Summary
Aquí se informa un sistema para imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans que se comportan libremente con vibración bien controlada y no localizada. Este sistema permite a los investigadores evocar vibraciones no localizadas con propiedades bien controladas a un desplazamiento a nanoescala y cuantificar las corrientes de calcio durante las respuestas de C. elegans a las vibraciones.
Abstract
Las fuerzas mecánicas no localizadas, como las vibraciones y las ondas acústicas, influyen en una amplia variedad de procesos biológicos desde el desarrollo hasta la homeostasis. Los animales hacen frente a estos estímulos modificando su comportamiento. Comprender los mecanismos subyacentes a dicha modificación del comportamiento requiere la cuantificación de la actividad neuronal durante el comportamiento de interés. Aquí, informamos un método para la obtención de imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans de comportamiento libre con vibración no localizada de frecuencia, desplazamiento y duración específicos. Este método permite la producción de vibraciones bien controladas y no localizadas utilizando un transductor acústico y la cuantificación de las respuestas de calcio evocadas a resolución de una sola célula. Como prueba de principio, se demuestra la respuesta de calcio de una sola interneurona, AVA, durante la respuesta de escape de C. elegans a la vibración. Este sistema facilitará la comprensión de los mecanismos neuronales subyacentes a las respuestas conductuales a los estímulos mecánicos.
Introduction
Los animales suelen estar expuestos a estímulos mecánicos no localizados como vibraciones u ondas acústicas 1,2. Debido a que estos estímulos influyen en la homeostasis, el desarrollo y la reproducción, los animales deben modificar sus comportamientos para hacerles frente 3,4,5. Sin embargo, los circuitos neuronales y los mecanismos que subyacen a dicha modificación del comportamiento son poco conocidos.
El comportamiento mecanosensorial en el nematodo, Caenorhabditis elegans, es un paradigma conductual simple, en el que los gusanos generalmente cambian el comportamiento de un movimiento hacia adelante a una respuesta de escape hacia atrás cuando se encuentran con vibración no localizada6. El circuito neuronal subyacente a este comportamiento se compone principalmente de cinco neuronas sensoriales, cuatro pares de interneuronas y varios tipos de neuronas motoras 7,8. Además, los gusanos se habitúan a tales estímulos mecánicos después de un entrenamiento espaciado que implica estimulación repetida 9,10,11. Por lo tanto, esta respuesta conductual simple constituye un sistema ideal para investigar los mecanismos neuronales subyacentes tanto al comportamiento evocado por vibración no localizada como a la memoria. Se ilustra un protocolo para imágenes de calcio en gusanos que se comportan libremente bajo la influencia de vibraciones no localizadas. En comparación con los sistemas informados anteriormente, este sistema es simple en el sentido de que no requiere una cámara adicional para el seguimiento; sin embargo, nos permite cambiar la frecuencia, el desplazamiento y la duración de la vibración no localizada. Debido a que la activación de las interneuronas AVA induce la respuesta de escape hacia atrás, se utilizaron como ejemplo los gusanos que coexpresan GCaMP, un indicador de calcio, y TagRFP, una proteína fluorescente insensible al calcio, bajo el control de un promotor específico de AVA (ver Tabla de Materiales para más detalles). El protocolo demuestra la activación de las neuronas AVA a medida que un gusano cambia de movimiento hacia adelante hacia atrás. Este protocolo facilita la comprensión del mecanismo del circuito neuronal subyacente al comportamiento mecanosensorial.
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Protocol
1. Cultivo de gusanos hasta la obtención de imágenes de calcio
- Cuatro días antes de un experimento de imágenes de calcio, transfiera dos gusanos ST12 adultos a una nueva placa de medio de crecimiento de nematodos (NGM) (Tabla de Materiales) en la que Escherichia coli OP50 se rayan en un patrón cuadrado (aproximadamente 4 mm x 4 mm) utilizando un esparcidor celular para que el gusano pase la mayor parte del tiempo en la bacteria durante las imágenes de calcio12.
- Incubar esta placa NGM durante 4 días a 20 °C en una incubadora (Tabla de Materiales).
2. Configuración de hardware
- Prepare un microscopio equipado con un dispositivo piezoeléctrico para la estimulación13, una lente de objetivo 2x, una cámara sCMOS de alta velocidad, óptica de división de imágenes, una etapa motorizada x-y, una fuente de luz LED para excitación y una computadora (Figura 1). Las especificaciones esenciales de la cámara sCMOS incluyen 2560 x 2160 píxeles activos, 6,5 μm de tamaño, con un enlace de cámara de 10 toques como opción de interfaz. Las especificaciones clave de la etapa motorizada X-Y incluyen un rango de recorrido de 110 mm x 75 mm, velocidad máxima de 250 mm / s, aceleración máxima de 2,000 mm / s2 y repetibilidad unidireccional de 0.25 μm.
- Encienda la computadora y el controlador de etapa motorizado x-y.
- Encienda el amplificador y ajuste el ajustador de volumen a 10 y los ajustadores de graves y agudos a 8.
- Para excitar GCaMP y TagRFP, encienda las luces de 488 nm y 560 nm de la fuente de luz LED. Ajuste los medidores de 470 nm y 550 nm de la cápsula de control en la fuente de luz al 5% para que la intensidad de la luz LED sea adecuada para la obtención de imágenes.
NOTA: A esta intensidad de LED, el fotoblanqueo de la fluorescencia GCaMP y TagRFP no ocurre durante la grabación.
3. Configuración de software para imágenes de calcio
- Descargue e instale tres paquetes de software en Windows: software de macros de mouse, software para controlar la propiedad de vibración, software para ejecutar software de seguimiento y software para análisis de datos (Tabla de materiales).
- Haga doble clic en el archivo de software de seguimiento.
- Presione el botón Ejecutar y espere 5 minutos para estabilizar el software (Figura 2A).
- Proporcione la información sobre el tiempo de exposición y el binning. El tiempo de exposición de 0.033 s con 2 x 2 binning garantiza una adquisición de imagen fluida (Figura 2B).
NOTA: Solo se muestra cada10ª imagen adquirida para reducir la carga de memoria. - Proporcione la información para la adquisición de imágenes (Figura 2C). Por ejemplo, cuando se graban 500 imágenes dos veces con un intervalo de 10 s, escriba 1.000 en el cuadro Total de imágenes, 500 en el cuadro Imágenes y 10 en el cuadro Intervalo (s).
- Active el botón Adquisición (Figura 2D).
- Divida la imagen de fluorescencia utilizando la óptica de división de imágenes y las dos imágenes (canal GCaMP, 500-525 nm (Figura 2E); El canal TagRFP, 584-676 nm (Figura 2F)) se proyecta en dos mitades de la cámara sCMOS. Calibrar las coordenadas de los canales GCaMP y TagRFP (Figura 2G). Guarde la configuración del software.
- Establezca el directorio para generar el archivo de datos (Figura 2H).
- Desactive el botón Adquisición (Figura 2D).
- Haga doble clic en el software del sistema de macros del ratón (Figura 3A) y establezca las propiedades de vibración (Figura 3B). Lea el archivo Assay.txt con el sistema de macros del mouse para que el cursor del mouse se controle en función de las coordenadas y la programación de ese archivo (Figura 3A). Establezca las coordenadas del cursor del ratón (cuadrados magenta en la Figura 3A) y espere el tiempo hasta la estimulación después de iniciar la grabación (magenta en la Figura 3A). Establezca los valores de frecuencia y amplitud en el software para el control de vibraciones (Figura 3B).
4. Preparación de gusanos para imágenes de calcio
- Transfiera un solo gusano que exprese tanto GCaMP como TagRFP de la placa incubada a una nueva placa NGM fresca en la que se haya rayado E. coli OP50.
- Conecte la placa NGM al transductor acústico piezoeléctrico con cinta adhesiva transparente (Figura 4). No presione la placa sobre el actuador porque esto altera la frecuencia de vibración.
5. Imágenes de calcio bajo el control de propiedades de vibración específicas
- Active el botón Adquisición (Figura 2D).
- Encuentra el gusano bajo luz brillante y luz de excitación (488 nm y 560 nm).
- Establezca el valor de zoom de la microscopía en 2,5x. El campo de visión es de 1,1 mm x 1,1 mm con una resolución de 2,6 μm/píxel.
- Apague la luz brillante y encienda el botón Homing (Figura 2I) para rastrear el punto fluorescente de un gusano. Este botón de localización inicia el movimiento de la etapa X-Y para mantener la región de máxima intensidad del gusano en el centro del campo de visión en la imagen TagRFP.
NOTA: En términos del promotor flp-18 , la intensidad fluorescente de las neuronas AVA es más fuerte y las de otras neuronas son débiles o no se detectan. Por lo tanto, el sistema de baja ampliación no es necesario para el seguimiento y el escenario se mueve a lo largo de la grabación. - Asegúrese de que los valores de las barras de intensidad de las figuras 2E y 2F sean aproximadamente 1.000. Si no lo están, ajuste los medidores de 470 nm y 550 nm de la cápsula de control en la fuente de luz.
- Pulse el botón Ejecutar en el sistema de macros del ratón para permitir el control del cursor del ratón de acuerdo con una programación descrita en la Figura 3A. Esto comienza a registrarse utilizando el software de seguimiento y estimula el software de genes de onda mientras rastrea el gusano.
- Compruebe si el archivo BMP de salida se ha creado correctamente.
6. Análisis de datos
- Cree una carpeta en el escritorio y asígnele el nombre CalciumImaging.
- Cree una carpeta dentro de la carpeta CalciumImaging y asígnele el nombre CIResult, para los archivos de resultados de salida.
- Haga doble clic en el archivo DualViewImaging.nb escrito en el software de análisis de datos para Windows.
- Inserte la ruta del archivo en la carpeta CIResult (por ejemplo, DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Figura 5).
- Inserte la ruta del archivo en la carpeta, incluido el archivo BMP (por ejemplo, SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Figura 5), en la que XXX indica el nombre de la carpeta, incluidos los archivos BMP.
- Presione las teclas Mayús y Retorno simultáneamente para iniciar un análisis automático. Este análisis utiliza el valor de una región de campo de visión de intensidad máxima en la imagen TagRFP (consulte la leyenda de la Figura 6 para obtener un procedimiento de cálculo detallado en el programa).
- Compruebe si los siguientes archivos de salida se han creado correctamente en la carpeta CIResult.
XXX-GCaMP.tif (archivo de imagen que ilustra los rastros de intensidades GCaMP para todas las imágenes)
XXX-GCaMP.xls (archivo de hoja de cálculo que enumera las intensidades GCaMP en todas las imágenes)
XXX-TagRFP.tif (archivo de imagen que ilustra rastros de intensidades de TagRFP para todas las imágenes)
XXX-TagRFP.xls (archivo de hoja de cálculo que enumera las intensidades de TagRFP en todas las imágenes)
XXX-Ratio.tif (archivo de imagen que ilustra los rastros del valor de la relación para todas las imágenes)
XXX-Ratio.xls (archivo de hoja de cálculo que enumera el valor de la relación en todas las imágenes)
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Representative Results
Aquí, un gusano que expresa tanto GCaMP como TagRFP bajo el control del promotor específico de interneurona AVA se utiliza como ejemplo de imágenes de calcio en C. elegans que se comporta libremente. Los datos de los canales GCaMP y TagRFP se obtuvieron como una serie de imágenes, algunas de las cuales se muestran en la Figura 6 y como una película (Película suplementaria 1). También se cuantificó el desplazamiento de la placa de Petri inducido por nuestro sistema de vibración no localizada (Figura 7). El desplazamiento se puede controlar estableciendo el valor de amplitud en el software para el control de vibraciones (Figura 3B) y el ajustador de volumen en el amplificador (Figura 4), mientras que la frecuencia se regula estableciendo el valor de frecuencia en el software (Figura 4). En los experimentos exitosos, se observó una respuesta transitoria de calcio de las neuronas AVA tras la estimulación con vibraciones que tienen una frecuencia de 630 Hz y un desplazamiento de aproximadamente 4,5 μm durante 1 s, lo que indica que la neurona AVA se activó durante la respuesta hacia atrás de un gusano a la estimulación no localizada (Figura 6). Las líneas de base de las señales GCaMP y TagRFP también mostraron que casi no se produjo fotoblanqueo durante la grabación.
Figura 1: Una configuración esquemática del sistema. Una placa NGM en la que un gusano se mueve libremente se mantiene en un transductor acústico. La luz de excitación (488 nm y 560 nm) se emite desde una fuente de luz LED. Las emisiones fluorescentes GCaMP y TagRFP se dividen mediante ópticas de división de imágenes, de modo que cada emisión fluorescente se proyecta en la mitad de una cámara sCMOS. El software de seguimiento controla la etapa motorizada x-y para rastrear el punto fluorescente del gusano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Captura de pantalla del software para rastrear un punto fluorescente de un gusano. (A) El botón Ejecutar para activar el software. (B) Cuadros para configurar el ciclo de visualización de la imagen, el tiempo de exposición y el binning en cada canal. (C) Cajas para proporcionar información sobre el ciclo de adquisición de imágenes. (D) El botón Adquisición para iniciar la transmisión en vivo. (E) Imagen GCaMP. (F) Imagen TagRFP. (G) Un panel para coordenadas de calibración entre imágenes GCaMP y TagRFP. (H) Cuadro para establecer la ruta del archivo. (I) El botón Homing para iniciar el seguimiento de gusanos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Foto del sistema macro del ratón y software para controlar la vibración. (A) El cuadrado magenta indica las coordenadas del cursor del ratón. El significado de cada línea de escritura se explica en letras magenta. (B) La GUI (interfaz gráfica de usuario) del software para controlar la vibración. Los valores de frecuencia y amplitud de vibración se controlan mediante esta GUI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Foto de la placa NGM sostenida en el transductor acústico utilizando cinta adhesiva transparente. Solo un gusano se mueve en la placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Foto del software de análisis de datos. Los subrayados magenta y azul indican las rutas a la carpeta CIResult y a la carpeta que incluye los archivos BMP, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Trazas de las intensidades de la fluorescencia GCaMP (A) y TagRFP (B), y el cambio de relación (C,D). (A -C) Las trazas representativas para la señal GCaMP, la señal TagRFP y los cambios de relación de un solo gusano. El cambio de proporción se calcula utilizando el archivo DualViewImaging.nb, como se indica a continuación. La coordenada en la que la intensidad de la fluorescencia de TagRFP es máxima después de extraer la sustracción de fondo para cada imagen. Esta señal TagRFP sirve para compensar los cambios de enfoque causados por el movimiento del animal. La intensidad máxima de fluorescencia de GCaMP dentro de la coordenada extraída ±10 píxeles se calcula como la intensidad de la señal GCaMP para cada imagen. Para la ratiometría, se calcula ((IGCaMP − IGCaMP_BG) − (ITagRFP − ITagRFP_BG)) / (ITagRFP − ITagRFP_BG), en la que IGCaMP e ITagRFP son las señales GCaMP y TagRFP de la neurona AVA, respectivamente, y IGCaMP_BG e ITagRFP_BG son las señales de fondo, respectivamente. Este proceso de cálculo se aplicó a todas las imágenes para cuantificar el cambio de relación en un evento de reversión. La línea vertical a 5 s en todas las trazas indica el período de estimulación. (D) La proporción promedio cambia para 15 gusanos. La barra de error indica SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Relación entre parámetros. (A) Los reemplazos se midieron cada 100 Hz utilizando un vibrómetro doppler láser, en el que el valor de amplitud en el software y el valor del ajustador de VOLUMEN en el amplificador se fijaron a 0 y 10, respectivamente. La frecuencia de resonancia se observó entre 100-200 Hz, que fue similar al valor descrito en la especificación del transductor acústico. (B) Las frecuencias y los desplazamientos fueron controlados por el software (rango; 100 a 1000 Hz) y el amplificador (rango: 1-10), respectivamente y medidos utilizando un vibrómetro doppler láser. El valor de amplitud seleccionado por el software se indica para cada frecuencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película suplementaria 1: Una película representativa para transitorios de calcio en una interneurona AVA de un gusano que se comporta libremente en respuesta a una vibración no localizada de 630 Hz. La estimulación fue evocada 5 s después de comenzar la grabación. GFP también se expresó en el intestino del gusano como un marcador de coinyección para GCaMP. Esta fluorescencia GFP no afecta la intensidad de la señal de GCaMP. La barra de escala también se indica en la primera imagen. La dirección del gusano se indica en la parte superior derecha después de la primera imagen. El reproductor multimedia de Windows es adecuado para reproducir el archivo AVI, pero también se puede reproducir utilizando algunos reproductores multimedia descargados gratuitamente, como el reproductor multimedia VLC en la Mac. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En general, la cuantificación de la actividad neuronal requiere la introducción de una sonda y / o restricciones en el movimiento del cuerpo animal. Sin embargo, para los estudios del comportamiento mecanosensorial, la introducción invasiva de una sonda y las restricciones en sí mismas constituyen estímulos mecánicos. C. elegans proporciona un sistema para eludir estos problemas, porque sus características son transparentes y porque tiene un circuito neuronal simple y compacto que comprende solo 302 neuronas. Combinando estas ventajas con el método previamente desarrollado de evocar vibraciones no localizadas de desplazamiento a nanoescala13, se ilustra aquí un método para imágenes de calcio no invasivas de C. elegans sin restricciones que responden a la vibración controlada.
Las propiedades de los estímulos mecánicos están definidas por varios parámetros, como la frecuencia, el desplazamiento y la duración. Recientemente, la biotremología ha surgido como un nuevo campo de investigación1. El propósito principal de tales estudios es comprender los mecanismos subyacentes a la producción, dispersión y recepción de vibraciones mecánicas por parte de los organismos, y la influencia de esas vibraciones en el comportamiento. Muchos animales, incluidos los humanos, utilizan vibraciones y ondas acústicas para monitorear el entorno circundante. Por ejemplo, los escorpiones detectan presas a través de la vibración transmitida por el sustrato14. Por lo tanto, la vibración es una herramienta de comunicación con el entorno circundante. El método descrito aquí se puede utilizar para controlar los parámetros de entrada y cuantificar las respuestas neuronales a nivel de una sola neurona, lo que lleva a la creación de un diagrama de fases que describe la relación entrada-salida. Sobre la base de tales diagramas de fase, podemos obtener información sobre qué parámetros afectan a circuitos neuronales específicos y por qué mecanismos los animales hacen frente a las vibraciones mecánicas.
Desde 200715, se han desarrollado varios sistemas para imágenes de calcio de una sola neurona en C. elegans que se mueve libremente. Estos sistemas se han centrado principalmente en las respuestas neuronales a la temperatura15,16, los odorantes16,17 y los estímulos táctiles17. Con respecto a las vibraciones no localizadas, el método de golpear una placa de Petri se ha aplicado durante mucho tiempo para cuantificar las respuestas de comportamiento. Sin embargo, golpear una placa de Petri en una etapa x-y motorizada hizo que el punto fluorescente saliera del campo de visión, lo que llevó a la falla en el seguimiento de un gusano que se comportaba libremente. Por lo tanto, el transductor acústico piezoeléctrico se incrustó, lo que evoca la vibración no localizada a través del eje z, en el sistema de seguimiento. Este método permite la realización de experimentos reproducibles para cuantificar las respuestas neuronales a la vibración no localizada.
Los métodos demostrados también ofrecen la posibilidad de una mayor extensión metodológica. Dado que el protocolo actual puede capturar respuestas de una sola neurona en dos dimensiones, el sistema de enfoque automático debe estar equipado en el futuro para evitar la pérdida de enfoque. Por otro lado, debido a que recientemente se han desarrollado varios métodos de imagen volumétrica utilizando C. elegans 18,19,20,21, la extensión del enfoque de la imagen volumétrica debería permitir la cuantificación no invasiva de múltiples neuronas22 o incluso de todo el cerebro 18,19,20,21 , en respuesta a vibraciones que tienen propiedades controlables. Tal sistema podría aplicarse al sistema recientemente establecido para investigar los mecanismos subyacentes al comportamiento colectivo23. Por lo tanto, otras aplicaciones biológicas y extensiones del método probablemente nos permitirán comprender los mecanismos neuronales subyacentes a los comportamientos mecanosensoriales.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Centro de Genética Caenorhabditis por proporcionar las cepas utilizadas en este estudio. Esta publicación fue apoyada por JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grant no. JP18H02483), sobre áreas innovadoras del proyecto "Science of Soft Robot" (Grant no. JP18H05474), el PRIME de la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (número de subvención 19gm6110022h001), y la fundación Shimadzu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
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