Summary
Mitokondriell fusion är en viktig homeostatisk reaktion underliggande mitokondriell dynamik. Beskrivs här är en in vitro reconstitution system för att studera mitokondriellt inre-membran fusion som kan lösa membran tjudra, dockning, hemifusion och poröppning. Mångsidigheten hos detta tillvägagångssätt i utforska cellmembran system diskuteras.
Abstract
Mitokondriell dynamik är avgörande för organellens olika funktioner och cellulära svar. Det trånga, rumsligt komplexa, mitokondriella membranet är en utmanande miljö för att skilja regleringsfaktorer. Experimentell kontroll av protein och lipidkomponenter kan hjälpa till att svara på specifika frågor om reglering. Ändå är kvantitativ manipulation av dessa faktorer utmanande i cellulära analyser. För att undersöka den molekylära mekanismen för mitokondrier inre-membran fusion, introducerade vi en in vitro reconstitution plattform som härmar lipid miljön av mitokondriellt inre-membran. Här beskriver vi detaljerade steg för att förbereda lipid bilayers och rekonstituering mitokondriellt membran proteiner. Plattformen tillät analys av intermediärer i mitokondriellt inre membran fusion, och kinetiken för enskilda övergångar, på ett kvantitativt sätt. Detta protokoll beskriver fabricering av bilayers med asymmetrisk lipid sammansättning och beskriver allmänna överväganden för rekonstituering transmembrane proteiner i en dämpad bilayer. Metoden kan tillämpas för att studera andra membransystem.
Introduction
Membranfackinföring är ett kännetecken för eukaryotaceller 1 (Bild 1A). Biologiska membran är alltmer erkända som mer än en tvådimensionell lösningsmedel, och betraktas som en miljö spelar kritiska roller i regleringen av proteinfunktion och makromolekylära komplexa församling2,3. Inhemska lipider är ligander som reglerar membranproteinaktivitet3,4. Membran rumslig organisation och förmåga membran som ska skulpteras i olika former är viktiga fysiska egenskaper för att välja nya funktioner3,5.
Modell membran plattformar är biomimetiska system som kan hjälpa oss att förstå cellulära membran struktur, dynamik, ochfunktion 6,7,8. Modellmembran omfattar vanligtvis en lipidblandning av väldefinierad sammansättning, med definierade biofysiska egenskaper (styvhet, tjocklek och elasticitet). Kopplade till fluorescens avbildning, modell membran plattformar möjliggör kvantitativ analys av membranstrukturoch funktion 9,10,11. Lipid bilayer reconstitution strategier har använts för att studera SNARE-medierad membran fusion9,10, DNA-medierad membran fusion12, och viral fusion11,13. En fördel med sådana metoder är potentialen att få kinetisk information för mellansteg som föregår en observerbar reaktionshändelse14.
Plasmamembranet har studerats ingående med hjälp av modellmembran. Bilayers med lipid fas separation har utvecklats för att studera lipid flottor strukturer viktigt i cellulär signalering11,15,16. Micropatterned lipid planar bilayers17,18 har använts för att undersöka organisationen av cellreceptorer. Polymer eller gel-stödda membran har använts som biomimetiska system för att studera membran-cytoskelett organisationen, membran protein partitionering under cellsignalering, och migration vid cell-cell kontakter19.
Artificiella membransystem tillämpas också för att studera subcellulära organeller20. Organeller har karakteristiska morfologier som skapar distinkta sub-miljöer. Nätverket endoplasmatiskt nät för nät för nät (ER) är ett exempel. Vid rekonstitution av retikuloner till liposomer bildas rörformiga membranstrukturer med egenskaper som liknar den cellulära ER21. Tillsats av atlastin, ett ER fusion protein, kan inducera lipid tubuli från liposomer att bilda ett nätverk20. Detta är ett exempel på hur proteoliposomer kan ge funktionell insikt i organellemorfologi och dynamik.
Mitokondriellt membran fusion och fission är avgörande för hälsan hos den mitokondriella befolkningen22,23,24,25. En uppsättning dynamin familj GTPases katalyserar mitokondrierna membran fusion. Mfn 1/2 katalyserar yttre membran fusion. Opa1 förmedlar inre-membranfusion26 (Bild 1B). Opa1 har två former: en lång form (l-Opa1), transmembran-förankrad i mitokondriellt inre-membran, och en 'löslig' kortform (s-Opa1), som finns i intermembrane utrymmet. Förhållandet mellan de två Opa1-formerna regleras av aktiviteten hos två proteaser, Oma1 och Yme1L27,28,29,30. Viktiga frågor i Opa1-förordningen är: hur de två formerna av Opa1, (kort och lång) medla membran fusion och deras reglerande samspel28,29,31,32,33.
Här beskriver vi en reconstitution strategi framgångsrikt tillämpas för att undersöka mitokondriellt inre-membran fusion som klargjorde rollerna för l- och s-Opa1 i inre-membran fusion. Vi utvecklade en plattform härma mitokondriellt inre-membran med hjälp av en polymer-bundna lipid bilayer och 200 nm unilamellar vesiklar. Fördelarna med en polymer tjuder under lipid bilayer inkluderar följande. Först bevarar det det rekonstituerade transmembranproteinet, som annars skulle kunna störas av närheten till glasglaset34. För det andra, det tjänar ett tjockt vattenskikt mellan lipid bilayer och glas substrat, som underlättar studier av poröppning9, och för det tredje den viskoelastiska karaktär PEG polymer tillåter membran krökning förändringar35. Vi använde tre-färg fluorescens avbildning för att karakterisera steg i membran fusion (Figur 1C-F).
Bild 1: Övervakning av mitokondriell membranfusion.
(A) Organeller är cellulära membranfack. (B) Sekventiella steg av mitokondriell membran fusion. Fusion av det yttre membranet i mitokondrier katalysas av Mfn1 och/eller Mfn2, medan innermembranfusion förmedlas av Opa1. (C-F) Schematisk av in vitro reconstitution plattformen för att studera mitokondriellt membran fusion. Plattformen innehåller två delar: en proteoliposom och en polymer-bundna lipidbilayer, båda med rekonstituerad l-Opa1. Fluorescerande etiketter, inklusive två olika fluorescerande membranfärgämnen och en innehållsmarkör, hjälper till att skilja steg under membranfusion. De två membranmarkörerna (Cy5-PE (röd) och TexasRed PE (orange) gör ett FRET-par, som kan rapportera om stängningsmembran dockning. Diffusion av TexasRed-PE att etiketter proteoliposome är en indikator på lipid demixing (hemifusion). Innehållsutgåvan övervakas genom att calceinsignalen (visas i grönt) avskrider. Panel A och B som skapats med hjälp av Biorender. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Protocol
1. Beredning av lipidblandningar
- Bered en lipidstamlösning genom att lösa upp 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3fosfocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanamin (POPE), L-α-fosfatidylinositol (Liver PI), kardiolimet, och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanola-N-[metoxi(polyetylenglykol)-2000] (18:1 PEG2000 PE) till kloroform vid koncentrationen av 25 mg/mL. Lös fluorescerande färgämne-konjugerad lipid (TexasRed DHPE och Cy5 DOPE) kloroform vid en koncentration av 1 mg/mL. Förvara lipidlösningen i bärnstensfärgade injektionsflaska med kloroformresistent liner, vidare förseglad med polytetrafluoretylentejp. Lösningen kan hållas vid -20 °C i upp till 6 månader.
- Gör lösningar A och B.
- Blanda lipid för att bereda lösning A (slutkoncentration 1 mg/mL) som innehåller DOPC (52,8 mol%), POPE (20 mol%), Lever PI (7 mol%) och kardiolimet (20 mol%), och 0,2 mol% fluorofore.
- Gör lösning B (slutkoncentration 1 mg/mL) innehållande DOPC (47,8 mol%), POPE (20 mol%), lever PI (7 mol%), kardiolilipin (20 mol%) och DOPE-PEG2000 (5 mol%), och 0,2 mol% fluorophore.
- Generera lipidblandningen genom att tillsätta den beräknade lagringslösningens volym i bärnstensfärgade injektionsflaskor med hjälp av en glasspruta. Matcha den slutliga volymen genom att tillsätta extra kloroform i injektionsflaskan.
OBS: För FCS (fluorescens korrelation spektroskopi), minska förhållandet mellan färgämne konjugerad lipid till 0,002 mol% och ersätta resten med DOPC.
2. Tillverkning av lipidbilayers
- Baka mikroskop täcka glas diabilder vid 520 °C i 30 min. Efter gräddningen, kyl ner täckglasen till rumstemperatur.
- Väg in ca 10 g natriumhydroxid och tillsätt till 500 mL metanol under omrörning. Rör om i 2 h, fortsätt att tillsätta natriumhydroxid i lösningen tills fällningar börjar visa. Se till att bära lämplig personlig skyddsutrustning under hela processen.
- Rengör glasglasen i 10% natrium dodecyl sulfat lösning; metanol mättad med natriumhydroxid; och 50 mM saltsyra, sekventiellt (bad ultraljudsbehandling under varje villkor för 30 min). Rengör glasglaset i ultrarent vatten i 10 min mellan varje villkor.
OBS: Även om rekommenderas starkt att använda färska lösningar för glas diabildsberedning, kan varje lösning återanvändas upp till 5x eller inom 1 månad, vilket som inträffar först. Se till att röra-blanda lösningen före varje användning. - Förvara det rengjorda täckglaset som förseglats i HCl-lösning upp till 2 veckor för att säkerställa god bilayerkvalitet. Om den förvaras i ultrarent vatten, använd rutschbanorna inom en vecka.
- Rengör polytetrafluoretentråget i dippsystemet Langmuir-Blodgett med hjälp av kloroform och ultrapure vatten tills ingen vätning observerats på tråget. Spraya kloroform på trågytan, torka av noggrant med cellulosaservetter 3x. Skölj med ultrarent vatten och ta bort vattnet via avsugning. Upprepa 3x.
- Täck ytan av tråg med rent ultrarent vatten.
- Ta 2 stycken ytbehandlat täckglas från rengöringslösning eller ultrarent vatten, och skölj glasglaset med ultrarent vatten för approximerat 30 s.
- Placera täckglaset på ett back-to-back-sätt. Använd underlaget klämma för att hålla glaset diabilder. Doppa ner glasglaset under vattenytan genom att manuellt klicka "dipper down" på Langmuir-styrprogramvaran.
- Nolla filmbalansen, försiktigt sprida Lösning B droppe för droppe vid luft-vattengränssnittet (Bild 2A). Se till att lipider bara sprider sig vid luft-vatten-gränssnittet, utan kloroform och lipiddroppar sjunker till botten av polytetrafluoreten yta. Underlåtenhet att säkerställa detta kommer att skapa en lipid "kanal" och förhindra monolayer bildas.
- Sluta lägga till lipider till filmbalans avläsning runt ~ 15-20 mN/ m, vänta på ~ 10-15 min. Initiera barriärstyrenheten för att ändra ytan genom att klicka på "starta experiment", tills filmbalansavläsning till 37 mN/m. Håll trycket i ~20-30 min (Bild 2B).
- Höj täckglaset med hastigheten 22 mm/min samtidigt som ytspänningen bibehålls vid 37 mN/m. En lipidmonolager med polymertjuder kommer att överföras från luft-vattengränssnittet till ytan av täckglas genom Blodgett doppningsprocessen (Figur 2C). Detta bildar botten bilayers undersida.
- Rengör luft-vattengränssnittet genom att suga, skölj tråget med ultrarent vatten.
- Rengör en glasrutschbana med brunn (t.ex. Shaefer-rutschkana) med hjälp av kloroform, etanol och ultrarent vatten före användning. Ställ in den rena glasrutschbanan på tråget med ultrarent vatten under vattenlagret. Se till att brunnen är vänd uppåt mot luft-vattengränssnittet och häll färskt ultrarent vatten tills glasglaset är helt täckt. Upprepa steg 2.8.
- Håll täckglaset med lipidmonolager från steg 2.4 med hjälp av en silikonsugkopp (se till att monoskiktsidan är borta från sugkoppen), tryck försiktigt lipidmonolager till luft-vattengränssnittet, håll täckglaset i ~2-3 s vid gränssnittet och tryck sedan täckglaset mot rutschkanan (Figur 2D). Ta ut glidningen med en omslagsglid.
OBS: Lipid bilayer kommer att hållas på ytan av täckglaset mot det inklämda området mellan de två objektglasen (Bild 2E). - Ta täckglaset med biskiktet till ett epifluorescensmikroskop. Bild lipid bilayer. Om en homogen fördelning av lipidfärgämne observeras, fotobleach ett litet område av bilayer för 30 s, stänga av ljuskällan för ~ 30 s-1 min., sedan bilden igen för att observera återhämtning. Lipid bilayer kommer att visa fluorescens återhämtning.
OBS: Membran med defekter eller dålig fluorescensåterhämtning ska inte användas för ytterligare experiment.
Bild 2: Steg i att göra en polymer-bundna lipid bilayer.
Steg för att göra lipid bilayers med langmuir-Blodgett doppning (A-C) och Langmuir-Schaefer överföring (D) tekniker. (E) Den slutliga "smörgås" som innehåller lipid bilayer. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
3. Proteinrekonstitution i polymer-bundna lipidbilayer
- Förbered en kristallisationsrätt som innehåller ultrarent vatten. Förbered en ren mikroskop bildring och placera under skålen.
- Sänk ner "smörgåsen" på Schaefer-rutschkanan och täckglaset som innehåller lipidbilayer under vattnet, separera schaefer-rutschkanan och täckglaset försiktigt, håll täckglaset från botten, bort från bilayersidan, överför täckglaset till bildringen, stäng bildringen.
OBS: Se till att täckglaset med lipidbilayer alltid är i vatten, och ringen är väl förseglad. - Byt ut det ultrarena vattnet i bildringen mot Bis-Tris NaCl-buffert, se till att lipidbilayern inte utsätts för några luftbubblor. Tillsätt 1,1 x 10-9 M n-Octyl-β-D-Glucopyranoside till lipidbilayer. Lägg omedelbart blandningen av 1,2 x 10-9 M av DDM och 1,3 x 10-12 mol renad l-Opa136 i bildringen. Inkubera prov på en bänkskiva shaker vid låg hastighet i 2 h (Figur 3).
OBS: Tvättmedel kan variera beroende på protein som ska rekonstituerade. - Fördela 30 mg SM-2 Hartspärlor i 3 mL av Bis-Tris buffert och skaka innan du applicerar. Använd en plastpipett för att lägga till 5 ~ 10 μL av SM-2 Harts pärlor till bildringen, inkubera i 10 min, ta bort harts pärlor genom sköljning. Buffertens slutliga volym i bildringen är 1,5 mL.
Bild 3: Förfarande för rekonstituering av l-Opa1 till en polymer-bundna lipidbilayer. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
4. Beredning av proteoliposomer
- Förbered 1 mg lipidblandning A i kloroformlösning. Avdunsta kloroform under kväveflöde i 20 min och förvara under vakuum över natten och bilda en lipidfilm.
- Förbered 50 mM kalcein som innehåller buffert genom att lösa upp 15,56 g kalcein till 50 mL 1,5 mol NaOH-lösning, rör om i rumstemperatur tills kalcein är helt upplöst, tillsätts 12,5 mM Bis-Tris och ultrarent vatten till den slutliga volymen av 500 mL. Justera pH-värdet till 7,5.
- Suspend lipidfilm i kalcein som innehåller buffert, helt hydrat lipiden genom att upphetta suspensionen vid 65 °C i 20 min. 200 nm liposomer bildas genom extrudering med hjälp av ett polykarbonatmembran.
- Tillsätt 2 μg l-Opa1 i 0,5 μM DDM till 0,2 mg liposom och inkubera vid 4 °C i 1,5 h. Ta bort ytaktiva med dialys med hjälp av en 3,5 kDa dialyskassett mot 250 ml 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl och 50 mM-kalceinbuffert vid 4 °C över natten, ändra bufferten två gånger.
- Ta bort extra kalcein med hjälp av en PD-10 desalting kolumn.
5. Bilddiagnostik och dataanalys
- Förvärva TIRF bilder med hjälp av en 100x olja-nedsänkning mål (N.A 1.4). Använd 543 nm laser och en 488 nm laser för analys av TexasRed-PE märkta liposomer och proteoliposomer inkapslade med calcein. Använd en 633 nm laser för analys av Cy5-PE inbäddad i planarlipid bilayer.
- Rikta IN TIRF-vinkeln med hjälp av en lipidbilayer för att erhålla maximal emission. Kvaliteten på lipidbilayer efter rekonstituering observeras med hjälp av ett 100x oljemål vid 25 °C. Diffusionkoefficienten för fosfolipid och rekonstituerad bilayer bestäms med hjälp av FCS med ett protokoll som beskrivs på annanplats 37.
- Tillsätt 10 μL av 2 mg/mL proteoliposomer till bildringen och ställ in i 10 minuter före bilden. GTP, GMPPCP, eller BNP läggs till i reaktionsringen med 1 mM MgCl2 och 1 mM av nukleotid.
- För att bestämma påverkan av s-Opa1 vid membranfusion, titrera s-Opa1 till ett proteoliposom/stödda bilayerprov som innehåller l-Opa1, och registrera fusionshändelser.
- Samtidig bildbehandling av TexasRed-DHPE och calcein uppnås genom en beam-splitting system. Både 488 nm och 543 nm lasrar samtidigt appliceras på provet som flourescent excitation källor. Det utsläppsljuset delas sedan med hjälp av en 560 nm-balksklyser. Det delade utsläppsljuset filtreras då av ett 510 nm-filter med en bandbredd på 42 nm och ett 609 nm-filter med en bandbredd på 40 nm. Den filtrerade strålen projiceras till två angränsande områden på kamerachip.
- Lysrörsutsläpp registreras samtidigt genom ett 609-emissionsfilter med en bandbredd på 40 nm, och ett 698-emissionsfilter med en bandbredd på 70 nm. Mikroskopsystemet är utrustat med en CMOS-kamera som underhålls vid -10 °C.
- Partikelidentifiering av liposomerna kan utföras med hjälp av en Gaussisk-baserad partikeligenkänningsalgoritm. Partikelfördelningen och intensiteten analyseras kanal för kanal. En lipid bilayer signal används som en mask för att isolera partiklar.
Representative Results
Det rekonstituerade transmembrane proteinet sprider fritt och är homogeneously fördelat i membranet.
Exempel på bilder av en lipidbilayer och dess lipidvätlighet som validerats genom epifluorescensmikroskopi visas i figur 4. Lipidfördelning i bilager före och efter fotoblekning visas i figur 4A,B. Homogenitet av lipid bilayer visualiserades med hjälp av ett epifluorescens mikroskop före och efter rekonstituering (Figur 4D,E). l-Opa1 rekonstituerade i lipid bilayer validerades genom fluorescence korrelation spektroskopi (FCS). Vi använder färgämne konjugerade lipider för att utvärdera lipid diffusitet bilayer. Rekonstituted Opa1 var märkt med hjälp av en fluorescerande-taggade anti-Opa1 C-terminal antikropp. Bilayer lipid diffusion mättes som 1,46 ± 0,12 μm2/s, medan diffusion koefficienten för bilayer-rekonstituerade l-Opa1 var 0,88 ± 0,10 μm2/s. Intensitetsavläsning från FCS-kurvorna indikerade 75% av l-Opa1 rekonstituerade i lipidbilayer (Figur 4G,H). Dessa resultat tyder på att l-Opa1 sprider fritt i polymer-bundna lipid bilayer med potential att själv montera in funktionella komplex.
Figur 4: Fördelning av lipid och rekonstituerat protein i modellmembranet.
(A-C) Exempel bilder av en lipid bilayer och dess lipid fluiditet valideras av epifluorescens mikroskopi. (A) Homogen lipidfördelning i bilager före fotoblekning. (B) Ögonblicksbild omedelbart efter fotoblekning. (C) Bilayer avbildas efter fluorescens återhämtning indikerar god lipid fluiditet av membranet efter rekonstituering. (D,E) Representativa bilder av lipidfördelning före (D), och efter (E) l-Opa1 rekonstituering indikerar reconstitution processen inte skapa defekter i bilayer. Representativ TIRF bild av l-Opa1 märkt med Alexa 488 konjugerad antikropp (F) visar en homogen fördelning av Opa1 vid rekonstitution. G. Representativa råa fotonantal av l-Opa1-signal genom fluorescerande korrelationsspektroskopi. I kontrollen var ingen l-Opa1 rekonstitueras i bilayer, medan antikroppar tillsattes och sköljdes. Diffusionen av l-Opa1 är betydligt långsammare än lipider i membranet, överensstämmande med framgångsrik rekonstitution av transmembrane l-Opa1 (H). Skala bar: 10 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Fluorescens steg blekning anges i genomsnitt 2-3 kopior av l-Opa1 var rekonstituerade i en viss liposom (Figur 5A,B). Storleksfördelningen för Opa1 rekonstituerade proteoliposomer testades efter rekonstituering med hjälp av DLS (Figur 5C). Rekonstitutionen av Opa1 i proteoliposomer kontrollerades också med hjälp av FCS. Diffusionskoefficienten för fri antikropp var 164 ± 22 μm2/s; diffusionskoefficient för liposomer som var märkta med ett lipidfärg var 2,22 ± 0,33 μm2/s, och diffusionskoefficienten för l-Opa1 proteoliposomer bundna till en TexasRed märkt anti-Hans antikropp var 2,12 ± 0,36 μm2/s.
Bild 5: Fabricering och karakterisering av proteoliposomer.
(A) Steg i fabricerande proteoliposomer med inkapslade, släckta kalcein. (B) Representativa data för fluorescerande stegblekning visar i genomsnitt 2-3 kopior av l-Opa1 inbäddade i liposomen. (C) Representativa storleksfördelningar av proteoliposomer (röd) utan någon nukleotid 1 h efter GTP-inkubation (grön). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Påvisande av membrantjuder, lipiddemixning/hemifusion, och poröppning genom fluorescerande mikroskopi.
Membran tjudra övervakas genom att observera signalen av TexasRed på ytan av lipid bilayer med hjälp av TIRF mikroskopi (Figur 6A). Membran lipid demixing (hemifusion) beteende övervakades genom TexasRed som färgämnet diffuser från liposomerna i lipid bilayer. Calcein dequenching hjälper skilja full fusion porbildning från endast lipid demixing. Detta möjliggör jämförelse mellan förhållanden där partiklar stall vid hemifusion (Fig 6B), och partiklar som fortsätter till full fusion (Figur 6C).
Membrantjuder indikeras av en stabil lipidsignal från liposomer. Avståndet kunde utvärderas utifrån FRET-signalen mellan etiketterna på de två membranen36. Hemifusion signalen har ingen dequenching i calcein signal (Figur 6B, nedre raden), men en snabb sönderfall av TexasRed signalen indikerar diffusion av färgämnet i lipid bilayer (Figur 6B övre raden). Full fusion (med poröppning) har både lipidförfall och innehållsutgåva (Figur 6C). TexasRed intensitet och kalcein intensitet kan spåras på ett tidsberoende sätt att ge kvantitativa detaljer för kinetiken i membran fusion36.
Figur 6: Representativa resultat som visar partikeltjudning (A, skala bar 10 μm), hemifusion (B, skala bar 0,5 μm), och fusion (C, skala bar 0,5 μm).
(A) Proteoliposomes bundna till Opa1-rekonstituerad lipid bilayer före GTP tillägg. (B) Ett exempel på hemifusion. Den övre raden i B visar lipiddemixning (TexasRed signal, röd), nedre raden i B visar ingen innehållsutgåva (calcein signal, grön) under dessa förhållanden. (C) Ett representativt spår av proteoliposom sammanfuser med lipidbilayern. Innehållsutgåvan kan observeras från bilder i den nedre raden av att visa avsläckning av calcein (nedre raden, grön). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Discussion
In vitro-modell-membransystem kan beskriva komplexa membranprocesser under väldefinierade förhållanden. Dessa system kan skilja minimala komponenter som är nödvändiga för komplexa molekylära processer för att avslöjamolekylära mekanismer 6,15,20,38. För membranproteiner är liposomer och planarstödda bilayers vanliga rekonstitueringssystem. I motsats till solid-stödda lipidbilayers, polymeren kudden mellan substratet och stöds membran i polymer-bundna bilayers tillåter fri rörlighet av stora membranproteiner, och transmembran-proteiner att diffusa och montera fritt34. Dessa funktioner hjälpte oss att undersöka kinetik mitokondrierna inre membran fusion36.
Vi förberedde en polymer-bundna lipid bilayer med Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB / LS) tekniker. Detta gör det möjligt för oss att förbereda en bilayer med asymmetriska lipidkomponenter. Cellulära membran har asymmetrisk bibroschyr sammansättning, och LB / LS-metoden tillåter studier av sådana bilayers. Med Schaefer överföring kan ett helt glas substrat täckas av en lipid bilayer. Det är avgörande att förbereda en ren yta för bilayer förberedelse. Dessutom krävs det övning för att utföra en Schaefer-överföring korrekt. Misslyckad Schaefer överföring kan skapa oönskade defekter i en lipid bilayer. I detta protokoll är trycket som läggs till filmbalansen tillämpligt för ett bilager som innehåller 20 % kardilipin. För bilager med andra komponenter, se de centrala komponenternas yttryck-areaisoterm. En alternativ metod är Langmuir-Blodgett/vesicle fusion (LB/VF) metod, där botten lipid monolayer överförs från luft-vatten gränssnittet för en Langmuir tråg på ett rent substrat, sedan liposomer säkring till toppen av den stödda lipid monolayer och bildar den slutliga bilayer39. Rekonstitution av membranproteiner med LB/VF-metoden är mer okomplicerad än LB/LS, eftersom rekonstitution kan utföras genom fusion av proteoliposomer. Vesikelfusion kräver dock tillsats av överskott av liposomer, vilket kan komplicera studien av membranhändelser beroende av koncentrationsberoende protein-protein interaktioner.
Den framgångsrika rekonstituering av transmembrane proteiner i både polymer-bundna lipid bilayers och liposomer i en föredragen funktionell orientering är viktigt, men svåra att genomdriva. Det behövs experimentella kontroller för att ta hänsyn till detta. För polymer-bundna lipid bilayers, är det också viktigt att upprätthålla integriteten hos lipid bilayer under rekonstituering. Tensidkoncentrationer måste hållas relativt låga för att förhindra upplösning av lipidbilayer, men tillräckligt hög för att förhindra denaturering av det protein av intresse37,40. Den metod som beskrivs här är idealisk för rekonstituering av membranproteiner för enmolekylstudier men är inte nödvändigtvis skalbar för större studier. Ytaktiva val är en annan viktig faktor. Ofta är det ytaktivasmedel som används för rening och lagring en bra utgångspunkt. Den maximala koncentrationen av ytaktivt är vanligtvis ~200 gånger mindre av CMC36, i ett intervall där ytaktiva ämnen upprätthåller proteinstabilitet och förhindrar proteinaggregering, samtidigt som integriteten hosmembran 36. Cocktails som innehåller 2 eller 3 ytaktiva ämnen kan övervägas. För reconstitution till liposomer är en låg koncentration av ytaktivt medel inte nödvändigt. Däremot är halter av surfaktant under CMC att föredra för att bibehålla enhetlig storlek och morfologifördelning för liposomerna. För att förhindra läckage av innehåll färgämne, är det nödvändigt att dialyze mot en färgämnehaltig buffert.
I motsats till liposombaserad fusionsanalys ger plattformen som vi etablerat ett tillvägagångssätt för att undersöka kinetiken i varje steg i membranfusion. Denna metod ger möjlighet att studera transmembrane fusion proteiner under nära-infödda förhållanden. Modell membran plattformar kan tillämpas för att studera membran protein montering och oligomerization, membran "skulptera", och protein-lipid interaktioner av proteiner i subcellulära miljöer, som den mitokondriella inre-membran. Denna metod möjliggör också utforskning av viktiga fysiologiska förhållanden i membran-protein samspelet, såsom bilayer sammansättning asymmetri. Rollen av en nyckel mitokondriellt lipid, cardiolipin, i bilayer egenskaper både liposomer och polymer-stödda bilayers återstår att definiera. Egenskaper såsom joniska styrka, membran tjocklek, membran styvhet, membran krökning, och membran elastisk-viskositet egenskaper alla kan påverka förmågan hos proteiner att montering i specifika funktionella tillstånd. Framtida studier kreativt tillämpa modell membransystem har potential att avslöja nya aspekter av membran protein organisation och funktion.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Författarna erkänner stödet från Charles H. Hood Foundation Child Health Research Award och generöst stöd från Institutionen för molekylärbiologi vid Massachusetts General Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
| 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
| Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
| Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
| Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
| Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
| Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
| FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
| Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
| GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
| Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
| L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
| Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
| n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
| PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
| Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
| Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
| Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
| Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |
References
- Sackmann, E. Biological membranes architecture and function. Structure and Dynamics of Membranes. Lipowsky, R., Sackmann, E. 1, Elsiever. 1-63 (1995).
- Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118, Pt 6 1099-1102 (2005).
- Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).
- Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations. Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).
- Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
- Chan, Y. H., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Biswas, K. H., Groves, J. T. Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies. Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).
- Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications. Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).
- Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).
- Kiessling, V., et al. Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes. Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).
- Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion. Nature Communication. 7, 11401 (2016).
- Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophysical Journal. 101 (8), 37 (2011).
- Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion. Elife. 3, 04389 (2014).
- Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
- Sezgin, E., Schwille, P. Model membrane platforms to study protein-membrane interactions. Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).
- Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures. Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).
- Dutta, D., Kam, L. C. Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems. Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).
- Groves, J. Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. , Springer. Boston, MA. (2006).
- Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).
- Wang, N., Rapoport, T. A. Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions. Journal of Cell Science. 132 (4), 227611 (2019).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
- Chan, D. C. Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health. Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Wai, T., Langer, T. Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation. Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).
- Chen, H., et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).
- Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1. EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).
- Anand, R., et al. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).
- Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation. Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).
- Baker, M. J., et al. Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics. EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).
- DeVay, R. M., et al. Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion. Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).
- Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress. Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).
- Ban, T., et al. Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).
- Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
- Shilts, K., Naumann, C. A. Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates. Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).
- Ge, Y., et al. Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane. Elife. 9, 50973 (2020).
- Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).
- Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level. Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).
- Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).
