2 बाहरी झिल्ली संलयन को उत्प्रेरित करता है। Opa1 मध्यस्थता आंतरिक झिल्ली संलयन26 (चित्रा 1B)। Opa1 के दो रूप हैं: एक लंबा रूप (एल-ओपा1), माइटोकॉन्ड्रियल इनर-झिल्ली के लिए ट्रांसमेम्ब्रान-लंगर, और इंटरमेम्ब्रेन अंतरिक्ष में मौजूद एक 'घुलनशील' लघु रूप (एस-Opa1) । दो Opa1 रूपों का अनुपात दो प्रोटेस, ओमा1 और Yme1L,,27, 28, 29,,30की गतिविधि द्वारा विनियमित कियाजाताहै।30 Opa1 विनियमन में महत्वपूर्ण प्रश्नों में शामिल हैं: ओपा1 के दो रूप, (छोटे और लंबे) झिल्ली संलयन और उनके नियामक परस्पर क्रिया28,29, 31,,,32,,,33कैसे मध्यस्थता करते हैं।32

यहां हम माइटोकॉन्ड्रियल इन-झिल्ली संलयन की जांच करने के लिए सफलतापूर्वक लागू एक पुनर्गठन रणनीति का वर्णन करते हैं जिसने आंतरिक झिल्ली संलयन में एल-और एस-ओपा1 की भूमिकाओं को स्पष्ट किया। हमने एक पॉलीमर-टेथर्ड लिपिड बाइलेयर और 200 एनएम यूनिलैमलर वेसिकल्स का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल इनर-झिल्ली की नकल करने वाला एक मंच विकसित किया। लिपिड बाइलेयर के नीचे एक बहुलक तार के लाभों में निम्नलिखित शामिल हैं। सबसे पहले, यह पुनर्गठित ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन को संरक्षित करता है, जो अन्यथा ग्लास स्लाइड34की निकटता से बाधित हो सकता है। दूसरे, यह लिपिड बाइलेयर और ग्लास सब्सट्रेट के बीच एक मोटी पानी की परत में कार्य करता है, जो पोर खोलने9के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है, और तीसरा खूंटी बहुलक की चिपचिपा प्रकृति झिल्ली वक्रता35को बदलने की अनुमति देती है। हमने झिल्ली संलयन(चित्रा 1सी-एफ)में चरणों की विशेषता के लिए तीन-रंग फ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग किया।

Figure 1
चित्रा 1: माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संलयन की निगरानी।
(A)ऑर्गेनेल्स सेलुलर झिल्ली के डिब्बे होते हैं। (ख)माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संलयन के अनुक्रमिक कदम। माइटोकॉन्ड्रिया की बाहरी झिल्ली का संलयन Mfn1 और/या Mfn2 द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है, जबकि आंतरिक झिल्ली संलयन Opa1 द्वारा मध्यस्थता की जाती है । (सी-एफ) माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संलयन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो पुनर्गठन मंच की योजनाबद्ध। मंच में दो भाग शामिल हैं: एक प्रोटियोलिपोसोम और एक बहुलक-टेथर्ड लिपिड बाइलेयर, दोनों पुनर्गठित एल-Opa1 के साथ। फ्लोरोसेंट लेबल, जिसमें दो अलग-अलग फ्लोरोसेंट झिल्ली रंग और एक सामग्री मार्कर शामिल हैं, झिल्ली संलयन के दौरान चरणों को अलग करने में मदद करते हैं। दो झिल्ली मार्कर (Cy5-PE (लाल) और टेक्सासरेड पीई (नारंगी) एक FRET जोड़ी बनाते हैं, जो क्लोज झिल्ली डॉकिंग पर रिपोर्ट कर सकते हैं। टेक्सासरेड-पीई का प्रसार जो प्रोटियोलिपोम को लेबल करता है, लिपिड डेमिक्सिंग (हेमिफसियन) का संकेतक है। सामग्री रिलीज कैल्सीन सिग्नल (हरे रंग में दिखाया गया) के dequenching के माध्यम से निगरानी की जाती है। बायोरेंडर का उपयोग करके बनाए गए पैनल ए और बी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Protocol

1. लिपिड मिश्रण की तैयारी

  1. 1,2-डाइओलियोइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3फोस्फोकोलिन (डीओपीसी), 1-पामिटोइल-2-ओलिओइल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोथेनेलामाइन (पोप), एल-α-फॉस्फेटिलिनोसिटॉल (लिवर PI), कार्डियोलिपिन, को भंग करके एक लिपिड स्टॉक समाधान तैयार करें, और 1,2-डाइयोलियोल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोथेनमाइन-एन-[मेथोक्सी (पॉलीथीन ग्लाइकोल) -2000] (18:1 PEG2000 पीई) 25 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर क्लोरोफॉर्म में । 1 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर फ्लोरोसेंट डाई-संयुग्मित लिपिड (टेक्सासरेड डीएचपीई और साइ5 डोप) क्लोरोफॉर्म को भंग करें। लिपिड समाधान को क्लोरोफॉर्म प्रतिरोधी लाइनर के साथ एम्बर शीशियों में स्टोर करें, आगे पॉलीटट्राफ्लोरोएथिलीन टेप के साथ सील किया गया। समाधान 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
  2. समाधान ए और बी बनाओ।
    1. समाधान तैयार करने के लिए लिपिड मिलाएं ए (अंतिम एकाग्रता 1 मिलीग्राम/एमएल) जिसमें डीओपीसी (52.8 मोल%), पोप (20 मोल%), लिवर पीआई (7 मोल%) और कार्डियोलिपिन (20 मोल%), और 0.2 मोल% फ्लोरोफोर।
    2. समाधान बी (अंतिम एकाग्रता 1 मिलीग्राम/एमएल) डीओपीसी (47.8 मोल%), पोप (20 मोल%), लिवर पीआई (7 मोल%), कार्डियोलिपिन (20 मोल%) और डोप-PEG2000 (5 मोल%), और 0.2 मोल% फ्लोरोफोर।
    3. ग्लास सिरिंज का उपयोग करके एम्बर शीशियों में भंडारण समाधान की गणना की गई मात्रा को जोड़कर लिपिड मिश्रण उत्पन्न करें। शीशियों में अतिरिक्त क्लोरोफॉर्म जोड़कर अंतिम मात्रा का मिलान करें।
      नोट: एफसीएस (फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी) के लिए, डाई संयुग्मित लिपिड के अनुपात को 0.002 मोल% तक कम करें और बाकी को डीओपीसी द्वारा प्रतिस्थापित करें।

2. लिपिड बिलेयर्स का निर्माण

  1. बेक माइक्रोस्कोप कवर ग्लास स्लाइड 30 मिनट के लिए 520 डिग्री सेल्सियस पर। बेकिंग के बाद, कवर स्लाइड को कमरे के तापमान में ठंडा करें।
  2. सोडियम हाइड्रोक्साइड के लगभग 10 ग्राम वजन और सरगर्मी करते समय मेथनॉल के 500 मिलीएल करने के लिए जोड़ें। 2 घंटे के लिए हिलाओ, समाधान में सोडियम हाइड्रोक्साइड जोड़ने के लिए जब तक तेज़ दिखाने के लिए शुरू जारी है । पूरी प्रक्रिया के दौरान उपयुक्त पीपीई पहनना सुनिश्चित करें।
  3. ग्लास स्लाइड को 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट समाधान में साफ करें; सोडियम हाइड्रोक्साइड के साथ संतृप्त मेथनॉल; और 50 m m हाइड्रोक्लोरिक एसिड, क्रमिक रूप से (30 मिनट के लिए प्रत्येक स्थिति के तहत स्नान sonication) । प्रत्येक स्थिति के बीच 10 मिनट के लिए अल्ट्रापुरे पानी में ग्लास स्लाइड को साफ करें।
    नोट: हालांकि ग्लास स्लाइड तैयारी के लिए ताजा समाधानों का उपयोग करने की अत्यधिक सिफारिश की गई है, प्रत्येक समाधान को 5x तक या 1 महीने के भीतर पुन: उपयोग किया जा सकता है, जो भी पहले आता है। प्रत्येक उपयोग से पहले समाधान को हलचल-मिश्रित करना सुनिश्चित करें।
  4. अच्छी बाइलेयर गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए 2 सप्ताह तक एचसीएल समाधान में सील किए गए साफ कवर ग्लास को स्टोर करें। यदि अल्ट्रापुरे पानी में संग्रहीत किया जाता है, तो एक सप्ताह के भीतर स्लाइड का उपयोग करें।
  5. क्लोरोफॉर्म और अल्ट्रापुरे पानी का उपयोग करके लैंगमुइर-ब्लॉडगेट सूई प्रणाली के पॉलीटीट्राफ्लोरोएथिलीन गर्त को साफ करें जब तक कि द्रोणिका पर कोई गीला नहीं देखा जाता है। द्रोणिका की सतह पर क्लोरोफॉर्म स्प्रे करें, सेल्यूलोज वाइप्स 3x के साथ अच्छी तरह से पोंछें। अल्ट्रापुरे पानी से कुल्ला करें और सक्शन के माध्यम से पानी निकालें। 3x दोहराएं।
  6. गर्त की सतह को साफ अल्ट्रापुरे पानी से ढक दें।
  7. सफाई समाधान या अल्ट्रापुरे पानी से सतह-उपचारित कवर ग्लास के 2 टुकड़े लें, और लगभग 30 एस के लिए अल्ट्रापुरे पानी के साथ ग्लास स्लाइड कुल्ला करें।
  8. कवर ग्लास को बैक-टू-बैक तरीके से रखें। ग्लास स्लाइड को पकड़ने के लिए सब्सट्रेट क्लैंप का उपयोग करें। लैंगमुइर नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर मैन्युअल रूप से "डिपर डाउन" पर क्लिक करके पानी की सतह के नीचे ग्लास स्लाइड विसर्जित करें।
  9. फिल्म संतुलन को शून्य करें, ध्यान से हवा-पानी इंटरफेस(चित्रा 2A)पर ड्रॉप द्वारा समाधान बी ड्रॉप फैल रहा है । सुनिश्चित करें कि लिपिड केवल हवा-पानी इंटरफेस पर फैल रहे हैं, कोई क्लोरोफॉर्म और लिपिड बूंदों पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन सतह के नीचे करने के लिए डूब के साथ ।  यह सुनिश्चित करने में विफलता एक लिपिड "चैनल" बनाएगी और मोनोलेयर गठन को रोकेगी।
  10. फिल्म बैलेंस रीडआउट तक लिपिड जोड़ना बंद करें ~ 15-20 mn/m के आसपास, ~ 10-15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें । "प्रयोग शुरू करें" पर क्लिक करके सतह क्षेत्र को बदलने के लिए बैरियर नियंत्रक शुरू करें, जब तक कि फिल्म बैलेंस 37 mn/m तक रीडआउट न हो जाए। ~ 20-30 मिनट(चित्रा 2B) केलिए दबाव रखें।
  11. 37 mn/m पर सतह तनाव को बनाए रखते हुए 22 मिमी/मिनट की गति से कवर ग्लास उठाएं। पॉलीमर टेथरिंग के साथ एक लिपिड मोनोलेयर को एयर-वॉटर इंटरफेस से ब्लॉडगेट सूई प्रक्रिया(चित्रा 2सी)के माध्यम से कवर ग्लास की सतह पर स्थानांतरित किया जाएगा। यह लिपिड बिलेयर का निचला पत्रक बनाता है।
  12. सक्शन द्वारा हवा-पानी इंटरफेस को साफ करें, अल्ट्रापुरे पानी से गर्त को कुल्ला करें।
  13. उपयोग से पहले क्लोरोफॉर्म, इथेनॉल और अल्ट्रापुरे पानी का उपयोग करके एक-वेल ग्लास स्लाइड (उदाहरण के लिए, शाफर स्लाइड) को साफ करें। पानी की परत के नीचे अल्ट्रापुरे पानी के साथ गर्त पर साफ ग्लास स्लाइड सेट करें। सुनिश्चित करें कि अच्छी तरह से हवा-पानी इंटरफेस की ओर सामना करना पड़ रहा है और ग्लास स्लाइड पूरी तरह से कवर किया जाता है जब तक ताजा अल्ट्रापुरे पानी डालना। दोहराएं चरण 2.8।
  14. सिलिकॉन सक्शन कप का उपयोग करके चरण 2.4 से लिपिड मोनोलेयर के साथ कवर ग्लास को पकड़ें (सुनिश्चित करें कि मोनोलेयर साइड सक्शन कप से दूर है), लिपिड मोनोलेयर को धीरे-धीरे हवा-पानी इंटरफ़ेस में धकेलें, इंटरफ़ेस पर ~ 2-3 एस के लिए कवर ग्लास रखें, फिर स्लाइड(चित्रा 2D)के खिलाफ कवर ग्लास को पुश करें। स्लाइड स्लाइड के साथ बाहर ले लो एक कवर स्लाइड के साथ ।
    नोट: लिपिड बाइलेयर कवर ग्लास की सतह पर आयोजित किया जाएगा दो स्लाइड(चित्रा 2E)के बीच सैंडविच क्षेत्र का सामना करना पड़ रहा है ।
  15. एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के लिए बाइलेयर के साथ कवर ग्लास ले लो। लिपिड बाइलेयर की छवि। यदि लिपिड डाई का एक सजातीय वितरण मनाया जाता है, तो 30 एस के लिए बाइलेयर के एक छोटे से क्षेत्र को फोटोब्लैक करें, ~ 30 एस-1 मिनट के लिए प्रकाश स्रोत बंद करें, फिर वसूली का निरीक्षण करने के लिए फिर से छवि करें। लिपिड बाइलेयर फ्लोरेसेंस रिकवरी दिखाएगा ।
    नोट: दोष या खराब फ्लोरेसेंस वसूली के साथ झिल्ली का उपयोग आगे के प्रयोगों के लिए नहीं किया जाना चाहिए।

Figure 2
चित्रा 2: एक बहुलक-सीमित लिपिड बाइलेयर बनाने में कदम।
लैंगम्यूर-ब्लॉडगेट सूई(ए-सी)और लैंगम्यूर-शेफर ट्रांसफर(डी)तकनीकों का उपयोग करके लिपिड बाइलेयर्स बनाने के कदम। (ई)लिपिड बाइलेयर युक्त अंतिम "सैंडविच" । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

3. बहुलक-सीमित लिपिड बाइलेयर में प्रोटीन पुनर्गठन

  1. अल्ट्रापुरे पानी युक्त क्रिस्टलीकरण पकवान तैयार करें। एक साफ माइक्रोस्कोप छवि अंगूठी तैयार करें और पकवान के नीचे रखें।
  2. Schaefer स्लाइड के "सैंडविच" विसर्जित करें और कवर ग्लास जो पानी के नीचे लिपिड बाइलेयर युक्त होते हैं, धीरे-धीरे शेफर स्लाइड को अलग करें और ग्लास को कवर करें, कवर ग्लास स्लाइड को नीचे से पकड़ें, बिलेयर की ओर से दूर, कवर ग्लास को इमेज रिंग में स्थानांतरित करें, इमेज रिंग को बंद करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि लिपिड बिलेयर के साथ कवर ग्लास हमेशा पानी में होता है, और अंगूठी अच्छी तरह से सील हो जाती है।
  3. छवि की अंगूठी में अल्ट्रापुरे पानी को बीआईएस-ट्रिस एनएसीएल बफर के साथ बदलें, सुनिश्चित करें कि लिपिड बाइलेयर किसी भी हवा के बुलबुले के संपर्क में नहीं है। लिपिड बाइलेयर में 1.1 x10-9 एम-ऑक्टाइल-ए-डी-ग्लूकोपिरिनोसाइड जोड़ें। तुरंत 1.2 x 10-9 एम डीडीएम और 1.3 x 10-12 मोल शुद्ध एल-Opa136 का मिश्रण छवि की अंगूठी में जोड़ें। 2 घंटे(चित्रा 3)के लिए कम गति पर एक बेंचटॉप शेखर पर इनक्यूबेट नमूना ।
    नोट: डिटर्जेंट प्रोटीन के पुनर्गठन के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
  4. 30 मिलीग्राम एसएम-2 राल मोती को 3 एमएल में बीआईएस-ट्रिस बफर और शेक के 3 एमएल में लगाने से पहले वितरित करें। छवि की अंगूठी में एसएम-2 राल मोतियों के 5 ~ 10 माइक्रोन जोड़ने के लिए प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करें, 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, कुल्ला करके राल मोती हटा दें। छवि की अंगूठी में बफर की अंतिम मात्रा 1.5 एमएल है।

Figure 3
चित्र 3: एक बहुलक-सीमित लिपिड बाइलेयर में एल-Opa1 के पुनर्गठन के लिए प्रक्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

4. प्रोटियोलिपोम की तैयारी

  1. क्लोरोफॉर्म सॉल्यूशन में 1 मिलीग्राम लिपिड मिश्रण ए तैयार करें। 20 मिनट के लिए नाइट्रोजन प्रवाह के तहत क्लोरोफॉर्म वाष्पित और रात भर वैक्यूम के तहत रखने के लिए और एक लिपिड फिल्म के रूप में ।
  2. 1.5 मोल नाओएच समाधान के 50 एमएल में 15.56 ग्राम कैल्सीन को भंग करके बफर युक्त 50 m m calcein तैयार करें, कमरे के तापमान पर हलचल करें जब तक कि कैल्सीन पूरी तरह से भंग न हो जाए, 12.5 एमएम बीआईएस-ट्रिस और अल्ट्रापुरे पानी को 500 मीटर की अंतिम मात्रा में जोड़ा जाए। पीएच को 7.5 पर समायोजित करें।
  3. बफर युक्त कैल्सीन में लिपिड फिल्म को निलंबित करें, 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन को गर्म करके लिपिड को पूरी तरह से हाइड्रेट करें। 200 एनएम लिपोसोम्स पॉलीकार्बोनेट झिल्ली का उपयोग करके एक्सट्रूसेशन के माध्यम से बनते हैं।
  4. 0.5 माइक्रोन डीईएम डीडीएम में एल-Opa1 के 2 माइक्रोग्राम को 0.2 मिलीग्राम लिपोसोम और 1.5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जोड़ें। 250 मिलीलीटर 25 एमआईएस-ट्रिज़, 150 एमएल एनएसीएल और 50 एमएम कैल्सीन बफर के खिलाफ 3.5 केडीए डायलिसिस कैसेट का उपयोग करके सर्फेक्टेंट को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हटा दें, दो बार बफर बदलें।
  5. पीडी-10 डीसल्टिंग कॉलम का उपयोग करके अतिरिक्त कैल्सीइन निकालें।

5. इमेजिंग और डेटा विश्लेषण

  1. 100x तेल-विसर्जन उद्देश्य (एनए 1.4) का उपयोग करके TIRF छवियों का अधिग्रहण करें। टेक्सासरेड-पीई लेबल लिपोसोम्स और प्रोटेओलिपोसोम्स के विश्लेषण के लिए 543 एनएम लेजर और 488 एनएम लेजर का उपयोग करें जो कैल्शियम के साथ समझाया गया है। प्लानर लिपिड बाइलेयर में एम्बेडेड Cy5-पीई के विश्लेषण के लिए 633 एनएम लेजर का उपयोग करें।
  2. अधिकतम उत्सर्जन प्राप्त करने के लिए लिपिड बाइलेयर का उपयोग करके टीआईआरएफ कोण को संरेखित करें। पुनर्गठन के बाद लिपिड बाइलेयर की गुणवत्ता 25 डिग्री सेल्सियस पर 100x तेल उद्देश्य का उपयोग करके देखी जाती है। फॉस्फोलिपिड और पुनर्गठित बाइलेयर का प्रसार गुणांक एफसीएस का उपयोग करके37और अन्य जगहों पर वर्णन करने वाले प्रोटोकॉल के साथ निर्धारित किया जाता है ।
  3. छवि की अंगूठी में 2 मिलीग्राम/एमएल प्रोटेओल्पोसोम के 10 माइक्रोन जोड़ें और छवि से पहले 10 मिनट के लिए सेट करें। जीटीपी, जीएमपीपीसीपी या जीडीपी को 1 एमएमएम एमजीसीएल2 और 1 एमएम न्यूक्लियोटाइड के साथ रिएक्शन रिंग में जोड़ा जाता है।
  4. झिल्ली संलयन में एस-Opa1 के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, टिट्रेट एस-Opa1 एक प्रोटेपोलिपोसोम/समर्थित बाइलेयर नमूना में एल-Opa1 युक्त, और रिकॉर्ड संलयन घटनाओं ।
  5. टेक्सासरेड-डीएचपीई और कैल्सीन की एक साथ इमेजिंग बीम-बंटवारे प्रणाली के माध्यम से हासिल की जाती है। दोनों 488 एनएम और 543 एनएम लेजर एक साथ flourescent उत्तेजन स्रोतों के रूप में नमूने के लिए लागू कर रहे हैं। उत्सर्जन प्रकाश तो एक ५६० एनएम बीम स्प्लिटर का उपयोग कर विभाजित है । इसके बाद स्प्लिट एमिशन लाइट को 42 एनएम की बैंडविड्थ और 40 एनएम की बैंडविड्थ के साथ 609 एनएम फिल्टर के साथ 510 एनएम फिल्टर करके फिल्टर किया जाता है। फ़िल्टर बीम कैमरा चिप पर दो निकटवर्ती क्षेत्रों के लिए अनुमानित है।
  6. फ्लोरोसेंट उत्सर्जन एक साथ 40 एनएम की बैंडविड्थ के साथ 609-उत्सर्जन फिल्टर के माध्यम से दर्ज किया जाता है, और 70 एनएम की बैंडविड्थ के साथ 698-उत्सर्जन फिल्टर होता है। माइक्रोस्कोप सिस्टम -10 डिग्री सेल्सियस पर बनाए गए सीएमओएस कैमरे से लैस है।
  7. लिपोसोम्स की कण पहचान गॉसियन-आधारित कण मान्यता एल्गोरिदम का उपयोग करके की जा सकती है। कण वितरण और तीव्रता चैनल-बाय-चैनल का विश्लेषण कर रहे हैं । कणों को अलग करने के लिए एक लिपिड बाइलेयर सिग्नल का उपयोग मास्क के रूप में किया जाता है।

Representative Results

पुनर्गठित ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन स्वतंत्र रूप से फैलता है और झिल्ली में सजातीय रूप से वितरित किया जाता है।

उदाहरण के लिए लिपिड बाइलेयर और उसके लिपिड तरलता की छवियां जो एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा मान्य हैं , चित्र 4में दिखाई गई हैं । फोटोब्लैचिंग से पहले और बाद में बाइलेयर में लिपिड वितरण चित्र 4ए, बीमें दिखाया गया है । लिपिड बाइलेयर की एकरूपता को पुनर्गठन से पहले और बाद में एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना की गई थी(चित्रा 4डी, ई)। लिपिड बाइलेयर में पुनर्गठित एल-ओपा1 को फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) द्वारा मान्य किया गया था। हम बाइलेयर की लिपिड डिफ्यूजनिटी का मूल्यांकन करने के लिए डाई संयुग्मित लिपिड का उपयोग करते हैं। पुनर्गठित Opa1 को फ्लोरोसेंट-टैग एंटी-Opa1 सी-टर्मिनल एंटीबॉडी का उपयोग करके लेबल किया गया था। बाइलेयर लिपिड प्रसार को 1.46 ± 0.12 माइक्रोन2/s के रूप में मापा गया था, जबकि बाइलेयर-पुनर्गठित एल-ओपा1 का प्रसार गुणांक 0.88 ± 0.10 माइक्रोन2/s था। एफसीएस वक्र्स से तीव्रता रीडआउट ने संकेत दिया कि एल-ओपा1 का 75% लिपिड बाइलेयर(चित्रा 4जी, एच)में पुनर्गठित किया गया है। इन परिणामों से पता चलता है कि एल-ओपा1 स्वतंत्र रूप से बहुलक-सीमित लिपिड बाइलेयर में स्वयं को कार्यात्मक परिसरों में इकट्ठा करने की क्षमता के साथ फैलाता है।

Figure 4
चित्र 4: मॉडल झिल्ली में लिपिड और पुनर्गठित प्रोटीन का वितरण।
(ए-सी) एक लिपिड बाइलेयर और उसके लिपिड तरलता की उदाहरण छवियां एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा मान्य हैं। (Aफोटोब्लैचिंग से पहले बाइलेयर में सजातीय लिपिड वितरण। (ख)फोटोब्लैचिंग के तुरंत बाद स्नैपशॉट । (ग)फ्लोरेसेंस रिकवरी के बाद चित्रित बिलेयर पुनर्गठन के बाद झिल्ली की अच्छी लिपिड तरलता को इंगित करता है । (D,E) पहले(डी)और ई के बाद(ई)एल-Opa1 पुनर्गठन के प्रतिनिधि छवियों से संकेत मिलता है कि पुनर्गठन प्रक्रिया ने बाइलेयर में दोष पैदा नहीं किया । एलेक्सा 488 संयुग्मित एंटीबॉडी(एफ)के साथ लेबल एल-Opa1 की प्रतिनिधि TIRF छवि पुनर्गठन पर Opa1 का एक सजातीय वितरण दिखा। जी प्रतिनिधि कच्चे फोटॉन फ्लोरोसेंट सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा एल-Opa1 संकेत की गिनती । नियंत्रण में, कोई एल-Opa1 बिलेयर में पुनर्गठन किया गया था, जबकि एंटीबॉडी जोड़ा और कुल्ला किया गया था । एल-Opa1 का प्रसार झिल्ली में लिपिड की तुलना में काफी धीमा है, जो ट्रांसमेम्ब्रेन एल-ओपा1(एच)के सफल पुनर्गठन के अनुरूप है। स्केल बार: 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फ्लोरेसेंस स्टेप ब्लीचिंग ने संकेत दिया कि एल-ओपा1 की औसतन 2-3 प्रतियां दिए गए लिपोसोम(चित्रा 5ए, बी)में पुनर्गठित की गई थीं। डीएलएस(चित्रा 5सी)का उपयोग करके पुनर्गठन के बाद Opa1 पुनर्गठित प्रोटिटोलिपोसोम के आकार वितरण का परीक्षण किया गया था। प्रोटियोलिपोसोम्स में Opa1 के पुनर्गठन को भी एफसीएस का उपयोग करके सत्यापित किया गया था। मुक्त एंटीबॉडी का प्रसार गुणांक 164 ± 22 माइक्रोन2/ लिपिड डाई के साथ लेबल किए गए लिपोसोम्स के लिए प्रसार गुणांक 2.22 ± 0.33 माइक्रोन2/s था, और एल-ओपा1 प्रोटियोलिपोसोम के लिए प्रसार गुणांक एक टेक्सासरेड लेबल एंटी-उनकी एंटीबॉडी 2.12 ± 0.36 m2/s था।

Figure 5
चित्रा 5: प्रोटियोलिपोसोम्स का निर्माण और लक्षण वर्णन।
(क)एन्केसेटेड, शमन कैल्सीन के साथ प्रोटेओलिपोसोम गढ़ने में कदम । (ख)फ्लोरोसेंट स्टेप-ब्लीचिंग के प्रतिनिधि आंकड़े लिपोसोम में एम्बेडेड एल-ओपा1 की औसतन 2-3 प्रतियां दिखाते हैं । (ग)जीटीपी इनक्यूबेशन (ग्रीन) के बाद बिना किसी न्यूक्लियोटाइड 1 एच के प्रोटेलिपपोसोम्स (लाल) का प्रतिनिधि आकार वितरण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली टेदरिंग, लिपिड डेमिक्सिंग/हेमिफसेशन, और पोर खोलने का पता लगाना।

टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी(चित्रा 6 ए)का उपयोग करके लिपिड बाइलेयर की सतह पर टेक्सासरेड के संकेत को देखकर झिल्ली टेदरिंग की निगरानी की जाती है। झिल्ली लिपिड डेमिक्सिंग (हेमीफ्यूजन) व्यवहार को टेक्सासरेड के माध्यम से निगरानी की गई थी क्योंकि डाई लिपिड बाइलेयर में लिपोसोम्स से फैलती है। कैल्सीन डिक्वेंचिंग केवल लिपिड डेमिक्सिंग से पूर्ण संलयन ताकना गठन को अलग करने में मदद करता है। यह उन स्थितियों के बीच तुलना की अनुमति देता है जहां कण हेमिफ्यूजन (अंजीर 6B) पर स्टाल करते हैं, और कण जो पूर्ण संलयन(चित्रा 6C)के लिए आगे बढ़ते हैं।

झिल्ली टेदरिंग लिपोसोम्स से एक स्थिर लिपिड संकेत द्वारा इंगित की जाती है। दूरी का मूल्यांकन दो झिल्ली36के लेबल के बीच FRET संकेत के आधार पर किया जा सकता है । हेमिफुशन सिग्नल में कैल्सीन सिग्नल(चित्रा 6B, निचलीपंक्ति) में कोई डीक्लेंचिंग नहीं है, लेकिन टेक्सासरेड सिग्नल का तेजी से क्षय लिपिड बाइलेयर(चित्रा 6B ऊपरी पंक्ति) में डाई के प्रसार को इंगित करता है। पूर्ण संलयन (पोर खोलने के साथ) दोनों लिपिड क्षय और सामग्री रिलीज(चित्रा 6C)सुविधाएं । टेक्सासरेड तीव्रता और कैल्सीन तीव्रता को झिल्ली संलयन36के काइनेटिक्स के लिए मात्रात्मक विवरण प्रदान करने के लिए समय-निर्भर तरीके से ट्रैक किया जा सकता है।

Figure 6
चित्रा 6: प्रतिनिधि परिणाम कण टेदरिंग (ए, स्केल बार 10 माइक्रोन), हेमीफ्यूजन (बी, स्केल बार 0.5 माइक्रोन), और फ्यूजन (सी, स्केल बार 0.5 माइक्रोन) दिखा।
(A)जीटीपी अतिरिक्त से पहले Opa1-पुनर्गठित लिपिड बाइलेयर को सीमित प्रोटियोलिपोमोस। (ख)हेमिफुशन का एक उदाहरण । बी में ऊपरी पंक्ति लिपिड डेमिक्सिंग (टेक्सासरेड सिग्नल, लाल), बी में निचली पंक्ति इन स्थितियों के तहत कोई सामग्री रिलीज (कैल्सीन सिग्नल, ग्रीन) नहीं दिखाती है। (ग)लिपिड बाइलेयर के साथ प्रोटियोलिपोसोम फ्यूजिंग का एक प्रतिनिधि ट्रेस । सामग्री रिलीज कैल्सिन (निचली पंक्ति, हरे) के dequenching दिखाने की निचली पंक्ति में छवियों से देखा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इन विट्रो मॉडल-झिल्ली सिस्टम अच्छी तरह से परिभाषित स्थितियों के तहत जटिल झिल्ली प्रक्रियाओं का वर्णन कर सकते हैं। ये प्रणालियां जटिल आणविक प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक न्यूनतम घटकों को आणविक तंत्र 6,15,20,,38से प्रकट करने के लिए अलग कर सकती हैं ।15 झिल्ली प्रोटीन के लिए, लिपोसोम्स और प्लानर समर्थित बिलेयर आम पुनर्गठन प्रणाली हैं। ठोस समर्थित लिपिड बिलायर के विपरीत, पॉलीमर-टेथर्ड बाइलियर्स में सब्सट्रेट और समर्थित झिल्ली के बीच बहुलक तकिया बड़े झिल्ली प्रोटीन की मुफ्त गतिशीलता की अनुमति देता है, और ट्रांसमेम्ब्रेन-प्रोटीन को स्वतंत्र रूप से34को फैलाना और इकट्ठा करने की अनुमति देता है। इन विशेषताओं ने हमें माइटोकॉन्ड्रिया इनर-झिल्ली संलयन36के काइनेटिक्स की जांच करने में मदद की।

हमने लैंगम्यूर-ब्लॉडगेट/लैंगमुइर-शेफर (एलबी/एलएस) तकनीकों का उपयोग करके एक बहुलक-सीमित लिपिड बाइलेयर तैयार किया । यह हमें असममित लिपिड घटकों के साथ एक बाइलेयर तैयार करने की अनुमति देता है। सेलुलर झिल्ली में असममित पत्रक संरचना होती है, और एलबी/एलएस दृष्टिकोण ऐसे बाइलेयर्स के अध्ययन की अनुमति देता है। शेफर ट्रांसफर के साथ, एक पूरे ग्लास सब्सट्रेट को लिपिड बाइलेयर द्वारा कवर किया जा सकता है। बाइलेयर तैयारी के लिए एक साफ सतह तैयार करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, यह एक Schaefer हस्तांतरण सही ढंग से प्रदर्शन करने के लिए अभ्यास लेता है । असफल शेफर स्थानांतरण लिपिड बाइलेयर में अवांछित दोष पैदा कर सकता है। इस प्रोटोकॉल में फिल्म बैलेंस में जोड़ा गया प्रेशर 20% कार्डियोलिपिन वाले बाइलेयर के लिए लागू होता है। अन्य घटकों के साथ बाइलेयर्स के लिए, प्रमुख घटकों के सतह दबाव-क्षेत्र को संदर्भित करें। एक वैकल्पिक विधि लैंगमुर-ब्लॉडगेट/वेसिकल फ्यूजन (एलबी/वीएफ) विधि है, जहां नीचे लिपिड मोनोलेयर को एक लैंगमुर गर्त के हवा-पानी इंटरफेस से एक साफ सब्सट्रेट पर स्थानांतरित किया जाता है, फिर लिपोसोम समर्थित लिपिड मोनोलेयर के शीर्ष पर फ्यूज होते हैं और अंतिम बिलेयर39बनाते हैं। एलबी/वीएफ विधि का उपयोग करके झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन एलबी/एलएस की तुलना में अधिक सीधा है, क्योंकि पुनर्गठन प्रोटियोलिपोसोम्स के संलयन के माध्यम से किया जा सकता है । हालांकि, वेसिकल फ्यूजन को अतिरिक्त लिपोसोम्स के अलावा की आवश्यकता होती है, जो एकाग्रता पर निर्भर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन पर निर्भर झिल्ली की घटनाओं के अध्ययन को जटिल बना सकता है।

एक पसंदीदा कार्यात्मक अभिविन्यास में बहुलक-टेथरेड लिपिड बाइलेयर्स और लिपोसोम दोनों में ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन का सफल पुनर्गठन महत्वपूर्ण है, फिर भी लागू करना मुश्किल है। इसके लिए प्रायोगिक नियंत्रणों की आवश्यकता है। बहुलक-सीमित लिपिड बिलायर के लिए, पुनर्गठन के दौरान लिपिड बाइलेयर की अखंडता को बनाए रखना भी महत्वपूर्ण है। लिपिड बाइलेयर को भंग करने से रोकने के लिए सर्फेक्टेंट सांद्रता को अपेक्षाकृत कम रखा जाना चाहिए, लेकिन ब्याज37,,40के प्रोटीन के विकृति को रोकने के लिए पर्याप्त उच्च। यहां वर्णित विधि एकल अणु अध्ययनों के लिए झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के लिए आदर्श है, लेकिन बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए जरूरी नहीं है। सर्फेक्टेंट विकल्प एक और महत्वपूर्ण विचार है। अक्सर, शुद्धिकरण और भंडारण के लिए उपयोग किया जाने वाला सर्फेक्टेंट एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। सर्फेक्टेंट की अधिकतम एकाग्रता आमतौर पर सीएमसी36के ~ 200 गुना कम होती है, एक ऐसी सीमा में जहां सर्फेक्टेंट प्रोटीन स्थिरता बनाए रखता है और झिल्ली36की अखंडता को बनाए रखता है। 2 या 3 सर्फेक्टेंट युक्त कॉकटेल पर विचार किया जा सकता है। लिपोसोम्स में पुनर्गठन के लिए, सर्फेक्टेंट की कम एकाग्रता आवश्यक नहीं है। हालांकि, सीएमसी के नीचे सर्फेक्टेंट सांद्रता लिपोसोम्स के लिए एक समान आकार और आकृतिविज्ञान वितरण को बनाए रखने के लिए बेहतर है। सामग्री डाई के रिसाव को रोकने के लिए, डाई युक्त बफर के खिलाफ डायलाइज़ करना आवश्यक है।

लिपोसोम-आधारित संलयन परख के विपरीत, हमने जो मंच स्थापित किया है वह झिल्ली संलयन के प्रत्येक चरण के काइनेटिक्स की जांच करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह विधि निकट-देशी परिस्थितियों में ट्रांसमेम्ब्रान फ्यूजन प्रोटीन का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करती है। मॉडल झिल्ली प्लेटफार्मों झिल्ली प्रोटीन विधानसभा और अल्पाधिकार, झिल्ली "मूर्तिकला", और उपकोशिकीय वातावरण में प्रोटीन के प्रोटीन लिपिड बातचीत, माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली की तरह अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । यह विधि झिल्ली-प्रोटीन इंटरप्ले में महत्वपूर्ण शारीरिक स्थितियों की खोज की अनुमति देती है, जैसे कि बाइलेयर संरचना विषमता। लिपोसोम्स और पॉलीमर समर्थित बाइलेयर्स दोनों के बाइलेयर गुणों में एक प्रमुख माइटोकॉन्ड्रियल लिपिड, कार्डियोलिपिन की भूमिका को परिभाषित किया जाना बाकी है। आयनिक शक्ति, झिल्ली मोटाई, झिल्ली कठोरता, झिल्ली वक्रता, और झिल्ली लोच गुण जैसे गुण सभी विशिष्ट कार्यात्मक राज्यों में असेंबली करने के लिए प्रोटीन की क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं। भविष्य के अध्ययन रचनात्मक मॉडल झिल्ली प्रणाली लागू करने के लिए झिल्ली प्रोटीन संगठन और समारोह के नए पहलुओं को उजागर करने की क्षमता है ।

Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

लेखकों चार्ल्स एच हूड फाउंडेशन बाल स्वास्थ्य अनुसंधान पुरस्कार और मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल में आणविक जीव विज्ञान विभाग से उदार समर्थन से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) Avanti polar lipid Cat #: 810335C1mg membrane fluorescent markers
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 880130P lipid molecules
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 710335P lipid molecules
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) Avanti Polar lipids Cat #: 850375P lipid molecules
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar lipids Cat #: 850757P lipid molecules
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit ThermoFisher Scientific A20181
Amber vial with PTFE liner Fisher scientific 14-955-332 sample vials to keep lipid solutions
Calcein Sigma-Aldrich Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 fluorescent dye
Chloroform Fisher scientific 298-500/ C295-4 Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works.
Concavity slide (1 well) Electron Microscopy Science 71878-05 applied as Schaefer Slide
FCS analysis tool Smith Lab, University of Akron software tool
Fiji /ImageJ Fiji SCR_002285 software tool
Fisherbrand Cover Glasses: Circles Fisher scientific 12-545-102 Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M
GTP Disodium salt SIGMA-ALDRICH INC Cat #: 10106399001
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough Biolin Scientifc KN2002
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 850091P lipid molecules
Mini Extruder Avanti Polar lipids 610020
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside Anatrace Cat #: D310 25 GM surfactant for reconstitution
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside Anatrace Cat #: O311HA 25 GM surfactant for reconstitution
PC Membranes 0.2μm Avanti Polar Lipids 610006
Rabbit Anti-Opa1 antibody NOVUS BIOLOGICALS Cat #: NBP2-59770 antibody for Opa1 C-terminal detection
Slidebook Intelligent imaging RRID: SCR_014300 software tool
Teflon threaded seal tape Fisher Scientific NC0636085 taflon tape for sample storage
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) ThermoFisher Scientific Cat #: T1395MP membrane fluorescent markers

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References

  1. Sackmann, E. Biological membranes architecture and function. Structure and Dynamics of Membranes. Lipowsky, R., Sackmann, E. 1, Elsiever. 1-63 (1995).
  2. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118, Pt 6 1099-1102 (2005).
  3. Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).
  4. Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations. Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).
  5. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  6. Chan, Y. H., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  7. Biswas, K. H., Groves, J. T. Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies. Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).
  8. Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications. Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).
  9. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).
  10. Kiessling, V., et al. Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes. Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).
  11. Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion. Nature Communication. 7, 11401 (2016).
  12. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophysical Journal. 101 (8), 37 (2011).
  13. Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion. Elife. 3, 04389 (2014).
  14. Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
  15. Sezgin, E., Schwille, P. Model membrane platforms to study protein-membrane interactions. Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).
  16. Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures. Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).
  17. Dutta, D., Kam, L. C. Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems. Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).
  18. Groves, J. Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. , Springer. Boston, MA. (2006).
  19. Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).
  20. Wang, N., Rapoport, T. A. Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions. Journal of Cell Science. 132 (4), 227611 (2019).
  21. Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
  22. Chan, D. C. Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health. Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).
  23. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  24. Wai, T., Langer, T. Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation. Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).
  25. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).
  26. Chen, H., et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).
  27. Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1. EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).
  28. Anand, R., et al. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).
  29. Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation. Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).
  30. Baker, M. J., et al. Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics. EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).
  31. DeVay, R. M., et al. Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion. Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).
  32. Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress. Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).
  33. Ban, T., et al. Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).
  34. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  35. Shilts, K., Naumann, C. A. Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates. Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).
  36. Ge, Y., et al. Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane. Elife. 9, 50973 (2020).
  37. Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).
  38. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).
  39. Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level. Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).
  40. Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).

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Ge, Y., Boopathy, S., Smith, A., Chao, L. H. A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics. J. Vis. Exp. (163), e61620, doi:10.3791/61620 (2020).

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