Summary
Mitokondriyal füzyon mitokondriyal dinamiğin altında yatan önemli bir homeostatik reaksiyondur. Burada açıklanan bir in vitro reconstitution sistemi membran tethering çözebilir mitokondriyal iç membran füzyon çalışması, yerleştirme, hemifüzyon, ve gözenek açılması. Hücre zarı sistemlerinin araştırılmasında bu yaklaşımın çok yönlülüğü tartışılmıştır.
Abstract
Mitokondriyal dinamikler organelin çeşitli fonksiyonları ve hücresel tepkiler için gereklidir. Kalabalık, mekansal olarak karmaşık, mitokondriyal membran düzenleyici faktörleri ayırt etmek için zorlu bir ortamdır. Protein ve lipid bileşenlerinin deneysel kontrolü, düzenlemenin belirli sorularının yanıtlatılabilir. Ancak, bu faktörlerin nicel manipülasyon hücresel tahlillerde zordur. Mitokondri iç zar füzyonunun moleküler mekanizmasını araştırmak için mitokondriyal iç zarın lipid ortamını taklit eden bir in vitro reconstitution platformu sunduk. Burada lipid iki katları hazırlamak ve mitokondriyal membran proteinlerini yeniden oluşturmanın ayrıntılı adımlarını açıklıyoruz. Platform, mitokondriyal iç zar füzyonundaki ara girdilerin ve bireysel geçişler için kinetiklerin nicel bir şekilde analizine olanak sağladı. Bu protokol, asimetrik lipid bileşimi ile iki katmanlı imalatı açıklar ve bir yastıklı iki katmanlı içine transmembran proteinleri reconstistied için genel hususlar açıklar. Yöntem diğer membran sistemlerini incelemek için uygulanabilir.
Introduction
Membran kompartalizasyonu ökaryotik hücrelerin bir özelliğidir1 (Şekil 1A). Biyolojik membranlar giderek iki boyutlu bir çözücü daha fazla olarak kabul edilir, ve protein fonksiyonu ve makromoleküler karmaşık montaj düzenleyen kritik rol oynayan bir ortam olarak kabul edilir2,3. Doğal lipidler membran protein aktivitesini düzenleyen ligandlarvardır 3,4. Membran uzamsal organizasyon ve membranların çeşitli şekiller halinde heykel yeteneği yeni fonksiyonlar seçmek için önemli fiziksel özelliklerivardır 3,5.
Model membran platformları bize hücresel membran yapısı, dinamikleri ve fonksiyonu6,7,,8anlamamıza yardımcı olabilir biyomimetik sistemlerdir. Model membranlar tipik olarak tanımlanmış biyofiziksel özelliklere (sertlik, kalınlık ve elastikiyet) sahip iyi tanımlanmış bileşimin lipid karışımını oluşturur. Floresan görüntüleme ile birleştiğinde, model membran platformları membran yapısı vefonksiyonununkantitatif analizisağlar 9,10,11. Lipid iki katmanlı reconstitution stratejileri SNARE aracılı membran füzyon9,,10, DNA aracılı membran füzyon12ve viral füzyon11,13çalışma için kullanılmıştır. Bu tür yöntemlerin bir avantajı gözlemlenebilir bir reaksiyon olay14öncesinde ara adımlar için kinetik bilgi elde etmek için potansiyeldir.
Plazma membranı model membranlar kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Lipid faz ayrıştırma ile bilayers hücrelisinyalizasyon önemlilipid sal yapıları çalışmak için geliştirilmiştir 11,15,16. Mikro desenli lipid düzlemsel iki katmanlı17,18 hücre reseptörlerinin organizasyonunu araştırmak için kullanılmıştır. Polimer veya jel destekli membranlar membran-sitoiskelet organizasyonu, hücre sinyalizasyonu sırasında membran protein bölünmesi ve hücre-hücre temaslarında göç19incelemek için biyomimetik sistemler olarak kullanılmıştır.
Yapay membran sistemleri de hücre altı organelleri20çalışma için uygulanmaktadır. Organeller farklı alt ortamlar oluşturan karakteristik morfolojilere sahiptir. Endoplazmik retikulum (ER) ağı bunun bir örneğidir. Retikulonların lipozomlara dönüştürülmesi üzerine hücresel ER'ye benzer özelliklere sahip tübüler membran yapıları21'deoluşur. Atlastin eklenmesi, bir ER füzyon proteini, bir ağ oluşturmak için lipozomlardan lipid tübülleri neden olabilir20. Bu, proteolopozomların organel morfolojisi ve dinamiği hakkında fonksiyonel içgörü nasıl sağlayabileceğinin bir örneğidir.
Mitokondriyal membran füzyonu ve fizyonu mitokondriyalpopülasyon22,,23,,24,25sağlığı için gereklidir. Dinamin familyasından gtpaslar mitokondri membran füzyonu katalizler. Mfn 1/2 dış membran füzyonkatalize. Opa1 iç zar füzyon26 (Şekil 1B)aracılık eder. Opa1'in iki şekli vardır: uzun bir form (l-Opa1), mitokondriyal iç zara bağlı transmembran ve intermembran uzayında bulunan 'çözünür' kısa form (s-Opa1). İki Opa1 formlarının oranı iki proteaz, Oma1 ve Yme1L27,28,,29,30aktivitesi ile düzenlenir. Opa1 yönetmeliğinde önemli sorular şunlardır: Opa1 iki formları, (kısa ve uzun) membran füzyon ve düzenleyici etkileşim28,29,31,32,33aracılık nasıl .
Burada, l- ve s-Opa1'in iç zar füzyonundaki rollerini açıklığa kavuşturan mitokondriyal iç zar füzyonu araştırmak için başarıyla uygulanan bir yeniden yapılanma stratejisini açıklıyoruz. Polimer-tethered lipid çift katmanlı ve 200 nm unilamellar veziküller kullanarak mitokondriyal iç membranı taklit eden bir platform geliştirdik. Lipid bilayer altında bir polimer tether faydaları şunlardır. İlk olarak, aksi takdirde cam slayt34yakınlığı ile bozulabilir yeniden transmembran protein, korur. İkinci olarak, lipid çift katmanlı ve cam substrat arasında kalın bir su tabakası hizmet vermektedir, hangi gözenek açma çalışmaları kolaylaştırır9, ve üçüncü PEG polimer viskoelastik doğa membran eğrilik değişiklikleri sağlar35. Membran füzyonundaki basamakları karakterize etmek için üç renkli floresan görüntüleme kullandık (Şekil 1C-F).
Şekil 1: Mitokondriyal membran füzyonunun izlenmesi.
(A) Organeller hücre zarı bölmeleridir. (B) Mitokondriyal membran füzyonunun sıralı basamakları. Mitokondrinin dış zarının füzyonu Mfn1 ve/veya Mfn2 ile katalize edilirken, iç zar füzyonu Opa1 ile aracılık edilir. (C-F) Mitokondriyal membran füzyonu incelemek için in vitro reconstitution platformunun şeması. Platform iki bölümden oluşmaktadır: proteolizom ve polimer-tethered lipid çift katmanlı, her ikisi de yeniden l-Opa1 ile. Floresan etiketler, iki farklı floresan membran boyaları ve bir içerik belirteci de dahil olmak üzere, membran füzyon sırasında adımları ayırt yardımcı olur. İki membran belirteçleri (Cy5-PE (kırmızı) ve TexasRed PE (turuncu) yakın membran yerleştirme rapor edebilirsiniz bir FRET çifti yapmak. TexasRed-PE'nin proteolipozom etiketleyen difüzyonu lipid demiksinin (hemifüzyon) bir göstergesidir. İçerik salınımı calcein sinyalinin dequenching yoluyla izlenir (yeşil gösterilir). A ve B panelleri Biorender kullanılarak oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
1. Lipid karışımlarının hazırlanması
- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosfoetanolamine (PAPA), L-α-fosfatidilinositol (Karaciğer PI), kardiyolipin, eriterek bir lipid stok çözeltisi hazırlayın, ve 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosfoetanolamine-N-[methoxy(polietilen glikol)-2000] (18:1 PEG2000 PE) 25 mg/mL konsantrasyonu ile kloroform içine. Floresan boya konjuge lipid (TexasRed DHPE ve Cy5 DOPE) kloroform 1 mg/mL konsantrasyonda çözün. Lipid çözeltisini kloroform dirençli astarlı kehribar şişelerinde saklayın, politetrafloroetilen bantla daha da kapatılmış. Çözelti -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
- A ve B çözümleri yapın.
- Çözelti hazırlamak için lipid karışımı (son konsantrasyon 1 mg/mL) DOPC içeren (52.8 mol%), POPE (20 mol%), Karaciğer PI (7 mol%) ve kardiyolipin (%20 mol) ve %0.2 mol florofor.
- Dopc (47.8 mol%), POPE (%20 mol),karaciğer PI (%7 mol), kardiyolipin (%20 mol) içeren b çözeltisi (son konsantrasyon 1 mg/mL) yapın ve DOPE-PEG2000 (%5 mol) ve %0.2 mol florofor.
- Bir cam şırınga kullanarak kehribar şişeleri içine depolama çözeltisi hesaplanan hacmi ekleyerek lipid karışımı oluşturun. Şişelere ekstra kloroform ekleyerek son hacmi eşleştirin.
NOT: FCS (floresan korelasyon spektroskopisi) için, boya konjuge lipid oranını %0,002 mol'e düşürün ve geri kalanını DOPC ile değiştirin.
2. Lipid iki katlarının imalatı
- 30 dk için 520 °C'de mikroskop kapağı cam slaytlar pişirin. Piştikten sonra kapak slaytlarını oda sıcaklığına kadar soğutun.
- Yaklaşık 10 g sodyum hidroksit tartın ve karıştırırken 500 mL metanol ekleyin. 2 saat karıştırın, çökeltiler göstermeye başlayana kadar çözeltide sodyum hidroksit eklemeye devam edin. Tüm işlem sırasında uygun PPE taktığından emin olun.
- Cam slaytları %10 sodyum dodecyl sülfat çözeltisi ile temizleyin; metanol sodyum hidroksit ile doymuş; ve 50 mM hidroklorik asit, sırayla (30 dk için her koşulda banyo sonication). Cam kaydırağı her koşul arasında 10 dakika boyunca ultra saf suda temizleyin.
NOT: Cam kaydırağı hazırlama için taze çözümler kullanılması şiddetle tavsiye edilse de, her çözüm 5x'e kadar veya 1 ay içinde yeniden kullanılabilir( hangisi önce gelirse). Her kullanımdan önce çözeltiyi karıştırıp karıştırdığından emin olun. - İyi iki katmanlı kalite sağlamak için temizlenmiş camları 2 haftaya kadar HCl çözeltisinde saklayın. Ultra saf suda saklanırsa, bir hafta içinde slaytları kullanın.
- Langmuir-Blodgett daldırma sisteminin politetrafloroetilen yalakını kloroform ve ultra saf su kullanarak temizleyin. Yalak yüzeyinde sprey kloroform, selüloz mendil ile iyice silin 3x. Ultra saf su ile durulayın ve emme yoluyla su çıkarın. 3x'i tekrarlayın.
- Yalak yüzeyini temiz ultra saf suyla kaplayın.
- Temizleme çözeltisinden veya ultra saf sudan 2 adet yüzeyle işlenmiş kapak camı alın ve cam kaydırağı yaklaşık 30 s'lik ultra saf suyla durulayın.
- Kapak camı arka arkaya yerleştirin. Cam slaytları tutmak için substrat kelepçesini kullanın. Langmuir kontrol yazılımına elle "dipper aşağı" tıklayarak su yüzeyinin altına cam kaydırağı batırın.
- Sıfır film dengesi, dikkatle hava-su arayüzü(Şekil 2A)damla damla Çözeltisi B yayılıyor. Lipitlerin sadece hava-su arabiriminde yayıldıklarından emin olun, kloroform ve lipit damlacıkları politetrafloroetilen yüzeyinin dibine batmadan. Bunun sağlanamaması bir lipid "kanal" yaratacak ve tek katmanlı oluşumunu önleyecektir.
- ~ 15-20 mN/ m civarında film dengesi okuma kadar lipidler ekleyerek durdurun, ~ 10-15 dakika bekleyin. Film bakiyesi 37 mN/m'ye kadar "denemeleri başlat" seçeneğini tıklayarak yüzey alanını değiştirmek için bariyer denetleyicisini başlatın. ~ 20-30 dakika(Şekil 2B)için basınç tutun.
- Yüzey gerilimini 37 mN/m'de korurken kapak camı 22 mm/dak hızda kaldırın. Polimer tethering ile bir lipid monolayer Blodgett daldırma işlemi(Şekil 2C)ile kapak cam yüzeyine hava-su arabirimi transfer edilecektir . Bu lipid iki katmanlı alt broşür oluşturur.
- Hava-su arayüzünü emme ile temizleyin, yaylayı ultra saf suyla durulayın.
- Kullanmadan önce kloroform, etanol ve ultra saf su kullanarak tek kuyulu cam kaydırağı (örn. Shaefer kaydırağı) temizleyin. Temiz cam kaydırağı su tabakasının altında ultra saf su yla yalak üzerine ayarlayın. Kuyunun hava-su arayüzüne dönük olduğundan emin olun ve cam kaydırak tamamen kapsanakadar taze ultra saf su dökün. Adımı 2.8'i tekrarlayın.
- Silikon emme kabını kullanarak 2.4 adımdan itibaren kapak camı basılı tutun (monolayer tarafının emme kabından uzakta olduğundan emin olun), lipid monokatmanını hava-su arabirimine hafifçe itin, kapak camı ~2-3 s arabirimde tutun, ardından kapak camı kaydırağa doğru itin(Şekil 2D). Bir kapak slayt ile slayt dışarı atın.
NOT: Lipid çift katmanlı iki slayt(Şekil 2E)arasında sandviç alana bakan kapak-cam yüzeyinde tutulacaktır. - Bir epifloresan mikroskobu için iki katmanlı kapak cam alın. Görüntü lipid iki katmanlı. Lipid boyahomojen bir dağılım gözlenirse, 30 s için bilayer küçük bir alan photobleach, ~ 30 s-1 dk. için ışık kaynağı kapatın, sonra kurtarma gözlemlemek için tekrar görüntü. Lipid iki katmanlı floresan iyileşme gösterecektir.
NOT: Diğer deneylerde kusurları veya kötü floresan geri kazanımı olan membranlar kullanılmamalıdır.
Şekil 2: Polimer-tethered lipid çift katmanlı yapımında adımlar.
Langmuir-Blodgett daldırma(A-C)ve Langmuir-Schaefer transferi(D)tekniklerini kullanarak lipid iki katyapma adımları. (E) Lipid çift katmanlı içeren son "sandviç". Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Protein in polimer-tethered lipid bilayer içine reconstitution
- Ultra saf su içeren bir kristalizasyon çanak hazırlayın. Temiz bir mikroskop görüntü halkası hazırlayın ve yemeğin altına yerleştirin.
- Schaefer slayt "sandviç" batırın ve su altında lipid iki katmanlı içeren cam kapağı, yavaşça Schaefer slayt ve kapak cam ayırmak, alttan kapak cam slayt tutun, uzak iki katmanlı tarafında, görüntü halkaiçine kapak cam aktarın, görüntü halkası kapatın.
NOT: Lipid bilayer ile kapak cam her zaman suda olduğundan emin olun, ve halka iyi mühürlü. - Görüntü halkasındaki ultrasaf suyu Bis-Tris NaCl tamponu ile değiştirin, lipid çift katmanlı sının herhangi bir hava kabarcığına maruz kalmadığından emin olun. Lipid çift katmanlı 1.1 x 10-9 M n-Octyl-β-D-Glucopyranoside ekleyin. Hemen 1.2 x 10-9 M DDM ve 1.3 x 10-12 mol saflaştırılmış l-Opa136 karışımını görüntü halkasına ekleyin. Düşük hızda bir tezgah üstü shaker üzerinde inkübat numune2 saat(Şekil 3).
NOT: Deterjanlar yeniden oluşturulacak proteine bağlı olarak değişebilir. - 30 mg SM-2 Rekart boncukları 3 mL Bis-Tris tamponuna dağıtın ve uygulamadan önce sallayın. Görüntü halkasına 5~10 μL SM-2 Reçin boncuk eklemek için plastik bir pipet kullanın, 10 dakika kuluçkaya yatın, durulama yaparak reçin boncukları çıkarın. Görüntü halkasındaki arabelleğe son hacmi 1,5 mL'dir.
Şekil 3: L-Opa1'i polimer-tethered lipid iki katmanlı haline reconstituting prosedürü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Proteolipozomların hazırlanması
- 1 mg lipid karışımı A'yı kloroform çözeltisinde hazırlayın. 20 dakika azot akışı altında buharlaştırın kloroform ve vakum altında bir gecede tutmak ve bir lipid film oluşturur.
- 15,56 g kalsin ile 50 mL 1,5 mol NaOH çözeltisi eriterek tampon içeren 50 mM kalsin hazırlayın, calcein tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında karıştırın, 500 mL'lik son hacmine 12,5 mM Bis-Tris ve ultra saf su ilave edin. pH'ı 7,5 olarak ayarlayın.
- Tampon içeren kalsinlerde lipid filmini askıya alın, 65 °C'de süspansiyonu 20 dk ısıtarak lipidi tamamen nemlendirin. 200 nm lipozom polikarbonat membran kullanılarak ekstrüzyon ile oluşur.
- 0,5 μM DDM'de 2 μg l-Opa1 ila 0,2 mg lipozom ve 4 °C'de 1,5 saat kuluçkaya yatırın. 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl ve 50 mM kalsin tamponu ile 250 ml'ye karşı 3,5 kDa diyaliz kaseti kullanarak diyaliz ile sürfaktanları bir gecede 4 °C'de çıkarın ve tamponu iki kez değiştirin.
- PD-10 tuzsuzlama sütunu kullanarak ekstra kalsin çıkarın.
5. Görüntüleme ve veri analizi
- 100x yağ daldırma hedefi (N.A 1.4) kullanarak TIRF görüntüleri edinin. TexasRed-PE etiketli lipozomların ve kalsin kapsüllü proteoliposomes analizi için 543 nm lazer ve 488 nm lazer kullanın. Düzlemsel lipid çift katmanlı gömülü Cy5-PE analizi için 633 nm lazer kullanın.
- Maksimum emisyon elde etmek için bir lipid çift katmanlı kullanarak TIRF açısı hizalayın. 25 °C'de 100x yağ hedefi kullanılarak yeniden yapılanma sonrası lipid çift katmanlı kalitesi gözlenir. Fosfolipid ve yeniden oluşturulan çift katmanlı difüzyon katsayısı başka bir yerde açıklanan bir protokol ile FCS kullanılarak belirlenir37.
- Görüntü halkasına 10 mg/mL proteolipozom ekleyin ve görüntüden önce 10 dakika ayarlayın. GTP, GMPPCP veya GSYİh 1 mM MgCl2 ve 1 mM nükleotit ile reaksiyon halkasına eklenir.
- Membran füzyonunda s-Opa1'in etkisini belirlemek için, s-Opa1'i l-Opa1 içeren proteolipozom/destekli çift katmanlı bir örneğe titratve füzyon olaylarını kaydeder.
- TexasRed-DHPE ve kalsin eşzamanlı görüntüleme bir ışın-splitting sistemi ile elde edilir. Hem 488 nm hem de 543 nm lazerler unescent uyarma kaynakları olarak numuneye eş zamanlı olarak uygulanır. Emisyon ışığı daha sonra 560 nm'lik ışın ayırıcı kullanılarak bölünür. Bölünmüş emisyon ışığı daha sonra 42 nm bant genişliğine sahip 510 nm filtre ve 40 nm bant genişliğine sahip 609 nm filtre tarafından filtrelenir. Filtrelenmiş ışın, kamera çipi üzerinde iki bitişik alana yansıtılır.
- Floresan emisyon aynı anda 40 nm bant genişliğine sahip 609 emisyonlu filtre ve 70 nm bant genişliğine sahip 698 emisyonlu filtre ile kaydedilir. Mikroskop sistemi -10 °C'de muhafaza edilen bir CMOS kamera ile donatılmıştır.
- Lipozomların parçacık tanımlaması Gausstabanlı parçacık tanıma algoritması kullanılarak gerçekleştirilebilir. Parçacık dağılımı ve yoğunluğu kanal-kanal analiz edilir. Bir lipid çift katmanlı sinyal parçacıkları izole etmek için bir maske olarak kullanılır.
Representative Results
Yeniden yapılan transmembran proteini serbestçe yayılır ve homojen bir şekilde membrana dağılır.
Epifloresan mikroskobu ile doğrulanan lipid çift katmanlı örnek görüntüleri ve lipid akışkanlığı Şekil 4'tegösterilmiştir. Fotobeyaztlama öncesi ve sonrası iki katmanlı lipid dağılımı Şekil 4A,B'degösterilmiştir. Lipid çiftabinin homojenliği rekompansusöncesi ve sonrası epifloresan mikroskobu kullanılarak görselleştirildi (Şekil 4D,E). lipid iki tabakasında yeniden oluşturulan l-Opa1 floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) ile doğrulandı. Biz çift katmanlı lipid diffusivity değerlendirmek için boya konjuge lipidler kullanın. Yeniden oluşturulmuş Opa1 floresan etiketli anti-Opa1 C-terminal antikor kullanılarak etiketlenmiştir. Çift katmanlı lipid difüzyonu 1.46 ± 0.12 μm2/s olarak ölçülürken, çift katmanlı yeniden oluşturulan l-Opa1 difüzyon katsayısı 0.88 ± 0.10 μm2/solarak ölçüldü. FCS eğrilerinden alınan yoğunluk okuması, l-Opa1'in %75'inin lipid çift katmanlı olarak yeniden oluşturulduğun belirtildiği gibi(Şekil 4G,H). Bu sonuçlar, l-Opa1'in polimer-tethered lipid iki katmanlı serbestçe yaydığını ve fonksiyonel komplekslere kendi kendini birleştirme potansiyeline sahip olduğunu göstermektedir.
Şekil 4: Model membranda lipid ve yeniden protein dağılımı.
(A-C) Epifloresan mikroskopisi ile doğrulanan lipid çift katmanlı ve lipid akışkanlığı örnek görüntüler. (A) Fotobeyaztlama dan önce çift katmanlı homojen lipid dağılımı. (B) Fotobeyaztlamadan hemen sonra anlık görüntü. (C) Floresan iyileşme den sonra görüntülanan çift katmanlı reconstitution aşağıdaki membran iyi lipid akışkanlığı gösterir. (D,E) Lipid dağılımının (D) öncesi ve sonrası(E) l-Opa1 reconstitution'ının temsili görüntüleri, yeniden yapılanma işleminin çift katmanlı da kusuryaratmadığını göstermektedir. Alexa 488 konjuge antikor(F)ile etiketlenmiş l-Opa1'in temsili TIRF görüntüsü, yeniden yapılanma üzerine Opa1'in homojen dağılımını gösterir. G. Floresan korelasyon spektroskopisi ile l-Opa1 sinyalinin temsili ham foton sayıları. Kontrolde, iki katmanlı olarak l-Opa1'i yeniden oluşturulmazken, antikor eklenmiş ve durulanmama meydana gelen bir yapıya bürünmemiş. l-Opa1 difüzyonu membrandaki lipidlerden önemli ölçüde daha yavaştır ve transmembran l-Opa1(H)ile başarılı bir şekilde yeniden yapılandırılması ile tutarlıdır. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Floresan adım ağartma, l-Opa1'in ortalama 2-3 kopyasının belirli bir lipozomda yeniden oluşturulduğun belirtilmesi(Şekil 5A,B). Opa1 reconstituted proteoliposomes boyut dağılımı DLS(Şekil 5C)kullanılarak yeniden yapıldıktan sonra test edildi. Proteolipozomlarda Opa1'in yeniden yapılandırılması da FCS kullanılarak doğrulandı. Serbest antikor difüzyon katsayısı 164 ± 22 μm2/s; lipid boyaile etiketlenmiş lipozomlar için difüzyon katsayısı 2.22 ±20.33 μm 2/s, TexasRed etiketli antikora bağlı l-Opa1 proteoliposomlarının difüzyon katsayısı 2,12 ± 0,36 μm2/sidi.
Şekil 5: Proteolipozomların imalatı ve karakterizasyonu.
(A) Kapsüllü, sönülmüş kalsin ile proteoliposomes imal adımlar. (B) Floresan adım beyazlatmanın temsili verileri, lipozomda gömülü l-Opa1'in ortalama 2-3 kopyasını göstermektedir. (C) GTP kuluçkadan sonra nükleotit 1 saat (yeşil) olmaksızın proteolipozomların (kırmızı) temsili boyut dağılımları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Membran tethering, lipid demixing / hemifüzyon ve floresan mikroskopi ile gözenek açılması tespiti.
Membran tethering TIRF mikroskopi kullanılarak lipid bilayer yüzeyinde TexasRed sinyali gözlemleyerek izlenir(Şekil 6A). Membran lipid demiksleme (hemifüzyon) davranışı, boya nın lipozomlardan lipid bilayer'a yayılmasıyla TexasRed ile izlendi. Calcein dequenching sadece lipid demixing tam füzyon gözenek oluşumu ayırt yardımcı olur. Bu, parçacıkların hemifüzyonda durakladığı koşullar (Şekil 6B) ile tam füzyona geçen parçacıklar arasında karşılaştırma yapılmasına olanak sağlar(Şekil 6C).
Membran tethering lipozomlardan gelen kararlı lipid sinyali ile gösterilir. Uzaklık, iki membranın etiketleri arasındaki FRET sinyaline göre değerlendirilebilir36. Hemifüzyon sinyali kalsin sinyalinde(Şekil 6B, alt sıra) dequenching özelliği bulunmaz, ancak TexasRed sinyalinin hızlı bir çürümesi boyanın lipid çift katmanlı yayılımını gösterir(Şekil 6B üst sıra). Tam füzyon (gözenek açma ile) hem lipid çürümesi ve içerik salınımı özellikleri(Şekil 6C). TexasRed yoğunluğu ve kalsalın yoğunluğu membran füzyon kinetik için nicel detay sağlamak için zamana bağlı bir şekilde izlenebilir36.
Şekil 6: Parçacık tethering (A, ölçek çubuğu 10 μm), hemifüzyon (B, ölçek çubuğu 0,5 μm) ve füzyon (C, ölçek çubuğu 0,5 μm) gösteren temsili sonuçlar.
(A) Proteoliposomes GTP eklenmeden önce Opa1-reconstituted lipid bilayer bağlı. (B) Hemifüzyon örneği. B'deki üst sıra lipid demixingi (TexasRed sinyali, kırmızı), B'deki alt sıra bu koşullar altında hiçbir içerik salınımı (calcein sinyali, yeşil) göstermez. (C) Lipid çift katmanlı proteolipozom erime temsili bir iz. İçerik salınımı, kalsin inin (alt sıra, yeşil) dequenching gösteren alt satırında görüntülerden görülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
In vitro model-membran sistemleri iyi tanımlanmış koşullar altında karmaşık membran süreçlerini tanımlayabilir. Bu sistemler moleküler mekanizmalarıortayaçıkarmak için karmaşık moleküler süreçler için gerekli minimal bileşenleri ayırt edebilirsiniz 6,15,20,38. Membran proteinleri için lipozomlar ve düzlemsel destekli iki tabakalar yaygın yeniden yapılanma sistemleridir. Katı destekli lipid iki katmanlı aksine, polimer-bağlı iki katmanlı substrat ve desteklenen membran arasındaki polimer yastık büyük membran proteinlerinin serbest hareketlilik sağlar, ve transmembran-proteinler diffüz ve serbestçe monte34. Bu özellikler mitokondri iç zar füzyon36kinetik araştırmak yardımcı oldu.
Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS) tekniklerini kullanarak polimer-tethered lipid bilayer hazırladık. Bu bize asimetrik lipid bileşenleri ile bir iki katmanlı hazırlamak için izin verir. Hücresel membranlar asimetrik broşür bileşimi var, ve LB / LS yaklaşımı gibi iki katmanlı çalışma sağlar. Schaefer transferi ile, bütün bir cam substrat bir lipid iki katmanlı ile kaplı olabilir. İki katmanlı hazırlık için temiz bir yüzey hazırlamak çok önemlidir. Ayrıca, doğru bir Schaefer transferi gerçekleştirmek için uygulama alır. Başarısız Schaefer transferi bir lipid bilayer istenmeyen kusurları oluşturabilirsiniz. Bu protokolde, film dengesine eklenen basınç %20 kardiyolipin içeren iki katmanlı bir basınç için geçerlidir. Diğer bileşenlere sahip iki katmanlar için, temel bileşenlerin yüzey basınç alanı isotherm bakın. Alternatif bir yöntem Langmuir-Blodgett / vezikül füzyon (LB / VF) yöntemi, alt lipid monolayer temiz bir substrat üzerine bir Langmuir yalak hava-su arabiriminden aktarılır nerede, sonra lipozomlar desteklenen lipid monolayer üstüne sigorta ve son iki katmanlı formu39. LB/VF yöntemini kullanan membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması LB/LS'den daha basittir, çünkü proteolipozomların füzyonu ile reconstitution yapılabilir. Ancak, vezikül füzyonu aşırı lipozomların eklenmesini gerektirir, bu da konsantrasyona bağımlı protein-protein etkileşimlerine bağlı membran olaylarının çalışmasını zorlaştırabilir.
Transmembran proteinlerinin hem polimer-tethered lipid iki katmanlı hem de lipozomlar içine başarılı bir şekilde yeniden yapılandırılması, tercih edilen fonksiyonel oryantasyonda önemlidir, ancak uygulanması zordur. Bunu hesaba katmak için deneysel kontrollere ihtiyaç vardır. Polimer-tethered lipid iki katları için, aynı zamanda reconstitution sırasında lipid iki katmanlı bütünlüğünü korumak için önemlidir. Sürfaktan konsantrasyonları lipid iki katmanlı çözülmesini önlemek için nispeten düşük tutulmalıdır, ancak ilgi protein denatürasyon önlemek için yeterince yüksek37,40. Burada açıklanan yöntem, membran proteinlerinin tek moleküllü çalışmalar için yeniden konumlandırması için idealdir, ancak daha büyük ölçekli çalışmalar için ölçeklenebilir olması gerekmez. Sürfaktan seçimi bir diğer önemli husustur. Sık sık, saflaştırma ve depolama için kullanılan yüzey aktif iyi bir başlangıç noktasıdır. Yüzey aktif madde maksimum konsantrasyonu genellikle ~ 200 kez daha az CMC36, yüzey aktif protein kararlılığını korur ve protein toplama önler bir aralıkta, membran bütünlüğünü korurken36. 2 veya 3 yüzey aktif madde içeren kokteyller düşünülebilir. Lipozomlara yeniden yapılabilmesi için düşük konsantrasyonda yüzey aktif madde ye gerek yoktur. Ancak, CMC altında yüzey aktif konsantrasyonları lipozomlar için tek tip boyutu ve morfoloji dağılımı korumak için tercih edilir. İçerik boyasının kaçmasını önlemek için, boya içeren arabelleğe karşı diyaliz edersiniz.
Lipozom bazlı füzyon testlerinin aksine, kurduğumuz platform membran füzyonunun her adımının kinetiklerini araştırmak için bir yaklaşım sağlar. Bu yöntem, transmembran füzyon proteinlerini yakın yerli koşullarda inceleme olanağı sağlar. Model membran platformları membran protein montajı ve oligomerizasyon, membran "heykel" ve mitokondriyal iç membran gibi hücrealtı ortamlarda proteinlerin protein-lipid etkileşimleri çalışma için uygulanabilir. Bu yöntem aynı zamanda membran-protein etkileşiminde iki katmanlı kompozisyon asimetrisi gibi önemli fizyolojik koşulların araştırılmasına da olanak sağlar. Hem lipozomların hem de polimer destekli iki katmanlı özelliklerinde önemli bir mitokondriyal lipid, kardiyolipinin rolü tanımlanmamıştır. Iyonik mukavemet, membran kalınlığı, membran sertliği, membran eğriliği ve membran elastik viskozite özellikleri gibi özellikler proteinlerin belirli fonksiyonel durumlara uyuma yeteneğini etkileyebilir. Model membran sistemlerini yaratıcı bir şekilde uygulayan ileride yapılan çalışmalar, membran protein organizasyonu ve işlevinin yeni yönlerini ortaya çıkarabilecek potansiyele sahiptir.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Yazarlar Charles H. Hood Vakfı Çocuk Sağlığı Araştırma Ödülü ve Massachusetts Genel Hastanesi Moleküler Biyoloji Bölümü cömert destek destek kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
| 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
| Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
| Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
| Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
| Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
| Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
| FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
| Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
| GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
| Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
| L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
| Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
| n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
| PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
| Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
| Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
| Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
| Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |
References
- Sackmann, E. Biological membranes architecture and function. Structure and Dynamics of Membranes. Lipowsky, R., Sackmann, E. 1, Elsiever. 1-63 (1995).
- Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118, Pt 6 1099-1102 (2005).
- Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).
- Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations. Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).
- Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
- Chan, Y. H., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Biswas, K. H., Groves, J. T. Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies. Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).
- Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications. Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).
- Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).
- Kiessling, V., et al. Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes. Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).
- Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion. Nature Communication. 7, 11401 (2016).
- Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophysical Journal. 101 (8), 37 (2011).
- Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion. Elife. 3, 04389 (2014).
- Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions. Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).
- Sezgin, E., Schwille, P. Model membrane platforms to study protein-membrane interactions. Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).
- Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures. Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).
- Dutta, D., Kam, L. C. Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems. Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).
- Groves, J. Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology. BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. , Springer. Boston, MA. (2006).
- Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers. Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).
- Wang, N., Rapoport, T. A. Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions. Journal of Cell Science. 132 (4), 227611 (2019).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).
- Chan, D. C. Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health. Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Wai, T., Langer, T. Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation. Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).
- Chen, H., et al. Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development. Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).
- Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1. EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).
- Anand, R., et al. The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission. Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).
- Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation. Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).
- Baker, M. J., et al. Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics. EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).
- DeVay, R. M., et al. Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion. Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).
- Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress. Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).
- Ban, T., et al. Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin. Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).
- Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
- Shilts, K., Naumann, C. A. Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates. Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).
- Ge, Y., et al. Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane. Elife. 9, 50973 (2020).
- Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).
- Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level. Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).
- Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures. Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).
