Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

פלטפורמת ממברנה לדוגמה לשיכור דינמיקת קרום מיטוכונדריאלי

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/61620
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Chemistry, University of Akron, 3Department of Genetics, Harvard Medical School

Summary

היתוך מיטוכונדריאלי הוא תגובה הוםוסטטית חשובה הבסיסית לדינמיקה המיטוכונדריאלית. מתואר כאן היא מערכת איסוף חוץ תוך כדי לימוד היתוך מיטוכונדריאלי פנימי-קרום שיכול לפתור רצועה קרום, עגינה, המיתוך, ופתיחת נקבוביות. הרב-תכליתיות של גישה זו בחקר מערכות קרום התא נדון.

Abstract

דינמיקה מיטוכונדריאלית חיונית לפונקציות המגוונות של אורגנל ולתגובות הסלולריות. קרום המיטוכונדריה הצפוף, המורכב מרחבית, הוא סביבה מאתגרת להבחין בין גורמים רגולטוריים. שליטה ניסיונית של רכיבי חלבון ושומנים יכולה לעזור לענות על שאלות ספציפיות של רגולציה. עם זאת, מניפולציה כמותית של גורמים אלה היא מאתגרת בsays תאי. כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של היתוך המיטוכונדריה הפנימי-קרום, הצגנו פלטפורמה במבחנה מחדש המחקה את סביבת השימנים של המיטוכונדריה הפנימית קרום. כאן אנו מתארים שלבים מפורטים להכנת דו-שכבות שומנים ורכיבה מחדש של חלבוני קרום מיטוכונדריאלי. הפלטפורמה אפשרה ניתוח של ביניים בהיתוך ממברנה פנימית מיטוכונדריאלית, ואת הקינטיות עבור מעברים בודדים, באופן כמותי. פרוטוקול זה מתאר את ייצור הדו-שכבתי עם הרכב שומנים אסימטריים ומתאר שיקולים כלליים ליצירה מחדש של חלבוני טרנסמברנה לתוך דו-שכבתי מרופד. השיטה עשויה להיות מיושמת כדי ללמוד מערכות קרום אחרות.

Introduction

מידול קרום הוא סימן ההיכר של תאים אאוקריוטיים1 (איור 1A). ממברנות ביולוגיות מוכרות יותר ויותר כממס דו מימדי, ונחשבות כסביבה המתפקדת כסביבה המתפקדת תפקידים קריטיים בוויסות תפקוד החלבון והרכבה מורכבתמקרומולקולרית 2,,3. שומנים ילידים הם ליגנדים לווסת את פעילות חלבון קרום3,,4. ארגון מרחבי קרום ואת היכולת של ממברנות להיות מפוסל לצורות מגוונות הם מאפיינים פיזיים חשובים לבחירת פונקציות חדשות3,5.

פלטפורמות ממברנה מודל הן מערכות ביומימטיות שיכולות לעזור לנו להבין מבנה קרום סלולרי, דינמיקה,ופונקציה 6,7,8. קרום מודל בדרך כלל מרכיב תערובת שומנים של הרכב מוגדר היטב, עם תכונות ביופיזיות מוגדרות (נוקשות, עובי, ואלסטיות). יחד עם הדמיית פלואורסץ, פלטפורמות קרום מודל לאפשר ניתוח כמותי של מבנה קרוםופונקציה 9,10,,11. אסטרטגיות תיקון דו שכבתי שומנים שימשו כדי ללמוד SNARE בתיווך קרום היתוך9,,10,היתוך קרום בתיווך DNA12,היתוך ויראלי11,13. יתרון של שיטות כאלה הוא הפוטנציאל להשיג מידע קינטי עבור שלבים ביניים לפני אירוע תגובה נצפה14.

קרום הפלזמה נחקר בהרחבה באמצעות קרום מודל. Bilayers עם הפרדת שלב שומנים פותחו כדי ללמוד מבני רפסודה שומניםחשובים איתות סלולרי 11,15,16. מיקרופטרן שומנים בשכבות17,18 שימשו כדי לחקור את הארגון של קולטני תא. ממברנות פולימר או ג'ל נתמך שימשו כמערכות ביומימטיות כדי ללמוד את ארגון קרום-cytoskeleton, חלוקת חלבון קרום במהלך איתות תא, והגירה במגעים תא19.

מערכות קרום מלאכותי מוחלים גם ללמוד organelles תתתאיים 20. אורגנלים כוללים מורפולוגיות אופייניות שיוצרות סביבות משנה נפרדות. רשת הרשתית האנדופלסמית (ER) היא דוגמה אחת. עם restitutions של reticulons לתוך ליפוסומים, מבנים צינורית קרום עם מאפיינים דומים ER התאנוצרים 21. התוספת של אטלסטין, חלבון היתוך ER, יכול לגרום צינורות שומנים מליפוזומים כדי ליצור רשת20. זוהי דוגמה אחת לאופן שבו פרוטאוליפוזומים יכולים לספק תובנה פונקציונלית על מורפולוגיה ודינמיקה של אורגנל.

היתוך קרום מיטוכונדריאלי וביעוש חיוניים לבריאות האוכלוסייה המיטוכונדריאלית22,23,,24,,25. סט של משפחת דינמין GTPases מקטליזה מיטוכונדריה קרום היתוך. Mfn 1/2 קתליזה היתוך קרום חוץ. Opa1 מתווכת היתוך פנימי-קרום26 (איור 1B). Opa1 יש שתי צורות: צורה ארוכה (l-Opa1), transmembrane מעוגן ממברנה הפנימית המיטוכונדריאלי, וצורה קצרה 'מסיסה' (s-Opa1), נוכח בחלל intermembrane. היחס בין שני טפסי Opa1 מוסדר על ידי הפעילות של שני פרוטאזים, Oma1 ו Yme1L27,28,29,30. שאלות חשובות ברגולציה Opa1 כוללות: כיצד שתי הצורות של Opa1, (קצר וארוך) לתווך היתוך קרום ו שלהםיחסי הגומלין הרגולטוריים שלהם 28,29,31,32,33.

כאן אנו מתארים אסטרטגיית איסוף מחדש שהוחלה בהצלחה כדי לחקור היתוך מיטוכונדריאלי פנימי-קרום שהבהיר את התפקידים של l- ו s-Opa1 בהיתוך ממברנה פנימית. פיתחנו פלטפורמה המחקה את המיטוכונדריה הפנימית-קרום באמצעות דוטל שומנים קשור פולימר ו 200 צפון צפון שלל unilamellar. היתרונות של רצועה פולימרית מתחת לקוטל הליפידים כוללים את הדברים הבאים. ראשית, הוא משמר את חלבון הטרנסמברנה המשוחזר, שאחרת היה עלול להיות משובש על ידי הקרבה לשקופית הזכוכית34. שנית, הוא משמש שכבת מים עבה בין ביטל השומנים ומצוע זכוכית, אשר מקל על מחקריםשל פתיחת נקבוביות 9, ושלישית את האופי צמיג של פולימר PEG מאפשר שינויים עקמומיות קרום35. השתמשנו בהדמיית פלואורסץ של שלושה צבעים כדי לאפיין שלבים בהיתוך קרום(איור 1C-F).

Figure 1
איור 1: ניטור היתוך קרום מיטוכונדריאלי.
אורגנליםהם תאי קרום תאיים. (ב)שלבים רצים של היתוך קרום מיטוכונדריאלי. היתוך של הממברנה ההחוצה של המיטוכונדריה הוא זן על ידי Mfn1 ו / או Mfn2, בעוד היתוך ממברנה פנימית הוא בתיווך Opa1. אני לאיודע מה לעשות. סכמטי של פלטפורמת ההשבתה במבחנה כדי ללמוד היתוך קרום מיטוכונדריאלי. הפלטפורמה כוללת שני חלקים: פרוטאוליפוזה ובלם שומנים קשור פולימר, שניהם עם l-Opa1 משוחזר. תוויות פלורסנט, כולל שני צבעי קרום פלורסנט שונים וסמן תוכן, מסייעים להבחין בין שלבים במהלך היתוך קרום. שני סמני קרום (Cy5-PE (אדום) ו TexasRed PE (כתום) לעשות זוג FRET, אשר יכול לדווח על עגינת קרום קרוב. דיפוזיה של TexasRed-PE כי תוויות proteoliposome הוא אינדיקטור של demixing שומנים (המיפוזיה). שחרור תוכן מנוטר באמצעות ההתללות של אות הקלצ'ין (מוצג בירוק). לוחות A ו- B נוצרו באמצעות Biorender. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Protocol

1. הכנת תערובות שומנים

  1. הכן תמיסת מניות שומנים על ידי המסת 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3פוספוכולין (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-פוספוטנולמין (אפיפיור), L-α-phosphatidylinositol (כבד PI), cardiolipin, cardiolipin, קרדיוליפין, ו 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-פוספואתנולמין-N-[מתוקסי (פוליאתילן גליקול)-2000] (18:1 PEG2000 PE) לתוך כלורופורם בריכוז של 25 מ"ג/מ"ל. להמיס שומנים פלורסנט צבע-התפלה (TexasRed DHPE ו Cy5 סמים) כלורופורם בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל. אחסן את תמיסת הליפידים בקבוקונים ענבר עם ליינר עמיד כלורופורם, אטום עוד יותר עם קלטת polytetrafluoroethylene. ניתן לשמור את הפתרון ב-20°C למשך עד 6 חודשים.
  2. הפוך פתרונות A ו-B.
    1. לערבב שומנים להכנת פתרון A (ריכוז סופי 1 מ"ג / מ"ל) המכיל DOPC (52.8 מול%), האפיפיור (20 מול%), כבד PI (7 מול%) וקרדיוליפין (20 מול%), ו 0.2 מול פלואורופור.
    2. הפוך פתרון B (ריכוז סופי 1 מ"ג/מ"ל) המכיל DOPC (47.8 מול%), POPE (20 מול%), כבד PI (7 מול%), cardiolipin (20 מול%) ו-0.2 מול פלואור.
    3. צור את תערובת הליפים על ידי הוספת נפח מחושב של תמיסת אחסון לתוך בקבוקוני ענבר באמצעות מזרק זכוכית. להתאים את אמצעי האחסון הסופי על ידי הוספת כלורופורם נוסף לתוך הבקבוקונים.
      הערה: עבור FCS (ספקטרוסקופיה מתאם פלואורסצנה), להקטין את היחס של שומנים בהלת צבע ל 0.002 mol% ולהחליף את השאר על ידי DOPC.

2. ייצור של שתי שכבות שומנים

  1. אופים שקופיות זכוכית במיקרוסקופ ב-520 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר האפייה, מצננים את שקופיות הכיסוי לטמפרטורת החדר.
  2. לשקול כ 10 גרם של נתרן הידרוקסיד ולהוסיף 500 מ"ל של מתנול תוך כדי ערבוב. מערבבים במשך 2 שעות, ממשיכים להוסיף נתרן הידרוקסיד בתמיסה עד שהמשקעים מתחילים להראות. הקפד ללבוש PPE המתאים במהלך כל התהליך.
  3. לנקות את שקופיות הזכוכית בתמיסת נתרן dodecyl סולפט; מתנול רווי נתרן הידרוקסיד; ו 50 m חומצה הידרוכלורית, באופן רצף (sonication אמבטיה בכל מצב במשך 30 דקות). נקה את מגלשת הזכוכית במים אולטרה-תכליתיים למשך 10 דקות בין כל תנאי.
    הערה: למרות מומלץ מאוד להשתמש בפתרונות טריים להכנת שקופיות זכוכית, ניתן לעשות שימוש חוזר בכל פתרון עד 5x או בתוך חודש אחד, מה שבא קודם. הקפד לערבב את הפתרון לפני כל שימוש.
  4. אחסן את זכוכית הכיסוי הנקייה החתומה בתמיסת HCl עד שבועיים כדי להבטיח איכות דו-שכבתית טובה. אם הם מאוחסנים במים אולטרה-אפורים, השתמשו במגלשות בתוך שבוע.
  5. נקה את שוקת הפוליטרפלואורואתילן של מערכת הטבילה לנגמיר-בלודג'ט באמצעות כלורופורם ומים אולטרה-פורים עד שלא נצפה הרטבה על שוקת. ספריי כלורופורם על פני השטח של שוקת, לנגב ביסודיות עם מגבונים תאית 3x. יש לשטוף במים סופר-תכליתיים ולהסיר את המים באמצעות שאיבה. חזור על זה 3x.
  6. מכסים את פני השטח של שוקת עם מים נקיים ואולטרה-תפורים.
  7. קחו 2 חתיכות של זכוכית כיסוי שטופלה על פני השטח מתמיסת ניקוי או מים אולטרה-יבשים, ושטופו את מגלשת הזכוכית במים אולטרה-יבשים למשך כ-30 שניות.
  8. מניחים את הכיסוי באופן גב אל גב. השתמש במלחציים של הצוללת כדי להחזיק את מגלשות הזכוכית. לטבול את מגלשת הזכוכית מתחת לפני המים על ידי לחיצה ידנית "dipper למטה" על תוכנת הבקרה Langmuir.
  9. אפס איזון הסרט, בזהירות להפיץ פתרון B טיפה אחר טיפה בממשק מי האוויר(איור 2A). ודא שומנים מתפשטים רק בממשק מי האוויר, ללא כלורופורם וטיפות שומנים טובעים לתחתית פני השטח polytetrafluoroethylene.  כישלון להבטיח את זה תיצור שומנים "ערוץ" ולמנוע היווצרות מונומרית.
  10. להפסיק להוסיף שומנים עד קריאת איזון הסרט סביב ~ 15-20 mN / mn / m, לחכות ~ 10-15 דקות. התחל את בקר המחסום כדי לשנות את שטח הפנים על-ידי לחיצה על "התחל ניסויים", עד לקריאת איזון הסרט ל- 37 mN/m. לשמור על הלחץ במשך ~ 20-30 דקות (איור 2B).
  11. הרם את כיסוי הזכוכית במהירות של 22 מ"מ/דקה תוך שמירה על מתח פני השטח במהירות של 37 mN/m. מונו-שכבת שומנים עם כריכת פולימר תועבר מממשק מי האוויר אל פני השטח של זכוכית כיסוי דרך תהליך הטבילה Blodgett(איור 2C). זה יוצר את העלון התחתון של דו-שכבת הליפידים.
  12. נקה את ממשק מי האוויר על ידי יניקה, לשטוף את שוקת עם מים אולטרה פורים.
  13. נקה מגלשת זכוכית בעלת באר אחת (לדוגמה, מגלשת שייפר) באמצעות כלורופורם, אתנול ומים אולטרה-פורים לפני השימוש. מניחים את מגלשת הזכוכית הנקייה על שוקת המים האפורים במיוחד מתחת לשכבת המים. ודא שהבאר פונה כלפי פנים כלפי הממשק של מי האוויר ויוצקים מים טריים ואפורים עד מגלשת הזכוכית מכוסה במלואה. חזור על שלב 2.8.
  14. החזק את הכיסוי עם מונולייטר שומנים ממדרגה 2.4 באמצעות יניקה סיליקון (לוודא בצד מונולייטר הוא רחוק מכוס יניקה), בעדינות לדחוף את מונולייטר הליפיד לממשק מים אוויר, להחזיק את זכוכית הכיסוי עבור ~ 2-3 s בממשק, ואז לדחוף את הכיסוי נגדהמגלשה (איור 2D). קח את השקופית החוצה עם מגלשת מכסה.
    הערה: דו-שכבת הליפידים תתקיים על פני השטח של זכוכית הכיסוי הפונה לאזור הסנדוויץ' בין שתיהשקופיות (איור 2E).
  15. קח את הכיסוי עם הדו-שכבתי למיקרוסקופ אפיפלואורסצנס. תדמינאי את דו-שכבת הליפידים. אם התפלגות הומוגנית של צבע השימנים נצפתה, photobleach אזור קטן של הדו-שכבת עבור 30 s, לכבות את מקור האור עבור ~ 30 s-1 דקות, אז תמונה שוב כדי לצפות בהתאוששות. דו-שכבת שומנים תראה התאוששות פלואורסטית.
    הערה: אין להשתמש בממברנות עם פגמים או בשחזור פלואורסטס רע לניסויים נוספים.

Figure 2
איור 2: שלבים בהכנת דו-שכבת שומנים עם רצועה פולימרית.
שלבים של ביצוע שתי שכבות שומנים באמצעות Langmuir-Blodgett טבילה (A-C) ו לנגמיר-שייפר להעביר(D)טכניקות. ה"כריך" האחרון המכיל את הדו-שכבת ה שומנים.E לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

3. שחזור חלבונים לתוך דוטל הליפידים קשור פולימר

  1. הכן צלחת התגבשות המכילה מים אולטרה-תכליתיים. הכינו טבעת תמונה מיקרוסקופית נקייה והניח מתחת לצלחת.
  2. לטבול את "הכריך" של מגלשת שייפר לכסות זכוכית המכילה דו שכבת שומנים מתחת למים, בעדינות להפריד את מגלשת שייפר וזכוכית לכסות, להחזיק את החלקה זכוכית לכסות מהתחתית, הרחק מהצד הדו-שכבתי, להעביר את זכוכית הכיסוי לתוך טבעת התמונה, לסגור את טבעת התמונה.
    הערה: ודא כי הכיסוי עם דו-שכבת שומנים הוא תמיד במים, ואת הטבעת אטומה היטב.
  3. החלף את המים האפורים במיוחד בטבעת התמונה במאגר Bis-Tris NaCl, ודא שהליקוט הליפיד אינו חשוף לבועות אוויר. הוסף 1.1 x10-9 M n-Octyl-β-D-Glucopyranoside ללוטל הליפידים. מיד להוסיף את התערובת של 1.2 x 10-9 M של DDM ו 1.3 x 10-12 מול מטוהר l-Opa136 לתוך טבעת התמונה. דגירה מדגם על שייקר ספסל במהירות נמוכה עבור 2 שעות (איור 3).
    הערה: חומרי ניקוי עשויים להשתנות בהתאם לחלבון שיש לשחזר.
  4. להפיץ 30 מ"ג SM-2 חרוזי שרין לתוך 3 מ"ל של חיץ Bis-Tris ולנער לפני החלת. השתמש פיפטה פלסטיק כדי להוסיף 5 ~ 10 μL של SM-2 חרוזי שריף לטבעת תמונה, דגירה במשך 10 דקות, להסיר חרוזי שף על ידי שטיפה. אמצעי האחסון הסופי של המאגר בטבעת התמונה הוא 1.5 מ"ל.

Figure 3
איור 3: נוהל לצורך התכנסות מחדש של L-Opa1 לתוך דו-שכבת שומנים עם רצועה פולימרית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

4. הכנת פרוטאוליפוזה

  1. להכין 1 מ"ג של תערובת שומנים A בתמיסת כלורופורם. להתאדות כלורופורם תחת זרימת חנקן במשך 20 דקות ולשמור תחת ואקום לילה ויוצרים סרט שומנים.
  2. להכין 50 מ 'calcein המכיל חוצץ על ידי המסת 15.56 גרם calcein כדי 50 מ"ל של 1.5 מול NaOH פתרון, לערבב בטמפרטורת החדר עד calcein הוא מומס לחלוטין, הוסיף 12.5 mM Bis-Tris ומים אולטרה פורה לנפח הסופי של 500 mL. כוונן את ה-pH ל- 7.5.
  3. להשעות את הסרט שומנים בקלצ'ין המכיל חוצץ, לחות מלאה את הליפיסט על ידי חימום המתלים ב 65 מעלות צלזיוס עבור 20 דקות. 200 נק'ל ליפוזומים נוצרים באמצעות הבלטה באמצעות קרום פוליקרבונט.
  4. להוסיף 2 μg של l-Opa1 ב 0.5 μM DDM כדי 0.2 ליפוגום מ"ג דגירה ב 4 ° C עבור 1.5 שעות. הסר את פעילות הגלישה באמצעות דיאליזה באמצעות קלטת דיאליזה 3.5 kDa נגד 250 מ"ל של 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl ו 50 mM calcein מאגר ב 4 ° C לילה, שינוי המאגר פעמיים.
  5. הסר קלצ'ין נוסף באמצעות עמודת התפלה PD-10.

5. הדמיה וניתוח נתונים

  1. רכוש תמונות TIRF באמצעות יעד טבילה בשמן פי 100 (N.A 1.4). השתמש לייזר 543 nm ולייזר 488 nm לניתוח של TexasRed-PE מסומן ליפזומים ופרוטאוליפוזה עטוף עם calcein. השתמש בלייזר 633 נארם לניתוח של Cy5-PE מוטבע דו שכבת שומנים מיורנית.
  2. יישר את זווית TIRF באמצעות דו-שכבת שומנים כדי לקבל פליטה מקסימלית. האיכות של דו-שכבת שומנים לאחר reconstitution נצפתה באמצעות יעד שמן 100x ב 25 מעלות צלזיוס. מקדם דיפוזיה של דו-שכבתי פוספוליפידים ושוחזר נקבעים באמצעות FCS עם פרוטוקול המתאר במקוםאחר 37.
  3. להוסיף 10 μL של 2 פרוטאוליפוזה מ"ג /מ"ל לטבעת התמונה ולהגדיר עבור 10 דקות לפני התמונה. GTP, GMPPCP או תמ"ג מתווספים לטבעת התגובה עם 1 mM MgCl2 ו 1 mM של נוקלאוטיד.
  4. כדי לקבוע את ההשפעה של s-Opa1 בהיתוך קרום, titrate s-Opa1 לתוך מדגם דו שכבתי פרוטוליפוז / נתמך המכיל l-Opa1, ואירועי היתוך להקליט.
  5. הדמיה בו-זמנית של TexasRed-DHPE ו- calcein מושגת באמצעות מערכת פיצול קרן. שני 488 מילינר ו 543 מילימ'ין לייזר מוחלים בו זמנית על המדגם כמקורות פלורסנט. לאחר מכן, אור הפליטה מחולק באמצעות מפצל קרן של 560 00 00 00 00 00:00:00,000 .אני לא יכול-. לאחר מכן, אור הפליטה המפוצל מסונן על-ידי מסנן של 510 ננ"מ עם רוחב פס של 42 ננ"מ ומסנן של 609 ננ"מ עם רוחב פס של 40 ננ"מ. הקרן המסוננת מקרנת לשני אזורים סמוכים על שבב המצלמה.
  6. פליטת פלורסנט נרשמת בו-זמנית באמצעות מסנן של 609 פליטות עם רוחב פס של 40 ננ"ר, ומסנן 698 פליטה עם רוחב פס של 70 ננ"מ. מערכת המיקרוסקופ מצוידת במצלמת CMOS המתוחזקת ב-10°C.
  7. זיהוי חלקיקים של הליפוזומים יכול להתבצע באמצעות אלגוריתם זיהוי חלקיקים מבוסס גאוסיאני. התפלגות החלקיקים והעוצמה מנותחים ערוץ אחר ערוץ. אות דו שכבת שומנים משמש כמסכה לבודד חלקיקים.

Representative Results

חלבון הטרנסמברנה התווסס מפיץ בחופשיות ומופץ באופן הומוגני בממברנה.

תמונות לדוגמה של דו-שכבת שומנים ונזילות הליפים שלה מאומת על ידי מיקרוסקופיות epifluorescence מוצגות איור 4. התפלגות שומנים דו-שכבתי לפני ואחרי פוטו-בליך מוצגת באות 4א', ב'. הומוגניות של דו-שכבת הליפידים הודמיה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence לפני ואחרי reconstitution(איור 4D,E). l-Opa1 מחדש בדוטל שומנים אומת על ידי ספקטרוסקופיה מתאם פלואורסצית (FCS). אנו משתמשים שומנים בהלת ערך כדי להעריך את מפזר השימנים של הדו-שכבת. Opa1 משוחזר תויג באמצעות נוגדן פלואורסצנט מתויג אנטי-Opa1 C-מסוף. דיפוזיה שומנים Bilayer נמדד כמו 1.46 ± 0.12 μm2/ s, בעוד מקדם דיפוזיה של l-Opa1 דו שכבתי מחדש היה 0.88 ± 0.10 μm2/ s. קריאה בעוצמה מן עקומות FCS הצביע 75% של l-Opa1 הוא מחדש לתוך דוטל השפתיים(איור 4G,H). תוצאות אלה מצביעות על כך l-Opa1 מפזר בחופשיות את הדוטל הפולימר קשור שומנים עם פוטנציאל להרכיב את עצמו לתוך תסביך פונקציונלי.

Figure 4
איור 4: התפלגות שומנים וחלבון משוחזרים בממברנה מודל.
(A-C) מה אתה עושה? תמונות לדוגמה של דו-שכבת שומנים ונזילות הליפים שלה מאומת על ידי מיקרוסקופיות epifluorescence. (א)הפצת שומנים הומוגניים ב-bilayer לפני פוטו-בליך. (ב)תמונה מיד לאחר ההתלתענות. (ג)Bilayer תמונה לאחר התאוששות פלואורסץ מצביע על נזילות שומנים טובה של קרום לאחר reconstitution. אנילא יודע אם אני יכול לעשות את זה. תמונות מייצגות של הפצת שומנים לפני(ד')ולאחר(ה)l-Opa1 מצביעות על כך שתהליך ההשבתה מחדש לא יצר פגמים בקוטב הדו-שכבתי. תמונת TIRF מייצגת של l-Opa1 עם תווית עם אלקסה 488 נוגדןהתואם (F)המציג התפלגות הומוגנית של Opa1 עם איסוף מחדש. G. נציג פוטן גולמי ספירות של אות L-Opa1 על ידי ספקטרוסקופיה מתאם פלורסנט. בפקד, לא התווסתה ה-L-Opa1 בדו-שכבת ההדד, בעוד הנוגדן נוסף ושטיפה. דיפוזיה של l-Opa1 הוא איטי באופן משמעותי מאשר שומנים קרום, עולה בקנה אחד עם איסוף מוצלח של טרנסמברנה l-Opa1 (H). סרגל קנה מידה: 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.

הלבנת שלב פלואורסציט הצביעה על ממוצע של 2-3 עותקים של l-Opa1 שוחזרו בליפוזום נתון(איור 5א', ב). התפלגות הגודל של Proteoliposomes opa1 שוחזר נבדק לאחר השבתה באמצעות DLS (איור 5C). ההשבתה מחדש של Opa1 בפרוטאוליפוסומים אומתה גם באמצעות FCS. מקדם דיפוזיה של נוגדן חינם היה 164 ± 22 μm2/s; מקדם דיפוזיה לליפוזומים המסומנים בצבע שומנים היה 2.22 ± 0.33 μm2/s, ומקדם דיפוזיה עבור פרוטאוליפוזומים l-Opa1 קשור TexasRed שכותרתו נוגדן שלו היה 2.12 ± 0.36 μm2/s.

Figure 5
איור 5: ייצור ואפיון פרוטאוליפוזומים.
(א)צעדים בזיוף פרוטאוליפוזה עם קלצ'ין עטוף, מרווה. (ב)נתונים מייצגים של הלבנת צעד פלורסנט להראות בממוצע של 2-3 עותקים של l-Opa1 מוטבע ליפוסום. (ג)הפצות גודל מייצג של פרוטאוליפוזומים (אדום) ללא כל נוקלאוטיד 1 שעה לאחר דגירה GTP (ירוק). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

זיהוי של רצועה קרום, demixing שומנים / המיפוז, ופתח נקבוביות על ידי מיקרוסקופ פלורסנט.

רצועה קרום מנוטר על ידי התבוננות האות של TexasRed על פני השטח של דו שכבת שומנים באמצעות מיקרוסקופ TIRF(איור 6A). התנהגות דמיקסינג שומנים קרום (המיפוזיה) היה במעקב דרך TexasRed כמו הצבע מפזר מן הליפוזומים לתוך דו שכבת השימנים. ההתנקות של Calcein מסייעת להבחין בין היווצרות נקבוביות היתוך מלאה לבין דמיקסינג שומנים בלבד. הדבר מאפשר השוואה בין תנאים שבהם חלקיקים דוהים בהמיתוך (איור 6B), לבין חלקיקים המשכים להתיתוך מלא(איור 6C).

רצועה קרום מסומן על ידי אות שומנים יציב ים מליפוזומים. ניתן להעריך את המרחק בהתבסס על אות FRET בין התוויות של שתי ממברנות36. אות המיתוך אינו כולל dequenching באות calcein(איור 6B, שורה נמוכה), אבל ריקבון מהיר של האות TexasRed מצביע על דיפוזיה של הצבע לתוך דו שכבת השימנים(איור 6B שורה עליונה). היתוך מלא (עם פתיחת נקבוביות) כולל גם ריקבון שומנים ושחרור תוכן (איור 6C). TexasRed עוצמה ועוצמת calcein ניתן לעקוב באופן תלוי זמן כדי לספק פירוט כמותי עבור הקינטיים של היתוך קרום36.

Figure 6
איור 6: תוצאות מייצגות המציגות רצועה של חלקיקים (A, סרגל קנה מידה 10 μm), המיתוך (B, סרגל קנה מידה 0.5 μm) והיתוך (C, סרגל קנה מידה 0.5 μm).
(א)פרוטאוליפוזה קשור Opa1-משוחזר שומנים דו שכבתי לפני תוספת GTP. דוגמהלהמיפוזיה. השורה העליונה ב- B מציגה demixing שומנים (אות TexasRed, אדום), שורה נמוכה יותר ב- B מראה שום שחרור תוכן (אות calcein, ירוק) בתנאים אלה. (ג)סימן מייצג של התזה פרוטוליפוזום עם דו-שכבת הליפידים. ניתן לצפות בפרסום תוכן מתמונות בשורה התחתונה של הצגת ההתרעה של calcein (שורה נמוכה יותר, ירוק). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

במערכות ממברנה מודל המבחנה יכול לתאר תהליכי קרום מורכבים בתנאים מוגדרים היטב. מערכות אלה יכולות להבחין בין רכיבים מינימליים הנחוצים לתהליכים מולקולריים מורכביםכדי לחשוף מנגנוניםמולקולריים 6 , 15,,20,,38., עבור חלבוני קרום, ליפוסומים וbilayers נתמך פלנר הם מערכות reconstitution נפוצות. בניגוד לשומנים דו-שכבות הנתמכים על-ידי מוצק, כרית הפולימר בין המצוע לבין קרום נתמך בשכבות פולימריות קשורות מאפשרת ניידות חופשית של חלבוני קרום גדולים, וחלבונים טרנסמברנה כדי לפזר ולהרכיבבחופשיות 34. תכונות אלה עזרו לנו לחקור את הקינטיות של המיטוכונדריה היתוך פנימי-קרום36.

הכנו דו-שכבת שומנים פולימרית קשורה באמצעות טכניקות לנגמיר-בלודג'ט/לנגמיר-שייפר (LB/LS). זה מאפשר לנו להכין דו-שכבתי עם רכיבי שומנים אסימטריים. קרום תאי יש הרכב עלון אסימטרי, ואת הגישה LB / LS מאפשר את המחקר של bilayers כאלה. עם העברת שייפר, ניתן לכסות את המקום שלם על ידי דו-שכבת שומנים. זה קריטי להכין משטח נקי להכנת דו-שכבתי. בנוסף, נדרש אימון כדי לבצע העברת שייפר כראוי. העברת שייפר לא מוצלחת יכולה ליצור פגמים לא רצויים ברכיבה על שומנים. בפרוטוקול זה, הלחץ שנוסף לאיזון הסרט ישים עבור דו-שכבתי המכיל 20% קרדיוליפין. עבור bilayers עם רכיבים אחרים, עיין באזור הלחץ של פני השטח isotherm של רכיבי המפתח. שיטה חלופית היא שיטת ההיתוך Langmuir-Blodgett/vesicle (LB/VF), שבה המונו-שכבת השימנים התחתונה מועברת מממשק מי האוויר של שוקת לנגמיר אל המצע הנקי, ואז ליפוזומים מתמזגים לראש המונואלייטר השימנים הנתמך ויוצריםאת הדו-שכבתי הסופי 39. איסוף מחדש של חלבוני ממברנה באמצעות שיטת LB/VF הוא פשוט יותר מאשר LB / LS, כמו reconstitution ניתן לבצע באמצעות ההיתוך של פרוטאוליפוזומים. עם זאת, היתוך של שלבקת דורש תוספת של ליפוזומים עודפים, אשר עשוי לסבך את המחקר של אירועי קרום תלויים אינטראקציות תלויות חלבון-חלבון תלויריכוז.

ההשבתה המוצלחת של חלבוני טרנסמברנה לתוך שתי שכבות שומנים קשורפולימר ולליפוזומים באוריינטציה פונקציונלית מועדפת היא חשובה, אך קשה לאכוף. יש צורך בבקרות ניסיוניות כדי להסביר זאת. עבור פולימר קשור שומנים דו-שכבתיים, חשוב גם לשמור על שלמות של דו-שכבת שומנים במהלך reconstitution. ריכוזי פעילי שטח חייבים להיות נמוכים יחסית כדי למנוע המסת דו-שכבת השומנים, אבל גבוה מספיק כדי למנוע פירוק של חלבוןשל עניין 37,40. השיטה המתוארת כאן היא אידיאלית עבור שחזור חלבוני קרום עבור מחקרים מולקולה אחת, אבל הוא לא בהכרח מדרגי עבור מחקרים בקנה מידה גדול יותר. בחירת פעילי שטח היא שיקול חשוב נוסף. לעתים קרובות, פעילי שטח המשמשים לטיהור ואחסון היא נקודת התחלה טובה. הריכוז המרבי של פעילי שטח הוא בדרך כלל ~ 200 פעמים פחות של CMC36, בטווח שבו פעילי שטח שומר על יציבות חלבון ומונע צבירת חלבונים, תוך שמירה על שלמותקרום 36. קוקטיילים המכילים 2 או 3 פעילי שטח עשויים להיחשב. עבור reconstitution לתוך ליפוזומים, ריכוז נמוך של פעילי שטח אינו הכרחי. עם זאת, ריכוזי פעילי שטח מתחת CMC עדיפים לשמור על גודל אחיד והפצה מורפולוגיה עבור ליפוזומים. כדי למנוע דליפה של צבע תוכן, יש צורך בחיוג מול מאגר המכיל צבע.

בניגוד לתכני היתוך מבוססי ליפוזום, הפלטפורמה שהקמנו מספקת גישה לחקור את הקינטיים של כל שלב של היתוך קרום. שיטה זו מספקת את היכולת ללמוד חלבוני היתוך transmembrane בתנאים כמעט מקומיים. פלטפורמות ממברנה מודל ניתן להחיל ללמוד הרכבת חלבון קרום ואוליגומריזציה, קרום "פיסול", ואינטראקציות חלבון-שומנים של חלבונים בסביבות תת תאיות, כמו המיטוכונדריה הפנימית קרום. שיטה זו מאפשרת גם לחקור מצבים פיזיולוגיים חשובים באינטרפליי קרום-חלבון, כגון אסימטריה הרכב דו שכבתי. התפקיד של שומנים מיטוכונדריאליים מפתח, cardiolipin, במאפיינים דו שכבתי של שתי ליפונים וbilayers הנתמכים פולימר נשאר להיות מוגדר. מאפיינים כגון הכוח היוני, עובי קרום, נוקשות קרום, עקמומיות קרום, ומאפייני צמיגות אלסטית קרום כל עשוי להשפיע על היכולת של חלבונים כדי הרכבה למצבים פונקציונליים ספציפיים. מחקרים עתידיים החלת מערכות קרום מודל באופן יצירתי יש פוטנציאל לחשוף היבטים חדשים של ארגון חלבון קרום ותפקוד.

Disclosures

ללא.

Acknowledgments

המחברים מכירים בתמיכה של פרס מחקר בריאות הילד של קרן צ'ארלס הוד ותמיכה נדיבה מהמחלקה לביולוגיה מולקולרית בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) Avanti polar lipid Cat #: 810335C1mg membrane fluorescent markers
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 880130P lipid molecules
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 710335P lipid molecules
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) Avanti Polar lipids Cat #: 850375P lipid molecules
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar lipids Cat #: 850757P lipid molecules
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit ThermoFisher Scientific A20181
Amber vial with PTFE liner Fisher scientific 14-955-332 sample vials to keep lipid solutions
Calcein Sigma-Aldrich Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 fluorescent dye
Chloroform Fisher scientific 298-500/ C295-4 Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works.
Concavity slide (1 well) Electron Microscopy Science 71878-05 applied as Schaefer Slide
FCS analysis tool Smith Lab, University of Akron software tool
Fiji /ImageJ Fiji SCR_002285 software tool
Fisherbrand Cover Glasses: Circles Fisher scientific 12-545-102 Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M
GTP Disodium salt SIGMA-ALDRICH INC Cat #: 10106399001
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough Biolin Scientifc KN2002
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) Avanti Polar lipids Cat #: 850091P lipid molecules
Mini Extruder Avanti Polar lipids 610020
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside Anatrace Cat #: D310 25 GM surfactant for reconstitution
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside Anatrace Cat #: O311HA 25 GM surfactant for reconstitution
PC Membranes 0.2μm Avanti Polar Lipids 610006
Rabbit Anti-Opa1 antibody NOVUS BIOLOGICALS Cat #: NBP2-59770 antibody for Opa1 C-terminal detection
Slidebook Intelligent imaging RRID: SCR_014300 software tool
Teflon threaded seal tape Fisher Scientific NC0636085 taflon tape for sample storage
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) ThermoFisher Scientific Cat #: T1395MP membrane fluorescent markers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sackmann, E. Biological membranes architecture and function. Structure and Dynamics of Membranes. Lipowsky, R., Sackmann, E. 1, Elsiever. 1-63 (1995).
  2. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118, Pt 6 1099-1102 (2005).
  3. Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).
  4. Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations. Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).
  5. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  6. Chan, Y. H., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  7. Biswas, K. H., Groves, J. T. Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies. Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).
  8. Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications. Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).
  9. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).
  10. Kiessling, V., et al. Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes. Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).
  11. Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion. Nature Communication. 7, 11401 (2016).
  12. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophysical Journal. 101 (8), 37 (2011).
  13. Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion. Elife. 3, 04389 (2014).
  14. Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
  15. Sezgin, E., Schwille, P. Model membrane platforms to study protein-membrane interactions. Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).
  16. Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures. Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).
  17. Dutta, D., Kam, L. C. Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems. Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).
  18. Groves, J. Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. , Springer. Boston, MA. (2006).
  19. Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).
  20. Wang, N., Rapoport, T. A. Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions. Journal of Cell Science. 132 (4), 227611 (2019).
  21. Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
  22. Chan, D. C. Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health. Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).
  23. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  24. Wai, T., Langer, T. Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation. Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).
  25. Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).
  26. Chen, H., et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).
  27. Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1. EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).
  28. Anand, R., et al. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).
  29. Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation. Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).
  30. Baker, M. J., et al. Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics. EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).
  31. DeVay, R. M., et al. Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion. Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).
  32. Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress. Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).
  33. Ban, T., et al. Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).
  34. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  35. Shilts, K., Naumann, C. A. Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates. Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).
  36. Ge, Y., et al. Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane. Elife. 9, 50973 (2020).
  37. Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).
  38. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).
  39. Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level. Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).
  40. Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).

Tags

החודש ב JoVE גיליון 163 מיטוכונדריאלי פנימי קרום Opa1 פולימר קשור שומנים דו שכבתית במבחנה מחדש היתוך קרום מיקרוסקופית TIRF
פלטפורמת ממברנה לדוגמה לשיכור דינמיקת קרום מיטוכונדריאלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ge, Y., Boopathy, S., Smith, A.,… More

Ge, Y., Boopathy, S., Smith, A., Chao, L. H. A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics. J. Vis. Exp. (163), e61620, doi:10.3791/61620 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter