Summary
Il est rapporté ici un système d’imagerie calcique chez Caenorhabditis elegans qui se comporte librement avec des vibrations bien contrôlées et non localisées. Ce système permet aux chercheurs d’évoquer des vibrations non localisées aux propriétés bien contrôlées à l’échelle nanométrique et de quantifier les courants de calcium lors des réponses de C. elegans aux vibrations.
Abstract
Les forces mécaniques non localisées, telles que les vibrations et les ondes acoustiques, influencent une grande variété de processus biologiques, du développement à l’homéostasie. Les animaux font face à ces stimuli en modifiant leur comportement. Comprendre les mécanismes sous-jacents à une telle modification comportementale nécessite la quantification de l’activité neuronale pendant le comportement d’intérêt. Ici, nous rapportons une méthode d’imagerie calcique dans le comportement libre de Caenorhabditis elegans avec des vibrations non localisées de fréquence, de déplacement et de durée spécifiques. Cette méthode permet la production de vibrations bien contrôlées et non localisées à l’aide d’un transducteur acoustique et la quantification des réponses calciques évoquées à une résolution unicellulaire. Comme preuve de principe, la réponse calcique d’un seul interneurone, AVA, lors de la réponse d’échappement de C. elegans aux vibrations est démontrée. Ce système facilitera la compréhension des mécanismes neuronaux sous-jacents aux réponses comportementales aux stimuli mécaniques.
Introduction
Les animaux sont souvent exposés à des stimuli mécaniques non localisés tels que des vibrations ou des ondes acoustiques 1,2. Parce que ces stimuli influencent l’homéostasie, le développement et la reproduction, les animaux doivent modifier leurs comportements pour y faire face 3,4,5. Cependant, les circuits neuronaux et les mécanismes sous-jacents à une telle modification du comportement sont mal compris.
Le comportement mécanosensoriel chez le nématode, Caenorhabditis elegans, est un paradigme comportemental simple, dans lequel les vers changent généralement de comportement d’un mouvement vers l’avant à une réponse d’échappement vers l’arrière lorsqu’ils rencontrent une vibration non localisée6. Le circuit neuronal sous-jacent à ce comportement est composé principalement de cinq neurones sensoriels, de quatre paires d’interneurones et de plusieurs types de motoneurones 7,8. De plus, les vers s’habituent à de tels stimuli mécaniques après un entraînement espacé impliquant une stimulation répétée 9,10,11. Par conséquent, cette réponse comportementale simple constitue un système idéal pour étudier les mécanismes neuronaux sous-jacents à la fois au comportement évoqué par vibration non localisé et à la mémoire. Un protocole d’imagerie calcique chez les vers se comportant librement sous l’influence de vibrations non localisées est illustré. Comparé aux systèmes précédemment signalés, ce système est simple en ce sens qu’il ne nécessite pas de caméra supplémentaire pour le suivi; cependant, cela nous permet de modifier la fréquence, le déplacement et la durée des vibrations non localisées. Étant donné que l’activation des interneurones AVA induit la réponse d’échappement vers l’arrière, les vers co-exprimant GCaMP, un indicateur de calcium, et TagRFP, une protéine fluorescente insensible au calcium, sous le contrôle d’un promoteur spécifique à AVA ont été utilisés comme exemple (voir tableau des matériaux pour plus de détails). Le protocole démontre l’activation des neurones AVA lorsqu’un ver passe d’un mouvement vers l’avant vers l’arrière. Ce protocole facilite la compréhension du mécanisme du circuit neuronal sous-jacent au comportement mécanosensoriel.
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Protocol
1. Culture de vers jusqu’à l’imagerie calcique
- Quatre jours avant une expérience d’imagerie calcique, transférer deux vers ST12 adultes sur une nouvelle plaque de milieu de croissance des nématodes (NGM) (Table des matériaux) sur laquelle Escherichia coli OP50 est strié dans un motif carré (environ 4 mm x 4 mm) à l’aide d’un épandeur de cellules afin que le ver passe la plupart du temps dans la bactérie pendant l’imagerie calcique12.
- Incuber cette plaque NGM pendant 4 jours à 20 °C dans un incubateur (Table des matériaux).
2. Configuration matérielle
- Préparez un microscope équipé d’un dispositif piézoélectrique pour la stimulation13, d’un objectif 2x, d’une caméra sCMOS haute vitesse, d’une optique de fractionnement d’image, d’un étage motorisé x-y, d’une source de lumière LED pour l’excitation et d’un ordinateur (Figure 1). Les spécifications essentielles de la caméra sCMOS incluent 2560 x 2160 pixels actifs, une taille de 6,5 μm, avec une liaison de caméra à 10 robinets comme option d’interface. Les principales spécifications de l’étage motorisé X-Y comprennent une plage de course de 110 mm x 75 mm, une vitesse maximale de 250 mm/s, une accélérationde 2 000 mm/s 2 max et une répétabilité unidirectionnelle de 0,25 μm.
- Allumez l’ordinateur et le contrôleur de scène motorisé x-y.
- Allumez l’amplificateur et réglez le réglage du volume sur 10 et les réglages des basses et des aigus sur 8.
- Pour exciter GCaMP et TagRFP, allumez les lumières 488 nm et 560 nm de la source lumineuse LED. Réglez les jauges de 470 nm et 550 nm du module de commande dans la source lumineuse à 5% afin que l’intensité de la lumière LED soit adaptée à l’imagerie.
REMARQUE: À cette intensité LED, le photoblanchiment de la fluorescence GCaMP et TagRFP ne se produit pas pendant l’enregistrement.
3. Configuration du logiciel pour l’imagerie calcique
- Téléchargez et installez trois progiciels sous Windows : un logiciel de macro de souris, un logiciel de contrôle des propriétés de vibration, un logiciel d’exécution d’un logiciel de suivi et un logiciel d’analyse de données (Table des matériaux).
- Double-cliquez sur le fichier du logiciel de suivi.
- Appuyez sur le bouton Exécuter et attendez 5 minutes pour stabiliser le logiciel (Figure 2A).
- Fournissez les informations sur le temps d’exposition et le binning. Un temps d’exposition de 0,033 s avec un doublement de 2 x 2 garantit une acquisition d’image fluide (Figure 2B).
REMARQUE: Seule chaque10ème image acquise est affichée afin de réduire la charge de mémoire. - Fournissez les informations pour l’acquisition d’images (Figure 2C). Par exemple, lorsque 500 images sont enregistrées deux fois avec un intervalle de 10 s, entrez 1 000 dans la zone Total des images, 500 dans la zone Images et 10 dans la zone Intervalle(s).
- Activez le bouton Acquisition (Figure 2D).
- Divisez l’image de fluorescence à l’aide de l’optique de fractionnement d’image et les deux images (canal GCaMP, 500-525 nm (Figure 2E); Les canaux TagRFP, 584-676 nm (Figure 2F)) sont projetés sur deux moitiés de la caméra sCMOS. Calibrer les coordonnées des canaux GCaMP et TagRFP (Figure 2G). Enregistrez les paramètres du logiciel.
- Définissez le répertoire pour sortir le fichier de données (Figure 2H).
- Désactivez le bouton Acquisition (Figure 2D).
- Double-cliquez sur le logiciel du système de macro de la souris (Figure 3A) et définissez les propriétés de vibration (Figure 3B). Lisez le fichier Assay.txt avec le système de macros de la souris afin que le curseur de la souris soit contrôlé en fonction des coordonnées et de la planification dans ce fichier (Figure 3A). Réglez les coordonnées du curseur de la souris (carrés magenta de la figure 3A) et le temps d’attente jusqu’à la stimulation après le démarrage de l’enregistrement (magenta de la figure 3A). Définissez les valeurs de fréquence et d’amplitude dans le logiciel de contrôle des vibrations (Figure 3B).
4. Préparation des vers pour l’imagerie calcique
- Transférer un seul ver exprimant à la fois GCaMP et TagRFP de la plaque incubée vers une nouvelle plaque NGM fraîche sur laquelle E. coli OP50 a été strié.
- Fixez la plaque NGM au transducteur acoustique piézoélectrique à l’aide d’un ruban adhésif transparent (Figure 4). N’appuyez pas sur la plaque sur l’actionneur car cela modifie la fréquence des vibrations.
5. Imagerie calcique sous le contrôle de propriétés vibratoires spécifiques
- Activez le bouton Acquisition (Figure 2D).
- Trouvez le ver sous une lumière vive et une lumière d’excitation (488 nm et 560 nm).
- Définissez la valeur de zoom de la microscopie sur 2,5x. Le champ de vision est de 1,1 mm x 1,1 mm avec une résolution de 2,6 μm/pixel.
- Éteignez la lumière vive et allumez le bouton Homing (Figure 2I) pour suivre la tache fluorescente d’un ver. Ce bouton de repérage démarre le mouvement de l’étage X-Y pour maintenir la région d’intensité maximale du ver au milieu du champ de vision dans l’image TagRFP.
REMARQUE: En ce qui concerne le promoteur flp-18 , l’intensité fluorescente des neurones AVA est la plus forte et ceux des autres neurones sont faibles ou non détectés. Par conséquent, le système de faible grossissement n’est pas nécessaire pour le suivi et la scène se déplace tout au long de l’enregistrement. - Assurez-vous que les valeurs des barres d’intensité dans les figures 2E et 2F sont d’environ 1 000. Si ce n’est pas le cas, ajustez les jauges de 470 nm et 550 nm du module de commande dans la source lumineuse.
- Appuyez sur le bouton Exécuter du système de macros de la souris pour permettre le contrôle du curseur de la souris conformément à une planification décrite à la figure 3A. Cela commence à enregistrer à l’aide du logiciel de suivi et à stimuler par le logiciel de gène d’onde tout en suivant le ver.
- Vérifiez si le fichier BMP de sortie est correctement créé.
6. Analyse des données
- Créez un dossier sur le bureau et nommez-le CalciumImaging.
- Créez un dossier dans le dossier CalciumImaging et nommez-le CIResult, pour les fichiers de résultats de sortie.
- Double-cliquez sur le fichier DualViewImaging.nb écrit dans le logiciel d’analyse de données pour Windows.
- Insérez le chemin d’accès au fichier dans le dossier CIResult (par exemple, DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) (Figure 5).
- Insérez le chemin d’accès au dossier, y compris le fichier BMP (par exemple, SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (Figure 5), dans lequel XXX indique le nom du dossier, y compris les fichiers BMP.
- Appuyez simultanément sur les touches Maj et Retour pour lancer une analyse automatique. Cette analyse utilise la valeur d’une région de champ de vision d’intensité maximale dans l’image TagRFP (voir la légende de la figure 6 pour une procédure de calcul détaillée dans le programme).
- Vérifiez si les fichiers de sortie suivants sont correctement créés dans le dossier CIResult.
XXX-GCaMP.tif (fichier image illustrant les traces d’intensités GCaMP pour toutes les images)
XXX-GCaMP.xls (fichier de feuille de calcul répertoriant les intensités GCaMP dans toutes les images)
XXX-TagRFP.tif (fichier image illustrant les traces d’intensités de TagRFP pour toutes les images)
XXX-TagRFP.xls (fichier de feuille de calcul répertoriant les intensités TagRFP dans toutes les images)
XXX-Ratio.tif (fichier image illustrant les traces de la valeur du ratio pour toutes les images)
XXX-Ratio.xls (fichier de feuille de calcul répertoriant la valeur du ratio dans toutes les images)
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Representative Results
Ici, un ver exprimant à la fois GCaMP et TagRFP sous le contrôle du promoteur spécifique à l’interneurone AVA est utilisé comme exemple d’imagerie calcique chez C. elegans se comportant librement. Les données des canaux GCaMP et TagRFP ont été obtenues sous la forme d’une série d’images, dont certaines sont montrées à la figure 6 et sous forme de film (film supplémentaire 1). Le déplacement de la plaque de Petri induit par notre système de vibration non localisé (Figure 7) a également été quantifié. Le déplacement peut être contrôlé en réglant la valeur d’amplitude dans le logiciel de contrôle des vibrations (Figure 3B) et le régulateur de volume dans l’amplificateur (Figure 4), tandis que la fréquence est régulée en réglant la valeur de fréquence dans le logiciel (Figure 4). Dans les expériences réussies, une réponse calcique transitoire des neurones AVA a été observée lors de la stimulation avec des vibrations ayant une fréquence de 630 Hz et un déplacement d’environ 4,5 μm pendant 1 s, indiquant que le neurone AVA a été activé lors de la réponse inverse d’un ver à la stimulation non localisée (Figure 6). Les valeurs de référence des signaux GCaMP et TagRFP ont également montré que presque aucun photoblanchiment ne s’est produit pendant l’enregistrement.
Figure 1 : Configuration schématique du système. Une plaque NGM sur laquelle un ver se déplace librement est maintenue sur un transducteur acoustique. La lumière d’excitation (488 nm et 560 nm) est émise par une source de lumière LED. Les émissions fluorescentes GCaMP et TagRFP sont divisées par une optique de division d’image, de sorte que chaque émission fluorescente est projetée sur la moitié d’une caméra sCMOS. Le logiciel de suivi contrôle l’étage motorisé x-y pour suivre la tache fluorescente du ver. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Capture d’écran du logiciel de suivi d’une tache fluorescente d’un ver. (A) Bouton Exécuter pour activer le logiciel. (B) Boîtes permettant de définir le cycle d’affichage de l’image, le(s) temps(s) d’exposition et le regroupement dans chaque canal. (C) Boîtes pour fournir des informations sur le cycle d’acquisition d’images. (D) Le bouton Acquisition pour lancer la diffusion en direct. (E) Image GCaMP. (F) Image TagRFP. (G) Un panneau pour les coordonnées d’étalonnage entre les images GCaMP et TagRFP. (H) Boîte pour définir le chemin d’accès au fichier. (I) Le bouton Homing pour démarrer le suivi des vers. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Photo du système de macro de la souris et du logiciel de contrôle des vibrations. (A) Le carré magenta indique les coordonnées du curseur de la souris. La signification de chaque ligne d’écriture est expliquée en lettres magenta. (B) L’interface utilisateur graphique (GUI) du logiciel de contrôle des vibrations. Les valeurs de fréquence et d’amplitude des vibrations sont contrôlées à l’aide de cette interface graphique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Photo de la plaque NGM maintenue sur le transducteur acoustique à l’aide de ruban adhésif transparent. Un seul ver se déplace sur la plaque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Photo du logiciel d’analyse de données. Les soulignements magenta et bleu indiquent les chemins d’accès au dossier CIResult et au dossier, y compris les fichiers BMP, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Traces des intensités de fluorescence GCaMP (A) et TagRFP (B), et changement de rapport (C,D). (Un -C) Les traces représentatives du signal GCaMP, du signal TagRFP et des changements de rapport d’un seul ver. Le changement de ratio est calculé à l’aide du fichier DualViewImaging.nb, comme suit. Coordonnée dans laquelle l’intensité de la fluorescence TagRFP est maximale après l’extraction de la soustraction de fond pour chaque image. Ce signal TagRFP sert à compenser les changements de mise au point causés par le mouvement de l’animal. L’intensité de fluorescence maximale de GCaMP dans la coordonnée extraite ±10 pixels est calculée comme l’intensité du signal GCaMP pour chaque image. Pour la ratiométrie, ((IGCaMP − IGCaMP_BG) − (ITagRFP − ITagRFP_BG)) / (ITagRFP − ITagRFP_BG) est calculé, dans lequel IGCaMP et ITagRFP sont les signaux GCaMP et TagRFP du neurone AVA, respectivement, et IGCaMP_BG et ITagRFP_BG sont les signaux de fond, respectivement. Ce processus de calcul a été appliqué à toutes les images pour quantifier le changement de rapport dans un événement d’inversion. La ligne verticale à 5 s dans toutes les traces indique la période de stimulation. (D) Le ratio moyen change pour 15 vers. La barre d’erreur indique SEM. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Relation entre les paramètres. (A) Les remplacements ont été mesurés tous les 100 Hz à l’aide d’un vibromètre laser Doppler, dans lequel la valeur d’amplitude dans le logiciel et la valeur de réglage VOLUME dans l’amplificateur ont été fixées à 0 et 10, respectivement. La fréquence de résonance a été observée entre 100 et 200 Hz, ce qui était similaire à la valeur décrite dans la spécification du transducteur acoustique. (B) Les fréquences et les déplacements ont été contrôlés par le logiciel (plage; 100 à 1000 Hz) et l’amplificateur (plage: 1-10), respectivement et mesurés à l’aide d’un vibromètre doppler laser. La valeur d’amplitude sélectionnée par le logiciel est indiquée pour chaque fréquence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Film supplémentaire 1: Un film représentatif des transitoires de calcium dans un interneurone AVA d’un ver se comportant librement en réponse à une vibration non localisée de 630 Hz. La stimulation a été évoquée 5 s après le début de l’enregistrement. La GFP a également été exprimée dans l’intestin du ver en tant que marqueur de co-injection pour GCaMP. Cette fluorescence GFP n’affecte pas l’intensité du signal de GCaMP. La barre d’échelle est également indiquée dans la première image. La direction du ver est indiquée en haut à droite après la première image. Le lecteur multimédia Windows convient à la lecture du fichier AVI, mais il peut également être lu à l’aide de certains lecteurs multimédias téléchargés gratuitement, tels que le lecteur multimédia VLC sur mac. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Généralement, la quantification de l’activité neuronale nécessite l’introduction d’une sonde et/ou de contraintes sur les mouvements du corps animal. Cependant, pour les études du comportement mécanosensoriel, l’introduction invasive d’une sonde et les contentions elles-mêmes constituent des stimuli mécaniques. C. elegans fournit un système pour contourner ces problèmes, parce que ses caractéristiques sont transparentes et parce qu’il a un circuit neuronal simple et compact comprenant seulement 302 neurones. Combinant ces avantages avec la méthode précédemment développée pour évoquer les vibrations non localisées du déplacement à l’échelle nanométrique13, illustrée ici est une méthode d’imagerie calcique non invasive de C. elegans non retenu répondant à des vibrations contrôlées.
Les propriétés des stimuli mécaniques sont définies par plusieurs paramètres, tels que la fréquence, le déplacement et la durée. Récemment, la biotremologie est devenue un nouveau domaine de recherche1. Le but principal de ces études est de comprendre les mécanismes sous-jacents à la production, à la dispersion et à la réception des vibrations mécaniques par les organismes, ainsi que l’influence de ces vibrations sur le comportement. De nombreux animaux, y compris les humains, utilisent les vibrations et les ondes acoustiques pour surveiller l’environnement environnant. Par exemple, les scorpions détectent les proies par vibration portée par le substrat14. Par conséquent, la vibration est un outil de communication avec l’environnement environnant. La méthode décrite ici peut être utilisée pour contrôler les paramètres d’entrée et quantifier les réponses neuronales au niveau du neurone unique, conduisant à la création d’un diagramme de phase décrivant la relation entrée-sortie. Sur la base de tels diagrammes de phase, nous pouvons mieux comprendre quels paramètres affectent des circuits neuronaux spécifiques et par quels mécanismes les animaux font face aux vibrations mécaniques.
Depuis 200715, plusieurs systèmes ont été développés pour l’imagerie calcique mononeurone chez C. elegans en mouvement libre. Ces systèmes se sont principalement concentrés sur les réponses neuronales à la température 15,16, les odorants 16,17 et les stimuli tactiles17. En ce qui concerne les vibrations non localisées, la méthode de taraudage d’une plaque de Petri a longtemps été appliquée pour quantifier les réponses comportementales. Cependant, le fait de taper sur une plaque de Petri sur un étage x-y motorisé a fait sortir le point fluorescent du champ de vision, ce qui a conduit à l’incapacité de suivre un ver qui se comporte librement. Par conséquent, le transducteur acoustique piézoélectrique a été intégré, ce qui évoque des vibrations non localisées sur l’axe z, dans le système de suivi. Cette méthode permet la réalisation d’expériences reproductibles pour quantifier les réponses neuronales aux vibrations non localisées.
Les méthodes démontrées offrent également la possibilité d’une extension méthodologique supplémentaire. Étant donné que le protocole actuel ne peut capturer les réponses que d’un seul neurone en deux dimensions, le système de mise au point automatique devrait être équipé à l’avenir pour éviter toute perte de mise au point. D’autre part, comme plusieurs méthodes d’imagerie volumétrique ont récemment été développées à l’aide de C. elegans 18,19,20,21, l’extension de l’approche de l’imagerie volumétrique devrait permettre une quantification non invasive de plusieurs neurones22 ou même de l’ensemble du cerveau 18,19,20,21 , en réponse à des vibrations ayant des propriétés contrôlables. Un tel système pourrait être appliqué au système récemment établi pour étudier les mécanismes sous-jacents au comportement collectif23. Par conséquent, d’autres applications biologiques et extensions de la méthode nous permettront probablement de comprendre les mécanismes neuronaux sous-jacents aux comportements mécanosensoriels.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Caenorhabditis Genetics Center d’avoir fourni les souches utilisées dans cette étude. Cette publication a été soutenue par JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), sur les domaines innovants du projet « Science of Soft Robot » (Grant no. JP18H05474), le PRIME de l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (numéro de subvention 19gm6110022h001) et la fondation Shimadzu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
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