Summary
यहाँ रिपोर्ट कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक प्रणाली है स्वतंत्र रूप से अच्छी तरह से नियंत्रित, nonlocalized कंपन के साथ Caenorhabditis elegans व्यवहार में. यह प्रणाली शोधकर्ताओं को नैनो-स्केल विस्थापन पर अच्छी तरह से नियंत्रित गुणों के साथ गैर-स्थानीयकृत कंपन पैदा करने और कंपन के लिए सी एलिगन्स की प्रतिक्रियाओं के दौरान कैल्शियम धाराओं को मापने की अनुमति देती है।
Abstract
गैर-स्थानीयकृत यांत्रिक बल, जैसे कंपन और ध्वनिक तरंगें, विकास से होमोस्टैसिस तक विभिन्न प्रकार की जैविक प्रक्रियाओं को प्रभावित करती हैं। जानवर अपने व्यवहार को संशोधित करके इन उत्तेजनाओं का सामना करते हैं। इस तरह के व्यवहार संशोधन के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए ब्याज के व्यवहार के दौरान तंत्रिका गतिविधि के परिमाणीकरण की आवश्यकता होती है। यहां, हम विशिष्ट आवृत्ति, विस्थापन और अवधि के गैर-स्थानीयकृत कंपन के साथ स्वतंत्र रूप से Caenorhabditis elegans व्यवहार करने में कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं। यह विधि एक ध्वनिक ट्रांसड्यूसर का उपयोग करके अच्छी तरह से नियंत्रित, गैर-स्थानीयकृत कंपन के उत्पादन की अनुमति देती है और एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का परिमाणीकरण करती है। सिद्धांत के एक सबूत के रूप में, कंपन के लिए C. elegans के भागने की प्रतिक्रिया के दौरान एक एकल interneuron, AVA की कैल्शियम प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया जाता है। यह प्रणाली यांत्रिक उत्तेजनाओं के लिए व्यवहार प्रतिक्रियाओं को अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र की समझ की सुविधा प्रदान करेगी।
Introduction
जानवरों को अक्सर गैर-स्थानीयकृत यांत्रिक उत्तेजनाओं जैसे कंपन या ध्वनिक तरंगों 1,2 के संपर्क में लाया जाता है। क्योंकि ये उत्तेजनाएं होमियोस्टैसिस, विकास और प्रजनन को प्रभावित करती हैं, जानवरों को उनके साथसामना करने के लिए अपने व्यवहार को संशोधित करना चाहिए 3,4,5। हालांकि, इस तरह के व्यवहार संशोधन के अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट और तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है।
सूत्रकृमि में Mechanosensory व्यवहार, Caenorhabditis elegans, एक सरल व्यवहार प्रतिमान है, जिसमें कीड़े आमतौर पर आगे के आंदोलन से एक पिछड़े भागने की प्रतिक्रिया के लिए व्यवहार बदल जाते हैं जब वे nonlocalized कंपन6 मुठभेड़. इस व्यवहार को अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट मुख्य रूप से पांच संवेदी न्यूरॉन्स, इंटरन्यूरॉन्स के चार जोड़े और कई प्रकार के मोटर न्यूरॉन्स 7,8 से बना है। इसके अतिरिक्त, कीड़े बार-बार उत्तेजना 9,10,11 को शामिल करने वाले अंतराल प्रशिक्षणके बाद इस तरह के यांत्रिक उत्तेजनाओं के लिए अभ्यस्त होते हैं। इसलिए, यह सरल व्यवहार प्रतिक्रिया गैर-स्थानीयकृत कंपन-उत्तेजित व्यवहार और स्मृति दोनों के अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र की जांच करने के लिए एक आदर्श प्रणाली का गठन करती है। गैर-स्थानीयकृत कंपन के प्रभाव में स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले कीड़े में कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल सचित्र है। पहले रिपोर्ट किए गए सिस्टम की तुलना में, यह प्रणाली सरल है कि इसे ट्रैकिंग के लिए एक अतिरिक्त कैमरे की आवश्यकता नहीं है; हालांकि, यह हमें आवृत्ति, विस्थापन, और nonlocalized कंपन की अवधि को बदलने के लिए अनुमति देता है। क्योंकि AVA interneurons की सक्रियता पिछड़े भागने की प्रतिक्रिया को प्रेरित करती है, कीड़े सह-व्यक्त GCaMP, एक कैल्शियम संकेतक, और TagRFP, एक कैल्शियम-असंवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन, एक AVA-विशिष्ट प्रमोटर के नियंत्रण में एक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। प्रोटोकॉल एवीए न्यूरॉन्स के सक्रियण को प्रदर्शित करता है क्योंकि एक वर्म आगे से पीछे की ओर आंदोलन में स्विच करता है। यह प्रोटोकॉल मेचानोसेंसरी व्यवहार के अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट तंत्र को समझने की सुविधा प्रदान करता है।
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Protocol
1. कैल्शियम इमेजिंग तक कीड़े की खेती
- एक कैल्शियम इमेजिंग प्रयोग से चार दिन पहले, दो वयस्क एसटी 12 कीड़े को एक नए नेमाटोड विकास माध्यम (एनजीएम) प्लेट (सामग्री की तालिका) में स्थानांतरित करें, जिस पर एस्चेरिचिया कोलाई OP50 को एक सेल स्प्रेडर का उपयोग करके एक वर्ग पैटर्न (लगभग 4 मिमी x 4 मिमी) में लकीरदार किया जाता है ताकि कीड़ा कैल्शियम इमेजिंग12 के दौरान बैक्टीरिया में अधिकांश समय बिताता है।
- एक इनक्यूबेटर (सामग्री की तालिका) में 20 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए इस NGM प्लेट को इनक्यूबेट करें।
2. हार्डवेयर सेटअप
- उत्तेजना13 के लिए एक पीजोइलेक्ट्रिक डिवाइस से सुसज्जित एक माइक्रोस्कोप तैयार करें, एक 2x उद्देश्य लेंस, एक उच्च गति वाले एससीएमओएस कैमरा, छवि विभाजन प्रकाशिकी, एक एक्स-वाई मोटरचालित चरण, उत्तेजना के लिए एक एलईडी प्रकाश स्रोत, और एक कंप्यूटर (चित्रा 1)। SCMOS कैमरे के आवश्यक विनिर्देशों में 2560 x 2160 सक्रिय पिक्सेल, आकार में 6.5 μm, एक इंटरफ़ेस विकल्प के रूप में 10-टैप कैमरा लिंक के साथ शामिल हैं। एक्स-वाई मोटरचालित चरण के प्रमुख विनिर्देशों में 110 मिमी x 75 मिमी यात्रा सीमा, 250 मिमी / सेकंड अधिकतम वेग, 2,000 मिमी / एस2 अधिकतम त्वरण, और 0.25 μm यूनिडायरेक्शनल पुनरावृत्ति शामिल हैं।
- कंप्यूटर और x-y motorized चरण नियंत्रक को चालू करें।
- एम्पलीफायर को चालू करें और वॉल्यूम समायोजक को 10 और बास और तिहरा समायोजक को 8 पर सेट करें।
- GCaMP और TagRFP को उत्तेजित करने के लिए, एलईडी प्रकाश स्रोत की 488 एनएम और 560 एनएम रोशनी को चालू करें। प्रकाश स्रोत में नियंत्रण फली के 470 एनएम और 550 एनएम के गेज को 5% पर सेट करें ताकि एलईडी प्रकाश की तीव्रता इमेजिंग के लिए उपयुक्त हो।
नोट: इस एलईडी तीव्रता पर, GCaMP और TagRFP प्रतिदीप्ति की photobleaching रिकॉर्डिंग के दौरान नहीं होती है।
3. कैल्शियम इमेजिंग के लिए सॉफ्टवेयर सेटअप
- डाउनलोड और Windows में तीन सॉफ़्टवेयर पैकेज स्थापित करें: माउस मैक्रो सॉफ़्टवेयर, कंपन संपत्ति को नियंत्रित करने के लिए सॉफ़्टवेयर, ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर चलाने के लिए सॉफ़्टवेयर, और डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिका).
- ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर फ़ाइल पर डबल क्लिक करें।
- रन बटन पुश करें और सॉफ़्टवेयर को स्थिर करने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें (चित्रा 2A)।
- एक्सपोज़र समय और बिनिंग के बारे में जानकारी प्रदान करें। 0.033 s एक्सपोज़र समय 2 x 2 binning के साथ चिकनी छवि अधिग्रहण (चित्रा 2B) सुनिश्चित करता है।
नोट:: स्मृति लोड को कम करने के लिए केवल हर 10वीं अधिग्रहित छवि प्रदर्शित किया जाता है। - छवि अधिग्रहण के लिए जानकारी प्रदान करें (चित्र2C). उदाहरण के लिए, जब 500 छवियाँ 10 s के अंतराल के साथ दो बार रिकॉर्ड की जाती हैं, तो छवियाँ कुल बॉक्स में 1,000, छवियाँ बॉक्स में 500 और अंतराल (s) बॉक्स में 10 दर्ज करें.
- अधिग्रहण बटन चालू करें (चित्र2D).
- छवि विभाजन प्रकाशिकी का उपयोग कर प्रतिदीप्ति छवि को विभाजित करें, और दो छवियों (GCaMP चैनल, 500-525 एनएम (चित्रा 2E); TagRFP चैनल, 584-676 nm (चित्रा 2F)) sCMOS कैमरे के दो हिस्सों पर प्रक्षेपित कर रहे हैं। GCaMP और TagRFP चैनलों (चित्रा 2G) के निर्देशांक को कैलिब्रेट करें. सॉफ़्टवेयर सेटिंग्स सहेजें.
- डेटा फ़ाइल आउटपुट करने के लिए निर्देशिका सेट करें (चित्र2H).
- अधिग्रहण बटन बंद करें (चित्र2D).
- माउस मैक्रो सिस्टम सॉफ़्टवेयर (चित्रा 3A) पर डबल क्लिक करें और कंपन गुणों (चित्रा 3B) सेट करें। माउस मैक्रो सिस्टम के साथ परख.txt फ़ाइल पढ़ें ताकि माउस कर्सर निर्देशांक और उस फ़ाइल में अनुसूची के आधार पर नियंत्रित किया जाता है (चित्रा 3A)। माउस कर्सर के निर्देशांक सेट करें ( चित्रा 3A में मैजेंटा वर्ग) और रिकॉर्डिंग शुरू करने के बाद उत्तेजना तक समय प्रतीक्षा करें ( चित्र3A में मैजेंटा)। कंपन नियंत्रण के लिए सॉफ़्टवेयर में आवृत्ति और आयाम मान सेट करें (चित्रा 3B).
4. कैल्शियम इमेजिंग के लिए कीड़े की तैयारी
- इनक्यूबेटेड प्लेट से एक एकल कीड़ा को एक नई ताजा एनजीएम प्लेट में इनक्यूबेटेड प्लेट से व्यक्त करने वाले एक एकल कीड़े को स्थानांतरित करें जिस पर ई कोलाई OP50 को लकीरदार किया गया है।
- पारदर्शी चिपकने वाला टेप (चित्रा 4) का उपयोग करके पीजोइलेक्ट्रिक ध्वनिक ट्रांसड्यूसर के लिए एनजीएम प्लेट संलग्न करें। Actuator पर प्लेट को दबाएं नहीं क्योंकि यह कंपन आवृत्ति को बदल देता है।
5. कैल्शियम इमेजिंग विशिष्ट कंपन गुणों के नियंत्रण में
- अधिग्रहण बटन चालू करें (चित्र2D).
- उज्ज्वल प्रकाश और उत्तेजना प्रकाश (488 nm और 560 nm) के तहत कीड़ा ज्ञात कीजिये।
- माइक्रोस्कोपी का ज़ूम मान 2.5x पर सेट करें. दृश्य का क्षेत्र 2.6 μm / पिक्सेल के रिज़ॉल्यूशन के साथ 1.1 मिमी x 1.1 मिमी है।
- उज्ज्वल प्रकाश को बंद करें और एक कीड़े के फ्लोरोसेंट स्पॉट को ट्रैक करने के लिए होमिंग बटन (चित्रा 2I) को चालू करें। यह होमिंग बटन टैगआरएफपी छवि में दृश्य के क्षेत्र के बीच में कीड़े के अधिकतम तीव्रता क्षेत्र को रखने के लिए एक्स-वाई चरण के आंदोलन को शुरू करता है।
नोट: एफएलपी -18 प्रमोटर के संदर्भ में, एवीए न्यूरॉन्स की फ्लोरोसेंट तीव्रता सबसे मजबूत है और अन्य न्यूरॉन्स से उन लोगों को बेहोश कर रहे हैं या पता नहीं चला है। इसलिए, ट्रैकिंग के लिए कम आवर्धन प्रणाली की आवश्यकता नहीं है और चरण रिकॉर्डिंग के दौरान चलता है। - सुनिश्चित करें कि चित्र 2E और 2F में तीव्रता सलाखों के मान लगभग 1,000 हैं। यदि वे नहीं हैं, तो प्रकाश स्रोत में नियंत्रण फली के 470 एनएम और 550 एनएम गेज को ठीक करें।
- माउस मैक्रो सिस्टम में चलाएँ बटन दबाएँ माउस कर्सर नियंत्रण की अनुमति देने के लिए चित्र 3A में वर्णित शेड्यूल के अनुसार। यह ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके रिकॉर्ड करना शुरू कर देता है और कीड़े को ट्रैक करते समय वेव जीन सॉफ़्टवेयर द्वारा उत्तेजित करता है।
- जाँचें कि आउटपुट BMP फ़ाइल उचित रूप से बनाई गई है या नहीं.
6. डेटा विश्लेषण
- डेस्कटॉप पर एक फ़ोल्डर बनाएँ और इसे CalciumImaging नाम दें।
- CalciumImaging फ़ोल्डर के अंदर एक फ़ोल्डर बनाएँ और आउटपुट परिणाम फ़ाइलों के लिए, इसे CIResult नाम दें।
- विंडोज़ के लिए डाटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में लिखी गई DualViewImaging.nb फाइल पर डबल क्लिक करें।
- CIResult फ़ोल्डर (जैसे, DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]) के लिए फ़ाइल पथ सम्मिलित करें (चित्र5).
- BMP फ़ाइल (जैसे, SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/]) (चित्र5) सहित फ़ोल्डर में फ़ाइल पथ सम्मिलित करें, जिसमें XXX BMP फ़ाइलों सहित फ़ोल्डर का नाम दर्शाता है.
- स्वत: विश्लेषण प्रारंभ करने के लिए Shift और Return कुंजियों को एक साथ पुश करें. यह विश्लेषण TagRFP छवि में दृश्य के क्षेत्र के अधिकतम तीव्रता क्षेत्र के मान का उपयोग करता है (प्रोग्राम में विस्तृत गणना प्रक्रिया के लिए चित्र6 की किंवदंती देखें)।
- जाँचें कि क्या निम्न आउटपुट फ़ाइलें उचित रूप से CIResult फ़ोल्डर में बनाई गई हैं।
XXX-GCaMP.tif (सभी छवियों के लिए GCaMP तीव्रता के निशान illustrating छवि फ़ाइल)
XXX-GCaMP.xls (स्प्रेडशीट फ़ाइल लिस्टिंग GCaMP सभी छवियों में तीव्रता)
XXX-TagRFP.tif (सभी छवियों के लिए TagRFP की तीव्रता के निशान illustrating छवि फ़ाइल)
XXX-TagRFP.xls (स्प्रेडशीट फ़ाइल लिस्टिंग TagRFP सभी छवियों में तीव्रता)
XXX-अनुपात.tif (छवि फ़ाइल सभी छवियों के लिए अनुपात मान के निशान illustrating)
XXX-अनुपात.xls (स्प्रेडशीट फ़ाइल सभी छवियों में अनुपात मान सूचीबद्ध)
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Representative Results
यहां, एवीए इंटरन्यूरॉन-विशिष्ट प्रमोटर के नियंत्रण में GCaMP और TagRFP दोनों को व्यक्त करने वाले एक कीड़े का उपयोग स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने में कैल्शियम इमेजिंग के एक उदाहरण के रूप में किया जाता है। GCaMP और TagRFP चैनल डेटा छवियों की एक श्रृंखला के रूप में प्राप्त किए गए थे, जिनमें से कुछ को चित्रा 6 में और एक फिल्म (पूरक मूवी 1) के रूप में दिखाया गया है। हमारे nonlocalized कंपन प्रणाली (चित्रा 7) द्वारा प्रेरित पेट्री प्लेट के विस्थापन को भी परिमाणित किया गया था। विस्थापन कंपन नियंत्रण (चित्रा 3B) और एम्पलीफायर (चित्रा 4) में वॉल्यूम समायोजक के लिए सॉफ़्टवेयर में आयाम मान सेट करके नियंत्रित किया जा सकता है, जबकि आवृत्ति को सॉफ़्टवेयर (चित्रा 4) में आवृत्ति मान सेट करके विनियमित किया जाता है। सफल प्रयोगों में, एवीए न्यूरॉन्स की एक क्षणिक कैल्शियम प्रतिक्रिया को 630 हर्ट्ज की आवृत्ति और 1 एस के लिए लगभग 4.5 μm के विस्थापन वाले कंपन के साथ उत्तेजना पर देखा गया था, यह दर्शाता है कि एवीए न्यूरॉन को गैर-स्थानीयकृत उत्तेजना (चित्रा 6) के लिए एक कीड़े की पीछे की प्रतिक्रिया के दौरान सक्रिय किया गया था। GCaMP और TagRFP दोनों संकेतों की आधार रेखाओं से यह भी पता चला है कि रिकॉर्डिंग के दौरान लगभग कोई फोटोब्लीचिंग नहीं हुई।
चित्र1: एक योजनाबद्ध सिस्टम कॉन्फ़िगरेशन। एक एनजीएम प्लेट जिस पर एक कीड़ा स्वतंत्र रूप से चलता है, एक ध्वनिक ट्रांसड्यूसर पर आयोजित किया जाता है। उत्तेजना प्रकाश (488 एनएम और 560 एनएम) एक एलईडी प्रकाश स्रोत से उत्सर्जित होता है। GCaMP और TagRFP फ्लोरोसेंट उत्सर्जन छवि-विभाजन प्रकाशिकी द्वारा विभाजित होते हैं, जैसे कि प्रत्येक फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को एक एससीएमओएस कैमरे के आधे हिस्से पर प्रक्षेपित किया जाता है। ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर कीड़े के फ्लोरोसेंट स्पॉट को ट्रैक करने के लिए एक्स-वाई मोटरचालित चरण को नियंत्रित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: एक कीड़े के एक फ्लोरोसेंट स्थान को ट्रैक करने के लिए सॉफ़्टवेयर का स्क्रीनशॉट। (A) सॉफ़्टवेयर को सक्रिय करने के लिए रन बटन। (बी) छवि प्रदर्शन चक्र, एक्सपोजर समय (एस), और प्रत्येक चैनल में binning सेट करने के लिए बक्से। (C) छवि अधिग्रहण चक्र के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए बक्से। (डी) लाइव स्ट्रीमिंग शुरू करने के लिए अधिग्रहण बटन। (ई) जीसीएएमपी छवि। (च) टैगआरएफपी छवि। (जी) GCaMP और TagRFP छवियों के बीच अंशांकन निर्देशांक के लिए एक पैनल। (H) फ़ाइल पथ सेट करने के लिए बॉक्स. (I) वर्म ट्रैकिंग शुरू करने के लिए होमिंग बटन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: कंपन को नियंत्रित करने के लिए माउस मैक्रो सिस्टम और सॉफ्टवेयर की फोटो। (ए) मैजेंटा वर्ग माउस कर्सर के लिए निर्देशांक को इंगित करता है। प्रत्येक स्क्रिप्ट लाइन का अर्थ मैजेंटा अक्षरों में समझाया गया है। (बी) कंपन को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर का जीयूआई (ग्राफिकल यूजर इंटरफेस)। कंपन आवृत्ति और आयाम मूल्यों को इस GUI का उपयोग करके नियंत्रित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: पारदर्शी चिपकने वाला टेप का उपयोग कर ध्वनिक ट्रांसड्यूसर पर आयोजित NGM प्लेट की तस्वीर. प्लेट पर केवल एक ही कीड़ा चल रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर की फ़ोटो. Magenta और नीले रेखांकन CIResult फ़ोल्डर और BMP फ़ाइलों सहित फ़ोल्डर के लिए पथ इंगित करते हैं, क्रमशः। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: GCaMP (A), और TagRFP (B) प्रतिदीप्ति की तीव्रता के निशान, और अनुपात परिवर्तन (C,D). (A) -C) GCaMP सिग्नल, TagRFP सिग्नल और एक एकल कृमि के अनुपात परिवर्तन के लिए प्रतिनिधि निशान। DualViewImaging.nb फ़ाइल का उपयोग करके अनुपात परिवर्तन की गणना की जाती है, निम्नानुसार. वह निर्देशांक जिसमें टैगआरएफपी प्रतिदीप्ति की तीव्रता पृष्ठभूमि घटाव के बाद अधिकतम होती है, प्रत्येक छवि के लिए निकाली जाती है। यह TagRFP सिग्नल जानवर की गति के कारण फोकस परिवर्तनों की भरपाई करने के लिए कार्य करता है। निकाले गए निर्देशांक ±10 पिक्सेल के भीतर GCaMP की अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना प्रत्येक छवि के लिए GCaMP सिग्नल तीव्रता के रूप में की जाती है। रेशियोमेट्री के लिए, ((IGCaMP − IGCaMP_BG) − (ITagRFP − ITagRFP_BG)) / (ITagRFP − ITagRFP_BG) की गणना की जाती है, जिसमें IGCaMP और ITagRFP क्रमशः AVA न्यूरॉन से GCaMP और TagRFP संकेत हैं, और मैंGCaMP_BG और ITagRFP_BG क्रमशः पृष्ठभूमि संकेत हैं। यह परिकलन प्रक्रिया एक उत्क्रमण घटना में अनुपात परिवर्तन को मापने के लिए सभी छवियों पर लागू की गई थी। सभी निशानों में 5 सेकंड पर ऊर्ध्वाधर रेखा उत्तेजना अवधि को इंगित करती है। (d) औसत अनुपात 15 कीड़ों के लिए बदलता है। त्रुटि पट्टी SEM को इंगित करती है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: पैरामीटर के बीच संबंध। (ए) प्रतिस्थापन को लेजर डॉप्लर वाइब्रोमीटर का उपयोग करके हर 100 हर्ट्ज पर मापा गया था, जिसमें सॉफ्टवेयर में आयाम मूल्य और एम्पलीफायर में वॉल्यूम समायोजक मूल्य क्रमशः 0 और 10 तक तय किया गया था। अनुनाद आवृत्ति 100-200 हर्ट्ज के बीच देखी गई थी, जो ध्वनिक ट्रांसड्यूसर के विनिर्देश में वर्णित मूल्य के समान थी। (बी) आवृत्तियों और विस्थापनों को क्रमशः सॉफ्टवेयर (रेंज; 100 से 1000 हर्ट्ज) और एम्पलीफायर (रेंज: 1-10) द्वारा नियंत्रित किया गया था, और लेजर डॉप्लर वाइब्रोमीटर का उपयोग करके मापा गया था। सॉफ़्टवेयर द्वारा चयनित आयाम मान प्रत्येक आवृत्ति के लिए इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक मूवी 1: एक 630 हर्ट्ज nonlocalized कंपन के जवाब में एक स्वतंत्र रूप से व्यवहार कीड़े के एक AVA interneuron में कैल्शियम transients के लिए एक प्रतिनिधि फिल्म. रिकॉर्डिंग शुरू करने के बाद उत्तेजना 5 सेकंड पैदा हुई थी। GFP को GCaMP के लिए एक सह-इंजेक्शन मार्कर के रूप में कीड़े की आंत में भी व्यक्त किया गया था। यह GFP प्रतिदीप्ति GCaMP की संकेत तीव्रता को प्रभावित नहीं करता है। स्केल बार को पहली छवि में भी इंगित किया गया है। पहली छवि के बाद कीड़े की दिशा को शीर्ष दाईं ओर इंगित किया जाता है। विंडोज मीडिया प्लेयर AVI फ़ाइल को चलाने के लिए उपयुक्त है, लेकिन इसे कुछ मुफ्त डाउनलोड किए गए मीडिया प्लेयर, मैक में ऐसे वीएलसी मीडिया प्लेयर का उपयोग करके भी चलाया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
आम तौर पर, तंत्रिका गतिविधि के परिमाणीकरण के लिए पशु शरीर के आंदोलन पर एक जांच और / या प्रतिबंधों की शुरूआत की आवश्यकता होती है। हालांकि, मेचानोसेंसरी व्यवहार के अध्ययन के लिए, एक जांच और संयम का आक्रामक परिचय स्वयं यांत्रिक उत्तेजनाओं का गठन करता है। C. elegans इन समस्याओं को दरकिनार करने के लिए एक प्रणाली प्रदान करता है, क्योंकि इसकी विशेषताएं पारदर्शी हैं और क्योंकि इसमें एक सरल, कॉम्पैक्ट तंत्रिका सर्किट है जिसमें केवल 302 न्यूरॉन्स शामिल हैं। नैनोस्केल विस्थापन13 के गैर-स्थानीयकृत कंपन को उजागर करने की पहले से विकसित विधि के साथ इन फायदों के संयोजन, यहां नियंत्रित कंपन का जवाब देने वाले अनियंत्रित सी एलिगन्स के नॉनवेसिव कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक विधि है।
यांत्रिक उत्तेजनाओं के गुणों को कई मापदंडों द्वारा परिभाषित किया जाता है, जैसे आवृत्ति, विस्थापन और अवधि। हाल ही में, बायोट्रेमोलॉजी एक नए अनुसंधान क्षेत्र1 के रूप में उभरा है। इस तरह के अध्ययनों का मुख्य उद्देश्य जीवों द्वारा यांत्रिक कंपन के उत्पादन, फैलाव और स्वागत के अंतर्निहित तंत्र को समझना है, और व्यवहार पर उन कंपनों के प्रभाव को समझना है। मनुष्यों सहित कई जानवर, आसपास के वातावरण की निगरानी के लिए कंपन और ध्वनिक तरंगों का उपयोग करते हैं। उदाहरण के लिए, बिच्छू सब्सट्रेट-जनित कंपन14 के माध्यम से शिकार का पता लगाते हैं। इसलिए, कंपन आसपास के वातावरण के साथ संचार का एक उपकरण है। यहां वर्णित विधि का उपयोग इनपुट पैरामीटर को नियंत्रित करने और एकल-न्यूरॉन स्तर पर तंत्रिका प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए किया जा सकता है, जिससे इनपुट-आउटपुट संबंध का वर्णन करने वाले चरण आरेख का निर्माण होता है। इस तरह के चरण आरेखों के आधार पर, हम अंतर्दृष्टि प्राप्त कर सकते हैं कि कौन से पैरामीटर विशिष्ट तंत्रिका सर्किट को प्रभावित करते हैं, और किस तंत्र से जानवर यांत्रिक कंपन का सामना करते हैं।
200715 के बाद से, स्वतंत्र रूप से चलने वाले सी एलिगन्स में एकल-न्यूरॉन कैल्शियम इमेजिंग के लिए कई प्रणालियों को विकसित किया गया है। इन प्रणालियों ने मुख्य रूप से तापमान15,16, odorants 16,17, और स्पर्श उत्तेजनाओं 17 के लिए न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित कियाहै। गैर-स्थानीयकृत कंपन के बारे में, एक पेट्री प्लेट को टैप करने की विधि लंबे समय से व्यवहार प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए लागू की गई है। हालांकि, एक मोटरचालित एक्स-वाई चरण पर एक पेट्री प्लेट को टैप करने से फ्लोरोसेंट स्पॉट को दृश्य के क्षेत्र से बाहर निकलने का कारण बना, जिससे एक स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले कीड़े को ट्रैक करने में विफलता हुई। इसलिए, पीजोइलेक्ट्रिक ध्वनिक ट्रांसड्यूसर को एम्बेडेड किया गया था, जो ट्रैकिंग सिस्टम में जेड-अक्ष पर गैर-स्थानीयकृत कंपन पैदा करता है। यह विधि गैर-स्थानीयकृत कंपन के लिए न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए पुन: प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगों के प्रदर्शन की अनुमति देती है।
प्रदर्शित तरीके भी आगे methodological विस्तार की संभावना प्रदान करते हैं। चूंकि वर्तमान प्रोटोकॉल दो आयामों में केवल एक न्यूरॉन की प्रतिक्रियाओं को कैप्चर कर सकता है, इसलिए ऑटोफोकस सिस्टम को भविष्य में फोकस के नुकसान को रोकने के लिए सुसज्जित किया जाना चाहिए। दूसरी ओर, क्योंकि कई वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग विधियों को हाल ही में सी एलिगन्स18,19,20,21 का उपयोग करके विकसित किया गया है, वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग के लिए दृष्टिकोण के विस्तार को कई न्यूरॉन्स22 या यहां तक कि पूरे मस्तिष्क के noninvasive परिमाणीकरण की अनुमति देनी चाहिए 18,19,20,21 , नियंत्रणीय गुणों वाले कंपन के जवाब में। इस तरह की प्रणाली को हाल ही में स्थापित प्रणाली पर लागू किया जा सकता है ताकि सामूहिक व्यवहार के अंतर्निहित तंत्रकी जांच की जा सके। इसलिए, आगे के जैविक अनुप्रयोगों और विधि के विस्तार की संभावना हमें मेचानोसेंसरी व्यवहारों के अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र को समझने में सक्षम बनाएगी।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।
Acknowledgments
हम इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले उपभेदों को प्रदान करने के लिए Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर को धन्यवाद देते हैं। इस प्रकाशन को वैज्ञानिक अनुसंधान (बी) के लिए JSPS KAKENHI अनुदान-इन-एड द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान सं। JP18H02483), अभिनव क्षेत्रों पर "सॉफ्ट रोबोट का विज्ञान" परियोजना (अनुदान सं। JP18H05474), चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी से प्रधानमंत्री (अनुदान संख्या 19gm6110022h001), और Shimadzu नींव।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25x36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
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