Summary
Rapporteret her er et system til calciumbilleddannelse i frit at opføre caenorhabditis elegans med velkontrolleret, ikke-lokaliseret vibration. Dette system gør det muligt for forskere at fremkalde ikke-lokaliserede vibrationer med velkontrollerede egenskaber ved nanoskala forskydning og kvantificere calciumstrømme under reaktioner fra C. elegans på vibrationerne.
Abstract
Ikke-lokaliserede mekaniske kræfter, såsom vibrationer og akustiske bølger, påvirker en lang række biologiske processer fra udvikling til homeostase. Dyr klare disse stimuli ved at ændre deres adfærd. Forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for en sådan adfærdsændring, kræver kvantificering af neural aktivitet under adfærd af interesse. Her rapporterer vi en metode til calciumbilleddannelse i frit at opføre Caenorhabditis elegans med ikke-lokaliserede vibrationer af specifik frekvens, forskydning og varighed. Denne metode tillader produktion af velkontrollerede, ikke-lokaliserede vibrationer ved hjælp af en akustisk transducer og kvantificering af fremkaldte calciumresponser ved enkeltcelleopløsning. Som et bevis på princippet demonstreres calciumresponset fra en enkelt interneuron, AVA, under C. elegans flugtrespons på vibrationer. Dette system vil lette forståelsen af neurale mekanismer, der ligger til grund for adfærdsmæssige reaktioner på mekaniske stimuli.
Introduction
Dyr udsættes ofte for ikke-lokaliserede mekaniske stimuli såsom vibrationer eller akustiske bølger 1,2. Fordi disse stimuli påvirker homeostase, udvikling og reproduktion, skal dyr ændre deres adfærd for at klare dem 3,4,5. Imidlertid er de neurale kredsløb og mekanismer, der ligger til grund for en sådan adfærdsændring, dårligt forstået.
Mekanosensorisk adfærd i nematoden, Caenorhabditis elegans, er et simpelt adfærdsmæssigt paradigme, hvor orme normalt ændrer adfærd fra fremadgående bevægelse til et baglæns flugtrespons, når de støder på ikke-lokaliseret vibration6. Det neurale kredsløb, der ligger til grund for denne adfærd, består primært af fem sensoriske neuroner, fire par interneuroner og flere typer motorneuroner 7,8. Derudover er orme vant til sådanne mekaniske stimuli efter adskilt træning, der involverer gentagen stimulering 9,10,11. Derfor udgør denne enkle adfærdsmæssige reaktion et ideelt system til at undersøge neurale mekanismer, der ligger til grund for både ikke-lokaliseret vibrationsdrevet adfærd og hukommelse. En protokol for calciumbilleddannelse i frit opførende orme under påvirkning af ikke-lokaliserede vibrationer er illustreret. Sammenlignet med tidligere rapporterede systemer er dette system simpelt, fordi det ikke kræver et ekstra kamera til sporing; det giver os dog mulighed for at ændre frekvensen, forskydningen og varigheden af ikke-lokaliserede vibrationer. Fordi aktivering af AVA-interneuronerne inducerer det bagudrettede flugtrespons, blev orme, der samtidig udtrykker GCaMP, en calciumindikator, og TagRFP, et calcium-ufølsomt fluorescerende protein, under kontrol af en AVA-specifik promotor brugt som et eksempel (se Tabel over materialer for detaljer). Protokollen demonstrerer aktiveringen af AVA-neuroner, når en orm skifter fra fremadgående til baglæns bevægelse. Denne protokol letter forståelsen af den neurale kredsløbsmekanisme, der ligger til grund for mekanosensorisk adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyrkning af orme indtil calciumbilleddannelse
- Fire dage før et calciumbilleddannelseseksperiment overføres to voksne ST12-orme til en ny nematodevækstmediumplade (Table of Materials), hvorpå Escherichia coli OP50 stribes i et firkantet mønster (ca. 4 mm x 4 mm) ved hjælp af en cellespreder, så ormen tilbringer det meste af tiden i bakterierne under calciumbilleddannelse12.
- Inkuber denne NGM-plade i 4 dage ved 20 °C i en inkubator (Table of Materials).
2. Opsætning af hardware
- Forbered et mikroskop udstyret med en piezoelektrisk enhed til stimulering13, en 2x objektivlinse, et højhastigheds sCMOS-kamera, billedopdelingsoptik, et x-y motoriseret stadium, en LED-lyskilde til excitation, og en computer (figur 1). Væsentlige specifikationer for sCMOS-kameraet inkluderer 2560 x 2160 aktive pixels, 6,5 μm i størrelse, med et 10-tryks kameralink som en grænsefladeindstilling. Nøglespecifikationerne for X-Y motoriseret trin omfatter 110 mm x 75 mm vandringsområde, 250 mm / s maksimal hastighed, 2.000 mm / s2 max acceleration og 0,25 μm ensrettet repeterbarhed.
- Tænd computeren og x-y motoriseret scenecontroller.
- Tænd for forstærkeren, og indstil lydstyrkejusteringen til 10 og bas- og diskantjusteringerne til 8.
- For at ophidse GCaMP og TagRFP skal du tænde 488 nm og 560 nm lysene på LED-lyskilden. Indstil målerne på 470 nm og 550 nm af kontrolkapslen i lyskilden til 5%, så LED-lysets intensitet er egnet til billeddannelse.
BEMÆRK: Ved denne LED-intensitet forekommer fotoblegning af GCaMP og TagRFP fluorescens ikke under optagelse.
3. Softwareopsætning til calciumbilleddannelse
- Download og installer tre softwarepakker i Windows: musemakrosoftware, software til styring af vibrationsegenskab, software til kørsel af sporingssoftware og software til dataanalyse (Table of Materials).
- Dobbeltklik på sporingssoftwarefilen.
- Tryk på knappen Kør , og vent i 5 minutter for at stabilisere softwaren (figur 2A).
- Angiv oplysninger om eksponeringstid og binning. 0,033 s eksponeringstid med 2 x 2 binning sikrer jævn billedoptagelse (figur 2B).
BEMÆRK: Kun hvert 10. billede, der er erhvervet, vises for at reducere hukommelsesbelastningen. - Angiv oplysningerne til billedoptagelse (figur 2C). Når 500 billeder f.eks. optages to gange med et interval på 10 sekunder, skal du indtaste 1.000 i feltet Billeder i alt, 500 i feltet Billeder og 10 i feltet Interval(er).
- Tænd for knappen Anskaffelse (figur 2D).
- Opdel fluorescensbilledet ved hjælp af billedopdelingsoptik og de to billeder (GCaMP-kanal, 500-525 nm (figur 2E); TagRFP-kanal, 584-676 nm (figur 2F)) projiceres på to halvdele af sCMOS-kameraet. Kalibrer koordinaterne for GCaMP- og TagRFP-kanalerne (figur 2G). Gem softwareindstillingerne.
- Indstil mappen til at udsende datafilen (figur 2H).
- Sluk for knappen Anskaffelse (figur 2D).
- Dobbeltklik på musens makrosystemsoftware (figur 3A), og indstil vibrationsegenskaberne (figur 3B). Læs assay.txt filen med musemakrosystemet, så musemarkøren styres ud fra koordinaterne og tidsplanen i den pågældende fil (figur 3A). Indstil musemarkørens koordinater (magenta-firkanter i figur 3A), og vent tiden til stimulering efter start af optagelsen (magenta i figur 3A). Indstil frekvens- og amplitudeværdierne i softwaren til vibrationskontrol (figur 3B).
4. Forberedelse af orme til calciumbilleddannelse
- Overfør en enkelt orm, der udtrykker både GCaMP og TagRFP fra den inkuberede plade til en ny frisk NGM-plade, hvorpå E. coli OP50 er blevet stribet.
- Fastgør NGM-pladen til den piezoelektriske akustiske transducer ved hjælp af gennemsigtig tape (figur 4). Tryk ikke pladen på aktuatoren, da dette ændrer vibrationsfrekvensen.
5. Calciumbilleddannelse under kontrol af specifikke vibrationsegenskaber
- Tænd for knappen Anskaffelse (figur 2D).
- Find ormen under stærkt lys og excitationslys (488 nm og 560 nm).
- Indstil zoomværdien for mikroskopi til 2,5x. Synsfeltet er 1,1 mm x 1,1 mm med en opløsning på 2,6 μm/pixel.
- Sluk for det skarpe lys, og tænd for Homing-knappen (figur 2I) for at spore den fluorescerende plet på en orm. Denne homing-knap starter bevægelsen af X-Y-scenen for at holde ormens maksimale intensitetsområde midt i synsfeltet i TagRFP-billedet.
BEMÆRK: Med hensyn til flp-18-promotoren er AVA-neuronernes fluorescerende intensitet stærkest, og dem fra andre neuroner er svage eller ikke detekteret. Derfor er det lave forstørrelsessystem ikke nødvendigt til sporing, og scenen bevæger sig gennem hele optagelsen. - Sørg for, at værdierne for intensitetsbjælkerne i figur 2E og 2F er ca. 1.000. Hvis de ikke er det, skal du finjustere målene på 470 nm og 550 nm på styresensoren i lyskilden.
- Tryk på knappen Kør i musens makrosystem for at tillade musemarkørkontrol i henhold til en tidsplan beskrevet i figur 3A. Dette begynder at optage ved hjælp af sporingssoftwaren og stimulere ved hjælp af bølgegensoftware, mens du sporer ormen.
- Kontroller, om output BMP-filen er korrekt oprettet.
6. Analyse af data
- Opret en mappe på skrivebordet, og navngiv den CalciumImaging.
- Opret en mappe inde i mappen CalciumImaging, og navngiv den CIResult for outputresultatfilerne.
- Dobbeltklik på filen DualViewImaging.nb skrevet i dataanalysesoftware til Windows.
- Indsæt filstien i CIResult-mappen (f.eks. DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (figur 5).
- Indsæt filstien i mappen, herunder BMP-filen (f.eks. SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (figur 5), hvor XXX angiver mappenavnet inklusive BMP-filer.
- Tryk på Shift- og Retur-tasterne samtidigt for at starte en automatisk analyse. Denne analyse bruger værdien af et område med maksimal intensitet af synsfeltet i TagRFP-billedet (se forklaringen til figur 6 for detaljeret beregningsprocedure i programmet).
- Kontroller, om følgende outputfiler er oprettet korrekt i CIResult-mappen.
XXX-GCaMP.tif (billedfil, der illustrerer spor af GCaMP-intensiteter for alle billeder)
XXX-GCaMP.xls (regnearksfil med GCaMP-intensiteter på alle billeder)
XXX-TagRFP.tif (billedfil, der illustrerer spor af intensiteter af TagRFP for alle billeder)
XXX-TagRFP.xls (regnearksfil med TagRFP-intensiteter på alle billeder)
XXX-Ratio.tif (billedfil, der illustrerer spor af forholdsværdien for alle billeder)
XXX-Ratio.xls (regnearksfil med angivelse af forholdsværdien på alle billeder)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her bruges en orm, der udtrykker både GCaMP og TagRFP under kontrol af den AVA interneuron-specifikke promotor, som et eksempel på calciumbilleddannelse i frit at opføre C. elegans. GCaMP- og TagRFP-kanaldata blev opnået som en række billeder, hvoraf nogle er vist i figur 6 og som en film (supplerende film 1). Forskydningen af Petri-pladen induceret af vores ikke-lokaliserede vibrationssystem (figur 7) blev også kvantificeret. Forskydningen kan styres ved at indstille amplitudeværdien i softwaren til vibrationskontrol (figur 3B) og volumenjusteringen i forstærkeren (figur 4), mens frekvensen reguleres ved at indstille frekvensværdien i softwaren (figur 4). I de vellykkede eksperimenter blev der observeret et forbigående calciumrespons af AVA-neuroner ved stimulering med vibrationer med en frekvens på 630 Hz og en forskydning på ca. 4,5 μm i 1 s, hvilket indikerer, at AVA-neuronen blev aktiveret under en orms bagudgående reaktion på den ikke-lokaliserede stimulering (figur 6). Baselines af både GCaMP- og TagRFP-signaler viste også, at der næsten ikke skete fotoblegning under optagelsen.
Figur 1: En skematisk systemkonfiguration. En NGM-plade, hvorpå en orm bevæger sig frit, holdes på en akustisk transducer. Excitationslys (488 nm og 560 nm) udsendes fra en LED-lyskilde. GCaMP og TagRFP fluorescerende emissioner opdeles af billedsplittende optik, således at hver fluorescerende emission projiceres på halvdelen af et sCMOS-kamera. Sporingssoftware styrer x-y motoriseret fase for at spore ormens fluorescerende plet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skærmbillede af softwaren til sporing af en fluorescerende plet af en orm. (A) Knappen Kør til aktivering af softwaren. (B) Bokse til indstilling af billedvisningscyklus, eksponeringstid(er) og binning i hver kanal. (C) Bokse til tilvejebringelse af oplysninger om billedoptagelsescyklussen. (D) Knappen Anskaffelse for at starte livestreaming. (E) GCaMP-billede. (F) TagRFP-billede. (G) Et panel til kalibreringskoordinater mellem GCaMP- og TagRFP-billeder. (H) Boks til indstilling af filsti. (I) Homing-knappen for at starte ormsporing. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Foto af musens makrosystem og software til styring af vibrationer. (A) Magenta-firkanten angiver koordinaterne for musemarkøren. Betydningen af hver scriptlinje forklares i magenta bogstaver. (B) GUI (grafisk brugergrænseflade) af software til styring af vibrationer. Vibrationsfrekvens- og amplitudeværdier styres ved hjælp af denne GUI. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Foto af NGM-pladen, der holdes på den akustiske transducer ved hjælp af gennemsigtigt tape. Kun en enkelt orm bevæger sig på pladen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Foto af dataanalysesoftwaren. Magenta og blå understregninger angiver stierne til henholdsvis CIResult-mappen og mappen inklusive BMP-filer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Spor af intensiteterne af GCaMP (A) og TagRFP (B) fluorescens og forholdsændringen (C,D). (A -C) De repræsentative spor for GCaMP-signal, TagRFP-signal og forholdsændringer for en enkelt orm. Forholdsændringen beregnes ved hjælp af filen DualViewImaging.nb som følger. Koordinaten, hvor intensiteten af TagRFP-fluorescens er maksimal, efter at baggrundssubtraktion ekstraheres for hvert billede. Dette TagRFP-signal tjener til at kompensere for fokusændringer forårsaget af dyrets bevægelse. Den maksimale fluorescensintensitet af GCaMP inden for den ekstraherede koordinat ±10 pixels beregnes som GCaMP-signalintensiteten for hvert billede. For ratiometri beregnes ((IGCaMP − IGCaMP_BG) − (ITagRFP − ITagRFP_BG)) / (ITagRFP − ITagRFP_BG), hvor IGCaMP og ITagRFP er henholdsvis GCaMP- og TagRFP-signalerne fra AVA-neuronen, og jegGCaMP_BG og jegTagRFP_BG er henholdsvis baggrundssignalerne. Denne beregningsproces blev anvendt på alle billeder for at kvantificere forholdsændringen i en tilbageførselshændelse. Den lodrette linje ved 5 s i alle spor angiver stimuleringsperioden. D) Det gennemsnitlige forhold ændres for 15 orme. Fejllinjen angiver SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Forholdet mellem parametre. (A) Udskiftninger blev målt hver 100 Hz ved hjælp af et laser doppler vibrometer, hvor amplitudeværdien i softwaren og VOLUME-justeringsværdien i forstærkeren blev fastsat til henholdsvis 0 og 10. Resonansfrekvensen blev observeret mellem 100-200 Hz, hvilket svarede til den værdi, der er beskrevet i specifikationen af den akustiske transducer. (B) Frekvenser og forskydninger blev styret af henholdsvis softwaren (område; 100 til 1000 Hz) og forstærkeren (område: 1-10) og målt ved hjælp af et laser doppler vibrometer. Den amplitudeværdi, der er valgt af softwaren, er angivet for hver frekvens. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende film 1: En repræsentativ film for calciumtransienter i en AVA interneuron af en frit opførende orm som reaktion på en 630 Hz ikke-lokaliseret vibration. Stimulering blev fremkaldt 5 s efter start af optagelsen. GFP blev også udtrykt i tarmen af ormen som en co-injektionsmarkør for GCaMP. Denne GFP-fluorescens påvirker ikke signalintensiteten af GCaMP. Skalalinjen er også angivet i det første billede. Ormens retning er angivet øverst til højre efter det første billede. Windows-medieafspilleren er velegnet til afspilning af AVI-filen, men den kan også afspilles ved hjælp af nogle gratis downloadede medieafspillere, såsom VLC-medieafspiller på Mac.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generelt kræver kvantificering af neural aktivitet indførelse af en sonde og / eller begrænsninger på dyrs kropsbevægelse. For undersøgelser af mekanosensorisk adfærd udgør den invasive introduktion af en sonde og begrænsninger i sig selv mekaniske stimuli. C. elegans giver et system til at omgå disse problemer, fordi dets funktioner er gennemsigtige, og fordi det har et simpelt, kompakt neuralt kredsløb, der kun består af 302 neuroner. Ved at kombinere disse fordele med den tidligere udviklede metode til at fremkalde ikke-lokaliserede vibrationer af nanoskalaforskydning13, illustreret her er en metode til ikke-invasiv calciumbilleddannelse af uhæmmede C. elegans, der reagerer på kontrolleret vibration.
Egenskaber ved mekaniske stimuli er defineret af flere parametre, såsom frekvens, forskydning og varighed. For nylig er biotremologi opstået som et nyt forskningsfelt1. Hovedformålet med sådanne undersøgelser er at forstå mekanismer, der ligger til grund for organismers produktion, spredning og modtagelse af mekaniske vibrationer, og disse vibrationers indflydelse på adfærd. Mange dyr, herunder mennesker, bruger vibrationer og akustiske bølger til at overvåge det omgivende miljø. For eksempel registrerer skorpioner bytte gennem substratbårne vibrationer14. Derfor er vibrationer et kommunikationsværktøj med det omgivende miljø. Metoden beskrevet her kan bruges til at styre inputparametre og til at kvantificere neurale reaktioner på enkeltneuronniveau, hvilket fører til oprettelse af et fasediagram, der beskriver input-output-forholdet. Baseret på sådanne fasediagrammer kan vi få indsigt i, hvilke parametre der påvirker specifikke neurale kredsløb, og ved hvilke mekanismer dyr håndterer mekaniske vibrationer.
Siden 200715 er der udviklet flere systemer til enkeltneuron calciumbilleddannelse i frit bevægelige C. elegans. Disse systemer har primært fokuseret på neuronale reaktioner på temperatur 15,16, lugtstoffer16,17 og berøringsstimuli17. Med hensyn til ikke-lokaliserede vibrationer er metoden til at tappe på en Petri-plade længe blevet anvendt til kvantificering af adfærdsmæssige reaktioner. At banke på en Petri-plade på et motoriseret x-y-trin fik imidlertid det fluorescerende sted til at forlade synsfeltet, hvilket førte til manglende spor af en frit opførende orm. Derfor blev den piezoelektriske akustiske transducer indlejret, som fremkalder ikke-lokaliseret vibration over z-aksen, i sporingssystemet. Denne metode tillader udførelse af reproducerbare eksperimenter til kvantificering af neuronale reaktioner på ikke-lokaliserede vibrationer.
De demonstrerede metoder giver også mulighed for yderligere metodologisk udvidelse. Da den nuværende protokol kun kan fange svar fra en enkelt neuron i to dimensioner, bør autofokussystemet være udstyret i fremtiden for at forhindre tab af fokus. På den anden side, fordi flere volumetriske billeddannelsesmetoder for nylig er blevet udviklet ved hjælp af C. elegans 18,19,20,21, bør udvidelse af tilgangen til volumetrisk billeddannelse muliggøre ikke-invasiv kvantificering af flere neuroner22 eller endda hele hjernen 18,19,20,21 , som reaktion på vibrationer med kontrollerbare egenskaber. Et sådant system kan anvendes på det nyligt etablerede system til at undersøge mekanismer, der ligger til grund for kollektiv adfærd23. Derfor vil yderligere biologiske anvendelser og udvidelser af metoden sandsynligvis gøre det muligt for os at forstå neurale mekanismer, der ligger til grund for mekanosensorisk adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Caenorhabditis Genetics Center for at levere de stammer, der anvendes i denne undersøgelse. Denne publikation blev støttet af JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), om innovative områder "Science of Soft Robot" -projektet (Bevillingsnr. JP18H05474), PRIME fra Japan Agency for Medical Research and Development (bevillingsnummer 19gm6110022h001) og Shimadzu Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
- Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
- Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
- Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
- Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
- Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
- Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
- Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
