Summary
Mitokondriel fusion er en vigtig hjemostatisk reaktion underliggende mitokondrielle dynamik. Beskrevet her er en in vitro rekonstitution system til at studere mitokondrielle indre membran fusion, der kan løse membran tøjring, docking, hemifusion, og pore åbning. Alsidigheden i denne tilgang til at udforske cellemembransystemer diskuteres.
Abstract
Mitokondriel dynamik er afgørende for organellets forskellige funktioner og cellulære reaktioner. Den overfyldte, rumligt komplekse, mitokondrielle membran er et udfordrende miljø for at skelne lovgivningsmæssige faktorer. Eksperimentel kontrol af protein- og lipidkomponenter kan hjælpe med at besvare specifikke spørgsmål om regulering. Endnu, kvantitativ manipulation af disse faktorer er udfordrende i cellulære analyser. For at undersøge den molekylære mekanisme mitokondrier indre membran fusion, introducerede vi en in vitro rekonstitution platform, der efterligner lipid miljøet af mitokondrielle indre membran. Her beskriver vi detaljerede trin til forberedelse af lipidtlagere og rekonstituerende mitokondrielle membranproteiner. Platformen tillod analyse af mellemprodukter i mitokondriel indre membran fusion, og kinetik for individuelle overgange, på en kvantitativ måde. Denne protokol beskriver fremstillingen af tolags med asymmetrisk lipid sammensætning og beskriver generelle overvejelser for rekonstituering transmembrane proteiner i en polstret tolags. Metoden kan anvendes til undersøgelse af andre membransystemer.
Introduction
Membranindrætning er kendetegnende for eukaryoteceller 1 (Figur 1A). Biologiske membraner anerkendes i stigende grad som mere end et todimensionelt opløsningsmiddel og betragtes som et miljø, der spiller en afgørende rolle i reguleringen af proteinfunktionen og det makromolekylærekompleks 2,3. Native lipider er ligander, der regulerer membran protein aktivitet3,,4. Membran rumlig organisation og evnen af membraner til at blive formet i forskellige former er vigtige fysiske egenskaber for at vælge nye funktioner3,5.
Modelmembranplatforme er biomimetiske systemer, der kan hjælpe os med at forstå cellulære membranstruktur, dynamik ogfunktion 6,,7,,8. Modelmembraner består typisk af en lipidblanding af veldefineret sammensætning med definerede biofysiske egenskaber (stivhed, tykkelse og elasticitet). Koblet til fluorescensbilleddannelse giver modelmembranplatforme mulighed for kvantitativ analyse afmembranstrukturog funktion 9,10,11. Lipid tolags rekonstitutionsstrategier er blevet brugt til at studere SNARE-medieret membranfusion9,10, DNA-medieret membranfusion12og viral fusion11,13. En fordel ved sådanne metoder er muligheden for at indhente kinetiske oplysninger om mellemliggende trin forud for en observerbar reaktionshændelse14.
Plasmamembranen er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af modelmembraner. Bilayers med lipid fase adskillelse er blevet udviklet til at studere lipid flåde strukturer vigtigt i cellulære signalering11,,15,16. Micropatterned lipid planar toayers17,,18 er blevet brugt til at undersøge organiseringen af cellereceptorer. Polymer eller gel-støttede membraner er blevet brugt som biomimetiske systemer til at studere membran-cytoskeleton organisation, membran protein partitionering under celle signalering, og migration på celle-celle kontakter19.
Der anvendes også kunstige membransystemer til undersøgelse af delcellulære organeller20. Organeller har karakteristiske morfologier, der skaber forskellige undermiljøer. Endoplasmic reticulum (ER) netværk er et eksempel. Ved rekonstituering af reticulons i liposomer dannes rørformede membranstrukturer med egenskaber svarende til den cellulære ER21. Tilsætning af atlastin, en ER fusion protein, kan fremkalde lipid tubuli fra liposomer til at danne et netværk20. Dette er et eksempel på, hvordan proteoliposomer kan give funktionel indsigt i organelle morfologi og dynamik.
Mitokondriel membranfusion og fission er afgørende for mitokondrielle befolkningssundhed 22,23,24,25. Et sæt af dynamin familie GTPases katalyzes mitokondrier membran fusion. Mfn 1/2 katalyserer ydre membranfusion. Opa1 formidler indre membranfusion26 (Figur 1B). Opa1 har to former: en lang form (l-Opa1), transmembran-forankret til mitokondriel indre membran, og en 'opløselig' kort form (s-Opa1), til stede i intermembrane rummet. Forholdet mellem de to Opa1-formularer reguleres af to proteaser, Oma1 og Yme1L27,28,29,30. Vigtige spørgsmål i Opa1-forordningen omfatter: hvordan de to former for Opa1 , (kort og lang) mægle membran fusion og deres lovgivningsmæssige samspil28,29,31,32,33.
Her beskriver vi en rekonstitutionsstrategi med succes anvendt til at undersøge mitokondriel indre membran fusion, der præciserede roller l- og s-Opa1 i indre membran fusion. Vi udviklede en platform, der efterligner mitokondriel indre membran ved hjælp af en polymer-tøjret lipid tolags og 200 nm unilamellar vesikler. Fordelene ved en polymer tøjr under lipid tolags omfatter følgende. For det første bevarer det rekonstituerede transmembrane protein, som ellers ville blive forstyrret af nærheden til glasslide34. For det andet, det tjener et tykt vandlag mellem lipid tolags og glas substrat, som letter undersøgelser af pore åbning9, og for det tredje den viskoelastiske karakter af PEG polymer tillader membran krumning ændringer35. Vi brugte tre-farve fluorescens billeddannelse til at karakterisere trin i membran fusion(Figur 1C-F).
Figur 1: Overvågning af mitokondriel membranfusion.
(A) Organelles er cellulære membran rum. BB) Sekventielle trin af mitokondriel membranfusion. Fusion af den ydre membran af mitokondrier er katalyseret af Mfn1 og / eller Mfn2, mens indre membran fusion er medieret af Opa1. (C-F) Skematisk af in vitro rekonstitution platform til at studere mitokondrielle membran fusion. Platformen indeholder to dele: en proteoliposom og en polymer-tøjret lipid toayer, begge med rekonstitueret l-Opa1. Fluorescerende etiketter, herunder to forskellige fluorescerende membranfarvestoffer og en indholdsmarkør, hjælper med at skelne trin under membranfusion. De to membranmarkører (Cy5-PE (rød) og TexasRed PE (orange) gør en FRET par, som kan rapportere om tæt membran docking. Diffusion af TexasRed-PE, der etiketter proteoliposom er en indikator for lipid demixing (hemifusion). Indholdsudgivelse overvåges ved afklukning af calceinsignalet (vist med grønt). Paneler A og B oprettet ved hjælp af Biorender. Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
1. Fremstilling af lipidblandinger
- Der forberedes en lipidbestandsopløsning ved at opløse 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3phosphocholin (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (POPE), L-α-phosphaylinositol (Lever-PI), kardioin, og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-2000] (18:1 PEG2000 PE) i chloroform ved en koncentration på 25 mg/ml. Opløs fluorescerende farvestofkonjugeret lipid (TexasRed DHPE og Cy5 DOPE) chloroform i en koncentration på 1 mg/ml. Lipidopløsningen opbevares i ravhætteglas med chloroformresistent foring, yderligere forseglet med polytetrafluorethylentape. Opløsningen kan opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder.
- Lav løsninger A og B.
- Bland lipid til at forberede opløsning A (slutkoncentration 1 mg/ml), der indeholder DOPC (52,8 mol%), POPE (20 mol%), Lever PI (7 mol%) og kardiolipin (20 mol%), og 0,2 mol% fluorophore.
- Gør opløsning B (slutkoncentration 1 mg/ml) indeholdende DOPC (47,8 mol%), POPE (20 mol%), lever PI (7 mol%), kardiolipin (20 mol%) og DOPE-PEG2000 (5 mol%), og 0,2 mol% fluorophore.
- Lipidblandingen genereres ved at tilsætte den beregnede mængde opbevaringsopløsning i gule hætteglas med en glassprøjte. Match det endelige volumen ved at tilsætte ekstra chloroform i hætteglassene.
BEMÆRK: For FCS (fluorescens korrelation spektroskopi), mindske forholdet mellem farvestof konjugeret lipid til 0,002 mol% og erstatte resten med DOPC.
2. Fremstilling af lipid tolags
- Mikroskopet bages ved 520 °C i 30 min. Efter bagning skal dækslet køles ned til stuetemperatur.
- Ca. 10 g natriumhydroxid vejes og tilsættes til 500 ml methanol under omrøring. Rør i 2 timer, fortsætte med at tilføje natriumhydroxid i opløsningen, indtil udfældes begynder at vise. Sørg for at bære passende PV under hele processen.
- Rengør glasdias i 10% natrium dodecylsulfatopløsning; methanol mættet med natriumhydroxid og 50 mM saltsyre, sekventielt (bad sonikering under hver betingelse i 30 min). Rengør glasrutsjebanen i ultrarent vand i 10 minutter mellem hver tilstand.
BEMÆRK: Selvom det anbefales stærkt at bruge friske opløsninger til fremstilling af glasrutsjebane, kan hver opløsning genbruges op til 5x eller inden for 1 måned, alt efter hvad der kommer først. Sørg for at røre-mix opløsningen før hver brug. - Opbevar det rensede dækglas forseglet i HCl-opløsning i op til 2 uger for at sikre en god tolagskvalitet. Hvis de opbevares i ultrarent vand, skal du bruge diasene inden for en uge.
- Polytetrafluorethylentrug af Langmuir-Blodgett dypningssystemet rengør ved hjælp af chloroform og ultrarent vand, indtil der ikke observeres befugtning på truget. Spray chloroform på trugoverfladen, tør grundigt med cellulose klude 3x. Skyl med ultrarent vand og fjern vandet via sugning. Gentag 3x.
- Dæk overfladen af truget med rent ultrarent vand.
- Tag 2 stykker overfladebehandlet dækglas fra rengøringsopløsning eller ultrarent vand, og skyl glasrutsjebanen med ultrarent vand i ca. 30 s.
- Anstrækkets dækglasset på en back-to-back-måde. Brug underlaget klemme til at holde glasset dias. Fordyb glasrutsjebanen under vandoverfladen ved manuelt at klikke på "dipper down" på Langmuir-kontrolsoftwaren.
- Nul filmbalancen, omhyggeligt sprede Løsning B dråbe for dråbe på luft-vand interface(Figur 2A). Sørg for, at lipider kun spredes ved luft-vand-grænsefladen, uden at chloroform og lipiddråber synker til bunden af polytetrafluorethylens overflade. Manglende sikre dette vil skabe en lipid "kanal" og forhindre monolag dannelse.
- Stop tilføje lipider indtil film balance udlæsning omkring ~ 15-20 mN/m, vente i ~ 10-15 min. Start barrierecontrolleren for at ændre overfladearealet ved at klikke på "start eksperimenter", indtil filmbalanceudlæsning til 37 mN/m. Hold trykket i ~ 20-30 min (Figur 2B).
- Dækglasset løftes med en hastighed på 22 mm/min. og overfladespændingen fastholdes ved 37 mN/m. En lipidmonlayer med polymer tethering vil blive overført fra luft-vand interface til overfladen af dækglas gennem Blodgett dypning proces (Figur 2C). Dette danner den nederste folder af lipid tolags.
- Rengør luft-vand interface ved at suge, skyl truget med ultrarent vand.
- Rengør en en-welled glas dias (f.eks Shaefer dias) ved hjælp af chloroform, ethanol, og ultrapure vand før brug. Indstil den rene glasrutsjebane på truget med ultrarent vand under vandlaget. Sørg for, at brønden vender opad mod luft-vand interface og hæld frisk ultrarent vand, indtil glasset dias er fuldt dækket. Gentag trin 2.8.
- Hold dækglasset med lipidmonstræber fra trin 2.4 ved hjælp af en siliciumsugekop (sørg for, at monolagsiden er væk fra sugekoppen), skub forsigtigt lipidmonslaget til luftvandsgrænsefladen, hold dækslet i ~ 2-3 s ved grænsefladen, og skub derefter dækglasset mod diaset (Figur 2D). Tag sliden ud med et dæksel.
BEMÆRK: Lipid-tolagsen holdes på overfladen af dækglasset, der vender ud mod det klemte område mellem de to objektglas (Figur 2E). - Tag dækslet glas med tolags til en epifluorescens mikroskop. Billede lipid toayer. Hvis der observeres en homogen fordeling af lipidfarvestof, skal der fotobleger et lille område af tolagsen i 30 s, slukke lyskilden i ~30 s-1 min., og derefter billedet igen for at observere opsvinget. Lipid tolags vil vise fluorescens opsving.
BEMÆRK: Membraner med defekter eller dårlig fluorescensgenvinding bør ikke anvendes til yderligere forsøg.
Figur 2: Trin i fremstillingen af en polymer-tøjret lipid tolags.
Trin til at gøre lipid tolags ved hjælp af Langmuir-Blodgett dypning (A-C) og Langmuir-Schaefer overførsel (D) teknikker. (E) Den sidste "sandwich", der indeholder lipidtlagen. Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Protein rekonstitution i polymer-tøjret lipid tolags
- Forbered en krystallisering parabol, der indeholder ultrarent vand. Forbered en ren mikroskop billedring og sted under fadet.
- Nedsænk "sandwich" af Schaefer dias og dække glas, der indeholder lipid tolags under vandet, forsigtigt adskille Schaefer dias og dække glas, hold dækslet glas dias fra bunden, væk fra tolagssiden, overføre dækslet glas i billedet ring, lukke billedringen.
BEMÆRK: Sørg for, at dækglasset med lipidtlage altid er i vand, og at ringen er godt forseglet. - Udskift ultrarent vand i billedringen med Bis-Tris NaCl buffer, sørg for lipid tolags ikke udsættes for nogen luftbobler. Der tilsættes 1,1 x 10-9 M n-Octyl-β-D-Glucopyranoside til lipidtolagsen. Straks tilsættes blandingen af 1,2 x 10-9 M DDM og 1,3 x 10-12 mol renset l-Opa136 i billedringen. Der inkuberes prøve på en bænktopshaker ved lav hastighed i 2 timer (Figur 3).
BEMÆRK: Vaskemidlerne kan variere afhængigt af det protein, der skal rekonstitueres. - Fordel 30 mg SM-2 Harpiksperler i 3 ml Bis-Tris buffer og ryst før påføring. Brug en plastik pipette til at tilføje 5 ~ 10 μL SM-2 Harpiks perler til billedringen, inkubere i 10 min, fjerne harpiks perler ved skylning. Den endelige volumen af bufferen i billedringen er 1,5 ml.
Figur 3: Procedure for rekonstituering af l-Opa1 til en polymer-tøjret lipid tolag. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Udarbejdelse af proteoliposomer
- Forbered 1 mg lipid blanding A i chloroform opløsning. Fordampechloroform under kvælstof flow i 20 min og holde under vakuum natten over og danne en lipid film.
- Der tilberedes 50 mM calceinholdig buffer ved opløsning af 15,56 g calcein til 50 ml 1,5 mol NaOH-opløsning, omrøres ved stuetemperatur, indtil calcein er helt opløst, tilsættes 12,5 mM Bis-Tris og ultrarent vand til det endelige volumen på 500 ml. PH-3 til 7,5.
- Lipidfilm i kalceinholdig buffer, hydrer lipidet fuldt ud ved opvarmning af suspensionen ved 65 °C i 20 min. 200 nm liposomer dannes ved ekstrudering ved hjælp af en polycarbonatmembran.
- Der tilsættes 2 μg l-Opa1 i 0,5 μM DDM til 0,2 mg liposom og inkuberes ved 4 °C i 1,5 timer. Overfladeaktive stoffer fjernes ved dialyse med en 3,5 kDa dialysekassette mod 250 ml 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl og 50 mM calcein buffer ved 4 °C natten over, hvilket ændrer bufferen to gange.
- Fjern ekstra calcein ved hjælp af en PD-10 afsaltningskolonne.
5. Billedbehandling og dataanalyse
- Ansk dem TIRF-billeder ved hjælp af et 100x mål for olienedsænkning (N.A 1.4). Brug 543 nm laser og en 488 nm laser til analyse af TexasRed-PE mærket liposomer og proteoliposomer indkapslet med calcein. Brug en 633 nm laser til analyse af Cy5-PE indlejret i planar lipid tolags.
- Juster TIRF-vinklen ved hjælp af en lipidtlage for at opnå maksimal emission. Kvaliteten af lipid tolag efter rekonstitution observeres ved hjælp af en 100x olie mål ved 25 °C. Diffusionskoefficienten for fosfolipid og rekonstitueret tolag bestemmes ved hjælp af FCS med en protokol, der beskrivesandetsteds 37.
- Der tilsættes 10 μL 2 mg/ml proteoliposomer til billedringen og indstilles til 10 minutter før billedet. GTP, GMPPCP eller BNP tilsættes i reaktionsringen med 1 mM MgCl2 og 1 mM nukleotid.
- For at bestemme indflydelsen af s-Opa1 i membranfusion, titrat s-Opa1 i en proteoliposome/ understøttet tolagsprøve, der indeholder l-Opa1, og registrere fusionshændelser.
- Samtidig billedbehandling af TexasRed-DHPE og calcein opnås gennem et strålespaltningssystem. Både 488 nm og 543 nm lasere påføres samtidig på prøven som flourescent excitation kilder. Emissionslyset opdeles derefter ved hjælp af en 560 nm strålesplitter. Den opdelte emission lys derefter filtreres af en 510 nm filter med en båndbredde på 42 nm og en 609 nm filter med en båndbredde på 40 nm. Den filtrerede stråle projiceres til to tilstødende områder på kamerachippen.
- Fluorescerende emissioner registreres samtidig gennem et 609-emissionsfilter med en båndbredde på 40 nm og et 698-emissionsfilter med en båndbredde på 70 nm. Mikroskopsystemet er udstyret med et CMOS-kamera, der vedligeholdes ved -10 °C.
- Partikelidentifikation af liposomer kan udføres ved hjælp af en gaussisk-baseret partikelgenkendelsesalgoritme. Partikelfordelingen og -intensiteten analyseres kanal for kanal. En lipid tolags signal bruges som en maske til at isolere partikler.
Representative Results
Det rekonstituerede transmembrane protein spredes frit og fordeles homogent i membranen.
Eksempel billeder af en lipid tolags og dens lipid fluiditet valideret af epifluorescens mikroskopi er vist i figur 4. Lipidfordeling i tolags før og efter fotobleaching er vist i figur 4A,B. Homogeniteten af lipidtågeen blev visualiseret ved hjælp af et epifluorescensmikroskop før og efter rekonstitution (figur 4D,E). l-Opa1 rekonstitueret i lipid tolag blev valideret af fluorescens korrelation spektroskopi (FCS). Vi bruger farvestof konjugerede lipider til at vurdere lipid diffusivity af tolags. Rekonstitueret Opa1 blev mærket ved hjælp af et fluorescerende-mærket anti-Opa1 C-terminal antistof. Tolags lipid diffusion blev målt som 1,46 ± 0,12 μm2/s, mens diffusionskoefficienten for tolagsrekonstitueret l-Opa1 var 0,88 ± 0,10 μm2/s. Intensitetsudlæsning fra FCS-kurverne indikerede, at 75 % af l-Opa1 rekonstitueres i lipidtayeren (figur 4G,H). Disse resultater tyder på, at l-Opa1 frit diffunderer i polymer-tøjret lipid tolag med potentiale til selv at samle sig i funktionelle komplekser.
Figur 4: Fordeling af lipid og rekonstitueret protein i modelmembranen.
(A-C) Eksempel billeder af en lipid tolags og dens lipid fluiditet valideret af epifluorescens mikroskopi. a) Homogen lipidfordeling i tolags inden fotobleaching. (B)Snapshot umiddelbart efter fotobleaching. (C) Bilayer afbildet efter fluorescens opsving indikerer god lipid fluiditet af membranen efter rekonstitution. (D,E) Repræsentative billeder af lipidfordeling før (D), og efter(E)l-Opa1 rekonstitution indikerer rekonstitutionsprocessen ikke skaber fejl i tolag. Repræsentativt TIRF-billede af l-Opa1 mærket med Alexa 488 konjugeret antistof (F) viser en homogen fordeling af Opa1 ved rekonstitution. G. Repræsentativ rå foton tæller l-Opa1 signal ved fluorescerende korrelation spektroskopi. I kontrolelementet blev ingen l-Opa1 rekonstitueret i tolagsen, mens antistof blev tilsat og skyllet. Udbredelsen af l-Opa1 er betydeligt langsommere end lipider i membranen, i overensstemmelse med en vellykket rekonstituering af transmembrane l-Opa1 (H). Skalabar: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fluorescenstrinblegning indikerede, at et gennemsnit på 2-3 kopier af l-Opa1 blev rekonstitueret i et givet liposo (Figur 5A, B). Størrelsesfordelingen af Opa1 rekonstituerede proteoliposomer blev testet efter rekonstitution ved hjælp af DLS (Figur 5C). Rekonstitueringen af Opa1 i proteoliposomer blev også verificeret ved hjælp af FCS. Diffusionskoefficienten for frit antistof var 164 ± 22 μm2/s; diffusionskoefficient for liposomer mærket med et lipidfarvestof var 2,22 ± 0,33 μm2/s, og diffusionskoefficienten for l-Opa1 proteoliposomer bundet til en TexasRed mærket anti-Hans antistof var 2,12 ± 0,36 μm2/s.
Figur 5: Fremstilling og karakterisering af proteoliposomer.
(A)Trin i fremstilling proteoliposomer med indkapslet, slukket calcein. (B)Repræsentative data for fluorescerende trin-blegning viser et gennemsnit på 2-3 kopier af l-Opa1 indlejret i liposomet. cC) Repræsentativ størrelsesfordeling af proteoliposomer (rød) uden nukleotid 1 time efter GTP-inkubation (grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.
Påvisning af membran tethering, lipid demixing / hemifusion, og pore åbning ved fluorescerende mikroskopi.
Membran tøjring overvåges ved at observere signalet fra TexasRed på overfladen af lipid tolags ved hjælp af TIRF mikroskopi (Figur 6A). Membran lipid demixing (hemifusion) adfærd blev overvåget gennem TexasRed som farvestoffet diffunderer fra liposomer i lipid tolag. Calcein afkæmpning hjælper med at skelne fuld fusion pore dannelse fra kun lipid demixing. Dette gør det muligt at sammenligne forhold, hvor partikler går i stå ved hemifusion (fig. 6B), og partikler, der går videre til fuld fusion (Figur 6C).
Membran tethering er angivet med en stabil lipid signal fra liposomer. Afstanden kan evalueres på grundlag af FRET-signalet mellem etiketterne på de to membraner36. Hemifusion signal har ingen dequenching i calcein signal(Figur 6B,nederste række), men en hurtig henfald af TexasRed signal indikerer diffusion af farvestoffet i lipid tolag (Figur 6B øverste række). Fuld fusion (med pore åbning) funktioner både lipid henfald og indhold frigivelse (Figur 6C). TexasRed intensitet og calcein intensitet kan spores i en tidsafhængig måde at give kvantitative detaljer for kinetik af membran fusion36.
Figur 6: Repræsentative resultater, der viser partikelstangning (A, skalabar 10 μm), hemifusion (B, skalabar 0,5 μm) og fusion (C, skalabar 0,5 μm).
(A) Proteoliposomes bundet til Opa1-rekonstitueret lipid tolags før GTP tilsætning. (B) Et eksempel på hemifusion. Den øverste række i B viser lipid demixing (TexasRed signal, rød), nederste række i B viser ingen indhold frigivelse (calcein signal, grøn) under disse betingelser. cC) Et repræsentativt spor af proteoliposom fusing med lipid tolag. Indholdsudgivelse kan observeres fra billeder i den nederste række for at vise afkædning af calcein (nederste række, grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
In vitro modelmembransystemer kan beskrive komplekse membranprocesser under veldefinerede forhold. Disse systemer kan skelne mellem minimale komponenter , der er nødvendige for komplekse molekylære processertil at afsløre molekylære mekanismer6,15,20,38. For membran proteiner, liposomer og planar understøttet tolags er fælles rekonstitutionssystemer. I modsætning til solid-støttede lipid tolags, polymer pude mellem substrat og understøttet membran i polymer-tøjrede tolagser giver fri mobilitet af store membran proteiner, og transmembran-proteiner til diffuse og samle frit34. Disse funktioner hjalp os med at undersøge kinetik af mitokondrier indre membran fusion36.
Vi har udarbejdet en polymer-tøjret lipid toayer ved hjælp af Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB / LS) teknikker. Dette giver os mulighed for at forberede en tolags med asymmetriske lipid komponenter. Cellulære membraner har asymmetrisk folder sammensætning, og LB / LS tilgang giver mulighed for undersøgelse af sådanne tolagser. Med Schaefer overførsel, kan et helt glas substrat være dækket af en lipid tolags. Det er afgørende at forberede en ren overflade til tolags forberedelse. Derudover kræver det øvelse at udføre en Schaefer-overførsel korrekt. Mislykket Schaefer overførsel kan skabe uønskede fejl i en lipid tolags. I denne protokol gælder det tryk, der føjes til filmbalancen, for en tolags, der indeholder 20% kardiolipin. For tolagsapparater med andre komponenter henvises til overfladetrykområdets isotherm for nøglekomponenterne. En alternativ metode er Langmuir-Blodgett/ vesicle fusion (LB / VF) metode, hvor den nederste lipid monolag overføres fra luft-vand interface af en Langmuir trug på et rent substrat, derefter liposomer sikring til toppen af den understøttede lipid monolayer og danne den endelige tolags39. Rekonstituering af membranproteiner ved hjælp af LB/VF-metoden er mere ligetil end LB/LS, da rekonstitution kan udføres gennem fusion af proteoliposomer. Men vesicle fusion kræver tilsætning af overskydende liposomer, som kan komplicere studiet af membran begivenheder afhængig af koncentration-afhængige protein-protein interaktioner.
En vellykket rekonstituering af transmembrane proteiner i både polymer-tøjret lipid tolags og liposomer i en foretrukken funktionel orientering er vigtig, men vanskelig at håndhæve. Der er behov for eksperimentelle kontroller for at tage højde for dette. For polymer-tøjret lipid tolags, er det også vigtigt at opretholde integriteten af lipid tolags under rekonstitution. Belægningskoncentrationer skal holdes relativt lave for at forhindre opløsning af lipidtlagen, men høj nok til at forhindre denaturering af protein af interesse37,40. Den metode, der er beskrevet her, er ideel til rekonstituering af membranproteiner til enkeltmolekyleundersøgelser, men er ikke nødvendigvis skalerbar til større undersøgelser. Overfladeaktivt valg er en anden vigtig overvejelse. Ofte er det overfladeaktive stof, der anvendes til rensning og opbevaring, et godt udgangspunkt. Den maksimale koncentration af overfladeaktivt stof er normalt ~ 200 gange mindre af CMC36, i en række, hvor det overfladeaktive stof opretholder protein stabilitet og forhindrer protein aggregering, samtidig med at integriteten afmembran 36. Cocktails, der indeholder 2 eller 3 overfladeaktive stoffer, kan komme i betragtning. For rekonstituering i liposomer er en lav koncentration af overfladeaktivt stof ikke nødvendig. Koncentrationer af overfladeaktive stoffer under CMC er dog at foretrække for at opretholde en ensartet størrelse og morfologifordeling for liposomerne. For at forhindre lækage af farvestof er det nødvendigt at dialyze mod en farvestofholdig buffer.
I modsætning til liposom-baserede fusionsanalyser giver den platform, vi etablerede, en tilgang til at undersøge kinetik i hvert trin af membranfusion. Denne metode giver mulighed for at studere transmembrane fusionsproteiner under næroprindelige forhold. Model membran platforme kan anvendes til at studere membran protein samling og oligomerisering, membran "sculpting", og protein-lipid interaktioner af proteiner i subcellulære miljøer, ligesom mitokondrielle indre membran. Denne metode giver også mulighed for udforskning af vigtige fysiologiske forhold i membran-protein samspil, såsom tolags sammensætning asymmetri. Rollen som en vigtig mitokondriellipid, kardiolipin, i tolagsegenskaberne for både liposomer og polymerstøttede tolagser er endnu ikke defineret. Egenskaber såsom ioniske styrke, membrantykkelse, membranstivhed, membrankrumning og membranelastik-viskositetsegenskaber kan alle påvirke proteiners evne til at samle sig i specifikke funktionelle tilstande. Fremtidige undersøgelser kreativt anvende model membran systemer har potentiale til at afdække nye aspekter af membran protein organisation og funktion.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender støtte fra Charles H. Hood Foundation Child Health Research Award og generøs støtte fra Institut for Molekylær Biologi på Massachusetts General Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
| 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
| Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
| Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
| Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
| Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
| Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
| FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
| Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
| GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
| Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
| L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
| Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
| n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
| PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
| Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
| Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
| Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
| Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |
References
- Sackmann, E. Biological membranes architecture and function. Structure and Dynamics of Membranes. Lipowsky, R., Sackmann, E. 1, Elsiever. 1-63 (1995).
- Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118, Pt 6 1099-1102 (2005).
- Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).
- Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations. Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).
- Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
- Chan, Y. H., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Biswas, K. H., Groves, J. T. Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies. Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).
- Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications. Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).
- Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).
- Kiessling, V., et al. Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes. Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).
- Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion. Nature Communication. 7, 11401 (2016).
- Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophysical Journal. 101 (8), 37 (2011).
- Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion. Elife. 3, 04389 (2014).
- Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
- Sezgin, E., Schwille, P. Model membrane platforms to study protein-membrane interactions. Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).
- Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures. Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).
- Dutta, D., Kam, L. C. Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems. Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).
- Groves, J. Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. , Springer. Boston, MA. (2006).
- Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).
- Wang, N., Rapoport, T. A. Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions. Journal of Cell Science. 132 (4), 227611 (2019).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
- Chan, D. C. Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health. Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Wai, T., Langer, T. Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation. Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).
- Chen, H., et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).
- Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1. EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).
- Anand, R., et al. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).
- Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation. Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).
- Baker, M. J., et al. Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics. EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).
- DeVay, R. M., et al. Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion. Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).
- Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress. Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).
- Ban, T., et al. Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).
- Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
- Shilts, K., Naumann, C. A. Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates. Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).
- Ge, Y., et al. Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane. Elife. 9, 50973 (2020).
- Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).
- Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level. Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).
- Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).
